PLoS ONE: Forskellige Inddragelse af Arrangøren Methylering i Ekspression af organiske kation /Carnitin Transporter 2 (OCTN2) i Cancer Cell Lines

Abstrakt

Økologisk kation /carnitin transporter 2 (OCTN2) er ansvarlig for den cellulære optagelse af antineoplastisk middel, oxaliplatin. Epigenetisk ændring er en mulig mekanisme af ændret lægemiddel-transporter udtryk i kræft, hvilket fører til ændret effekt af kemoterapeutiske stoffer. Imidlertid er de mekanismer, der styrer OCTN2 forordning ikke helt forstået. I denne undersøgelse blev de lave niveauer af OCTN2 i HepG2 og LS174T-celler forhøjet ved demethyleringsmiddel reagens, decitabin (DCA). For yderligere at afsløre den epigenetiske mekanisme nedregulering af OCTN2, fandt vi, at Region-1 inden for

OCTN2

promotor (spænder -354 til +85) var en afgørende faktor for OCTN2 udtryk i en luciferase reporter assay. Endvidere methylering-specifik PCR (MSP) og bisulfit genomisk sekventering viste, at graden af ​​individuelle methylerede bindingssteder for CpG i denne region omvendt var korreleret med niveauerne af OCTN2 i forskellige cancerceller. Anvendelse af DCA til HepG2 og LS174T celler vendt hypermethyleringen status

OCTN2

promotor og øget OCTN2 udtryk, øge cellulære optagelse af oxaliplatin. Således har vi fundet, at promotor-methylering er ansvarlig for epigenetisk nedregulering af OCTN2 i HepG2 og LS174T-celler. I betragtning af den afgørende rolle, som OCTN2 i kræft celle optagelse af kemoterapeutika, og dermed behandling effektivitet, forbehandling med en demethyleringsmiddel reagens er en mulig strategi for optimering farmakologiske mod kræft

Henvisning:. Qu Q, Qu J, Zhan M, wu LX, Zhang YW, Lou XY, et al. (2013) Forskellige Inddragelse af Arrangøren Methylering i Ekspression af organiske kation /Carnitin Transporter 2 (OCTN2) i kræftceller. PLoS ONE 8 (10): e76474. doi: 10,1371 /journal.pone.0076474

Redaktør: Suresh Yenugu, University of Hyderabad, Indien

Modtaget: 16. juli 2013; Accepteret: August 29, 2013; Udgivet: 16 oktober 2013

Copyright: © 2013 Qu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af staten Scholarship Fund fra Kina Scholarship Rådet (Billede nr 201.206.370.103), National Scientific Foundation of China (nr 81.273.595, 81.072.706) den Videnskabelige Foundation of Hunan (nr 11K073, 10JJ4020), den “863” Projekt (nr 2012AA02A518), NCET-10-0843 og forskning Innovation Foundation of Graduate Student i Hunan-provinsen, Kina (CX2011B056). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

den menneskelige

SLC22A5

gen, der koder for en 63 kDa organisk kation /carnitin transporter 2 (OCTN2), er beliggende i cytokin klynge region på kromosom 5q31 [1], [2]. OCTN2 udtrykkes i forskellige væv, herunder nyre, skeletmuskel, hjerte, colon, hjerne, lever, osv [3]. Funktionelle defekter af OCTN2 er forbundet med forskellige sygdomme, herunder primær carnitinmangel, Crohns sygdom og astma [4] – [8]. OCTN2 ikke kun transporterer carnitin, men erkender også klinisk vigtige lægemidler såsom mildronate, verapamil, pyrilamin, oxaliplatin, imatinib og cephaloridin [9] – [13]. OCTN2 er forbundet med oxaliplatin ophobning og cytotoksicitet i OCTN2-HEK293 transfekterede celler [11]. De to alleler af

OCTN2

(rs2631367 og rs2631372) kan være vigtige prædiktorer i gastrointestinale stromale tumor patienter, der fik imatinib-behandling [12]. Disse rapporter angiver, at de funktionelle defekter og /eller afvigende ekspression af OCTN2 kan påvirke disposition og efterfølgende terapeutiske effektivitet af dets substrater.

Adskillige rapporter tyder inddragelse af peroxisomproliferatoraktiveret receptor alpha (PPARa) og gamma ( PPARG) i den transkriptionelle regulering af OCTN2 i forskellige væv. Men nedregulering af OCTN2 er blevet rapporteret, i tumorer med høj ekspression af PPARa og PPARG [14] – [16]. En nylig undersøgelse viste, at de reducerede niveauer af OCTN2 i flere epitelial kræft cellelinjer kunne genoprettes ved demethyleringsmiddel reagens 5-aza-cytidin [17]. Disse resultater indebærer, at andre machineries samarbejder med transskriptionsfaktoren netværk til at modulere ekspressionen af ​​OCTN2, såsom DNA-methylering.

DNA-methylering er en vigtig epigenetisk mekanisme, der modulerer genekspression. CpG-dinukleotidet nær transkriptionelle startsteder er rigeligt i genpromotorer, og omtales som CpG-øer. Methylering af CpG-øer er forbundet med undertrykt gentransskription og unormal DNA-methylering kan føre til afvigende genekspression. I modsætning genmutation, kan DNA-methylering reversibelt ændres ved demethylering midler, såsom decitabin (5-aza-2′-deoxycytidin, DCA) og 5-aza-citidine. Disse midler inkorporeres i DNA’et og inaktivere DNA cytosin C5-methyltransferaser [18]. Således har vi den hypotese, at status forskellen methylering af

OCTN2

kan korreleres med afvigende ekspression af OCTN2 i cancerceller.

I denne undersøgelse undersøgte vi, om methylering af CpG-øer fungerer som en mulig mekanisme er ansvarlig for nedregulering af OCTN2 i cancercellelinier. Ved at bruge methylering-specifik PCR (MSP), bisulfit genomisk sekventering, og

in vitro

methylering analyser, har vi dokumenteret, at promotor DNA methylering er en vigtig mekanisme undertrykke OCTN2 udtryk i kræftceller. Anvendelse af en demethylere reagens, som moduleret status methylering af

OCTN2

promotor, forøget ekspression af OCTN2 og gjort kræftceller mere følsomme over for oxaliplatin.

Materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

Decitabin, natriumbisulfat, hydroquinon og oxaliplatin blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). TRIzol-reagens og Lipofectamine 2000, blev opnået fra Invitrogen (Carlsbad, CA).

Celledyrkning og behandling med DCA

hepatom HepG2, coloncancercellelinie LS174T, gliom-cellelinje U251, galdegang cancercellelinie QBC-939 og afrikansk grøn abe nyre cellelinje COS-7 blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Cellelinjer blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO

2, bortset fra QBC-939 cellelinje, som var dyrket i RPMI 1640. Celler blev behandlet med DCA i en slutkoncentration på 0,5 uM eller 1 uM og fornyes hver 24 timer i en uge.

RNA oprensning, cDNA-syntese og kvantitativ real-time PCR

Totalt cellulært RNA blev isoleret fra de behandlede celler ved anvendelse af TRIzol-reagens. cDNA blev syntetiseret fra 1 pg totalt RNA ved anvendelse af første cDNA-syntese kit (Takara, Dalian). Kvantitativ RT-PCR blev udført under anvendelse SYBR Green (Bio-Rad), og primerne er anført i tabel S1. RT-PCR blev udført over 40 cyklusser ved 95 ° C i 30 s, ved 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s efterfulgt af en endelig ekstension ved 72 ° C i 2 min. Den relative mRNA-ekspression blev normaliseret til husholdning gen

β-actin

og analysen blev udført ved hjælp af 2

-ΔΔCt metode [19].

Western Blotting

totalt cellulært proteiner blev ekstraheret, og koncentrationerne blev kvantificeret ved BCA-proteinassay (Thermo Scientific, Rockford, IL). Proteiner blev underkastet SDS-polyacrylamid gelelektroforese på 10% polyacrylamidgeler og overført til PVDF-membran. Membranen blev probet med enten et anti-kanin OCTN2 antistof (1:400, ABCAM Labs, Cambridge, MA) eller β-actin-antistof (1:1000, ABCAM Labs). Efterfølgende blev membranerne inkuberet med DyLight 800-mærket kanin-polyklonalt antistof (1:7500, KPL Inc., Gaithersburg, MD), beskyttet mod lys. De farvede membraner blev scannet af Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences). Forholdene mellem OCTN2 mod β-actin blev beregnet.

Cell Levedygtighed Assay

cancercellelinier blev behandlet med 1 pM DCA eller 0,1% DMSO i en uge. Efterfølgende blev celler udsået i plader med 96 brønde i en densitet på 2 x 10

4 /brønd, og udsættes for oxaliplatin i forskellige koncentrationer (0, 0,3, 1, 3, 10, 33, 100 eller 330 uM) til 48 timer. Cellelevedygtighed blev målt ved MTS-assayet (Promega, Madison, WI) og IC

50 værdier blev beregnet ved anvendelse SPSS 13.0 version.

methyleringsspecifik PCR (MSP) og bisulfit Sequencing PCR (BSP)

for at forudsige regioner rige på CpG-dinukleotider tæt på

OCTN2

transkriptionelle starte site, brugte vi Methyl-Primer software (https://www.urogene.org/methprimer/) i henhold til følgende kriterier: længden af ​​CpG ø 100 bp, observeret /forventet CpG forholdet 0,6 og procentdelen af ​​G plus C 50%. Vi søgte

OCTN2

genomisk sekvens inklusive 1,5 kb opstrøms og 2 kb nedstrøms for transskriptionsstartstedet (TSS). Ifølge de forudsagte CpG-øer, blev MSP og BSP primere konstrueret og er anført i tabel S1. Genomisk DNA af cancercellelinier blev isoleret og DNA bisulfit modifikation blev udført som beskrevet [20]. Bisulfit modificerede DNA blev udvundet ved Wizard DNA Clean Up System (Promega) og behandlet med 5,5 pi NaOH udfældet derpå med ethanol. Præcipiteret DNA blev resuspenderet i vand, og derefter amplificeret med MSP eller BSP primere. PCR tilstand var som følger: 94 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 94 ° C i 30 s, annealing temperatur (tabel S1) i 30 s, 72 ° C i 60 s, og endelig 72 ° C i 5 min. De amplificerede DNA-fragmenter blev kørt på 2% agarosegeler og farvet med ethidiumbromid. BSP produkter blev oprenset ved en DNA oprensningskit (Takara, Dalian) og indsat i pGEM-T-easy-vektor (Promega). Fem kloner for hver cellelinje blev tilfældigt udvalgt og sekventeret. Den methylerede sekvens af

OCTN2

blev kontrolleret for tilpasning ved hjælp MethBLAST.

Plasmid Byggeri og

in vitro

Methylering Assay

Ifølge de forudsagte CpG øer i den genomiske sekvens, vi inddelt promotoren i tre regioner. Tre regioner, der indeholder forskellige CpG-øer blev amplificeret (Primere listet i tabel S2) og indsat i pGL4.17 vektoren (Promega). Disse rekombinanter, pGL4.17-regionen1, Region2 og Region3 blev verificeret ved automatiseret sekventering. Den respektive plasmid blev lineariseret ved

Xho

I og underkastedes

in vitro

methylering assay som beskrevet i vores tidligere arbejde [21]. De methylering blev derefter fordøjet af

Kpnl

I og indsat i pGL4.17 vektoren. Disse nye rekombinanter indeholdende methylerede promotorområder blev navngivet pGL4.17-mRegion 1, pGL4.17-mRegion 2 og pGL4.17-mRegion 3 hhv.

Transient transfektion og Luciferase Rapport Assay

COS-7-celler blev podet i 24-brønds plader ved en densitet på 10

5 /brønd i 500 pi DMEM og 10% FBS. Efter 8 timer blev cellerne transficeret med konstruerede luciferase vektorer (0,2 ug /brønd) under anvendelse af Lipofectamine 2000. pGL4.17 vektor mangler en promotor tjente som den negative kontrol. styrevektor indre pRL-TK (0,02 ug /brønd) blev anvendt til at normalisere luciferaseaktivitet. Efter 8 timer blev hver brønd af transficerede celler vasket to gange derefter 100 pi reporter lysepuffer blev tilsat for at lysere cellerne. Hver gruppe havde tredobbelte brønde og blev gentaget mere end tre gange. Dual luciferase aktivitet (relative lysenheder, RLU) blev bestemt ved et luminometer.

Statistisk analyse

Alle data blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse. Statistiske analyser blev udført med en envejs ANOVA for signifikans efterfulgt af en post-hoc test med SPSS 13.0 software. Data sammenligninger med en

s

værdi på mindre end 0,05 (

p

0,05). Blev anset for signifikant forskellig

Resultater

OCTN2 mRNA og protein niveauer i forskellige cancercellelinier

Totalt cellulært RNA og protein blev ekstraheret fra cancercellelinjer og OCTN2 ekspression blev målt ved kvantitativ RT-PCR og Western blotting hhv. Den højeste ekspression af OCTN2 var i QBC-939, efterfulgt af U251, LS174T og HepG2-celler (fig. 1). De udtryk for OCTN2 i QBC-939 og U251 celler var signifikant højere end i U251, LS174T celler (

s

0,05).

(A), analyse af mRNA-niveauer af OCTN2 i cancercellelinier. Totalt RNA i cancerceller blev oprenset ved TRIzol reagens til cDNA-syntese og mRNA-niveauer af OCTN2 blev analyseret ved kvantitativ RT-PCR. (B), analyse af proteinniveauer af OCTN2 i cancerceller. Totale proteiner blev ekstraheret og proteinniveauer af OCTN2 blev analyseret ved western blotting. Den relative ekspression af mRNA og protein blev normaliseret for p-actin. Ekspressionen af ​​HepG2 blev fastsat som 1. Samtlige mRNA og protein-analyse blev udført tre gange. Signifikant forskel fra HepG2 eller LS174T celle betegnes med stjerne (*,

s

0,05) eller nummerskilt (#,

s

0,05), henholdsvis

effekter af DCA på ekspressionen af ​​OCTN2 i kræftcellelinjer

for at undersøge, om de afvigende udtryk for OCTN2 i forskellige cancer cellelinjer skyldtes promotor methylering, vi behandlede cancer cellelinjer med DCA og bestemmes den restaurerede udtryk for OCTN2. I fig. 2, DCA bemærkelsesværdigt opreguleret relative OCTN2 mRNA og proteinekspression i HepG2-celler med 0,5 uM (1,38-fold, 1,61-fold) og 1 pM behandling (1,52-fold, 2,07-fold) (

s

0,05) sammenlignet med kontrolgruppen. Tilsvarende behandling af DCA føre til en forøgelse af OCTN2 niveauer i LS174T-celler. Desværre fik DCA ikke ændre ekspressionen af ​​OCTN2 i QBC-939 og U251-celler, som allerede havde høje OCTN2 ekspressionsniveauer.

(A), analyse af mRNA-niveauer af OCTN2 i DCA-behandlede cancercellelinier. Efter behandling med 0,5 og 1 uM DCA, blev totalt RNA i cancerceller oprenset ved TRIzol reagens til cDNA-syntese og mRNA-niveauer af OCTN2 blev analyseret ved kvantitativ RT-PCR. (B), analyse af proteinniveauer af OCTN2 i DCA-behandlede cancercellelinier. Totale proteiner blev ekstraheret og proteinniveauer af OCTN2 blev analyseret ved western blotting. Den relative ekspression af mRNA og protein blev normaliseret for p-actin. Data præsenteret repræsenterer middelværdien ± S.D. af tre uafhængige forsøg. Signifikant forskel fra kontrolgruppen på 0,1% DMSO betegnes med stjerner (*,

s

0,05, **,

s

0,01).

OCTN2 genomsekvensen Havne Tre CpG Islands of

Vi søgte

OCTN2

genomisk sekvens for placering af CpG-dinukleotider hjælp methyl-primer software. CpG-dinukleotider blev fundet udstrakt beliggende nær TSS (fig. 3A). Ifølge placering intensiteten af ​​CpG-dinukleotider, vi observeret tre formodede CpG øer beliggende i

OCTN2

genomisk sekvens. CpG island-2 er placeret tæt på UTR og exon 1, er CpG ø-3 placeret i intron 1, og CpG ø-1 er placeret opstrøms for TSS (fig. 3A).

(A), beregningsmæssige analyse viste tre formodede CpG øer i OCTN2 genomiske sekvens af methyl-primer software som beskrevet i

Materiale og metoder

. (B), MSP-analyse for CpG-øer i OCTN2 i 1 uM DCA behandlede og ikke-behandlede cancercellelinier. MSP blev udført med de specifikke primere at amplificere mål-CpG-øer fraktioner og kørt på en 2% agarosegel. Alle MSP og BSP-analyse blev gentaget tre gange. U: methyleret sekvens; M:. Methylerede sekvens

Methylering Status for CpG Islands inden OCTN2 af MSP

For yderligere at belyse status methylering af CpG øer inden

OCTN2

i forskellige kræftcelle linjer, vi analyserede tre CpG øer af MSP, der adskiller methylerede DNA fra un-denatureret DNA. I fig. 3B, CpG ø-1 (CpG1) var helt methyleret i HepG2-celler, delvist denatureret i LS174T og U251 celler, og un-methylerede i QBC-939 celler. Delvist methylerede produkter CpG ø-2 (CPG2) blev fundet i LS174T og QBC-939 celler, men disse var un-methylerede i HepG2 og U251 celler. I næsten alle cellelinjer, CpG ø-3 havde mere methylerede produkter end umethyleret. I fig. 3C, efter behandling med DCA, un-methylerede produkter CpG1 blev forhøjet i HepG2, LS174T og U251 celler. Dette resultat indikerer, at DCA kan forårsage de-methylering inden CpG1. Et lignende resultat blev observeret inden for CPG2. DCA behandling øget un-methylerede produkter CpG3 i HepG2-celler, men forårsagede ikke signifikante ændringer i andre celler.

Effekt af Methylated og Un-methylerede Promoter Regionsudvalget om Transskription Aktivitet af OCTN2 ved hjælp af en

in vitro

Luciferase Reporter Assay

for at afgøre, hvilke methylerede CpG øer spiller væsentlige roller i nedregulering af OCTN2, vi konstrueret luciferase reporter plasmider bærer enten un-methylerede eller methylerede regioner (fig. 4). Konstruerede plasmider blev transficeret ind i COS-7-celler og anvendes til at vurdere transkriptionsaktivitet. I sammenligning med pGL4.17 (Control), der vises, pGL4.17-regionen1 markant forøget luciferaseaktivitet af 102,5 gange (

s

0,01), mens luciferaseaktivitet fra pGL4.17-Region2 og Region3 kun var steg 11,4 gange og 3,5 gange (

s

0,05). Dette resultat indikerer, at regionen1 spænder -354 til 85 bp spiller en væsentlig rolle i promotor-aktivitet. Interessant, kun luciferaseaktiviteten af ​​un-methylerede Region-1 var højere end sin methylerede vektor (29,7 gange,

s

0,01). Un-methylerede Regioner-2 og -3 viste ikke signifikante forskelle i luciferaseaktivitet sammenlignet med deres tilsvarende denatureret regioner. Det er muligt, at methylering status for Region-2 og -3 indeholder CpG ø-2 og -3, henholdsvis er irrelevante for

OCTN2

udtryk. Således er disse resultater viser, at øget methylering kan inhibere promotoraktivitet af Region-1.

Konstrueret pGL4.17 luciferase vektor indeholdende methyleret og methyleret promotorområder blev transficeret i COS-7-celler med PRL-TK kontrolvektoren. Otteogfyrre timer senere blev cellerne vasket og analyseret for luciferaseaktivitet. Relativ luciferaseaktivitet blev målt i tredobbelte brønde. Data præsenteret repræsenterer middelværdien ± S.D. af tre uafhængige forsøg. Signifikant forskel fra behandling gruppen af ​​pGL4.17 betegnes med stjerner (*,

s

0,05, **,

s

0,01). Signifikant forskel fra gruppen af ​​methyleret region i samme region betegnes med en havelåge (#,

s

0,05).

Bestemmelse af DNA-methylering Profiler af OCTN2 af BSP

for at kunne bedømme methylering profil CpG steder i Region-1, bisulfit genomisk sekventering i forskellige cancer cellelinjer blev udført. I fig. 5A, blev den genomiske sekvens af OCTN2 promotor vises og CpG steder blev markeret. Et methyleret sekvens af

OCTN2

spænder -325 til -92 bp i HepG2-celler blev kontrolleret for tilpasning ved hjælp MethBLAST og præsenteres i fig. 5B. Andre methylerede sekvenser fra LS174T, QBC-939 og U251-celler er vist i fig S1, S2 og S3. I fig. 5C viste methylering profiler, satserne for methylerede CpG sites (mCpG /total CpG antal) var 72,2% og 60,0% i HepG2 og LS174T celler, henholdsvis, hvilket er langt højere end methylering satser målt i QBC-939 (20,0%) og U251 (11,1%) celler. Desuden efter 1 pM DCA behandling i HepG2, satserne for methylerede CpG sites faldt til 13,3% (fig. 6). Da de hypermethyleret CpG steder i OCTN2 er reddet af DCA behandling i HepG2 og LS174T celler, disse resultater giver direkte bevis for, at de enkelte methylerede CpG steder i promoteren præcist kan regulere ekspressionen af ​​OCTN2.

(A), den genomisk sekvens spænder -325 til -92 bp promotor Region-1 af

OCTN2

. Atten CpG steder blev placeret og markeret. (B), bisulfit genomisk sekventering analyse af Region-1 af

OCTN2

i HepG2-celler. Bisulfit modificerede DNA blev forstærket af BSP som beskrevet under

Materialer og metoder

og derefter sekventeret. Takkede stjerne repræsenterer methylerede CpG sites. (C), DNA methylering profiler af enkelte methylerede CpG-dinukleotider i fire cancercellelinier. Efter BSP blev fem kloner tilfældigt udvalgt og sekventeret. De methylerede sekvenser blev kontrolleret for tilpasning ved hjælp MethBLAST. De åbne og lukkede cirkler repræsenterer umethylerede eller methylerede cytosiner henholdsvis.

(A), bisulfit genomisk sekventering analyse af DCA-behandlede HepG2-celler. Efter behandling af DCA blev DNA ekstraheret og underkastet bisulfit modifikation. Bisulfit modificerede DNA blev forstærket af BSP som beskrevet under

Materialer og metoder

og derefter sekventeret. Takkede stjerne repræsenterer methylerede CpG sites. (B), DNA methylering profiler af enkelte methylerede CpG-dinukleotider i DCA-behandlede HepG2-celler. Efter BSP blev fem kloner tilfældigt udvalgt og sekventeret. De methylerede sekvenser blev kontrolleret for tilpasning ved hjælp MethBLAST. De åbne og lukkede cirkler repræsenterer umethylerede eller methylerede cytosiner henholdsvis.

Effekter af DCA på Enhancing følsomhed af kræftceller til Oxaliplatin

For yderligere at forstå, hvis methylering status

OCTN2

gen påvirker følsomheden af ​​cancerceller til oxaliplatin, cancerceller blev forbehandlet med DCA efterfulgt af udsættelse for oxaliplatin. Cellelevedygtighed blev vurderet og IC

50 værdier blev beregnet. I fig 7. A, når celler blev udsat for oxaliplatin ved 3, 10, 33 og 100 uM blev cellelevedygtighed af DCA-behandlede HepG2 og LS174T faldt sammenlignet med DMSO-behandlede celler (

s Restaurant 0,05 ), men ændrede ikke i U251 og QBC-939 celler. I fig. 7B, IC

50 værdier for DCA-behandlede HepG2 og LS174T-celler blev reduceret til 51,6% og 44,8% (

s Restaurant 0,05), sammenlignet med DMSO-behandlede celler, men var uændrede i QBC-939 og U251-celler. Derfor er det muligt, at DCA sensibiliserer HepG2 og LS174T celler til oxaliplatin ved at øge OCTN2 udtryk og forbedre optagelsen af ​​oxaliplatin.

Kræftceller var forbehandlet med en uM DCA 1 uge, podet i 96 brønde plader ved 1 x 10

4 celler /brønd i 100 pi DMEM og 10% FBS. Efter 8 timer blev cellerne eksponeret for oxaliplatin i forskellige koncentrationer (0,1, 0,3, 1,0, 3,3, 10, 33, 100 eller 330 uM) i 48 timer i frisk dyrkningsmedium. Cellelevedygtighed blev bestemt ved en MTS celle prolifererende assaykit. Hver koncentration blev bestemt i tre brønde. Data præsenteret repræsenterer middelværdien ± S.D. af tre uafhængige forsøg. (A), blev cellelevedygtigheden ved hver koncentration vises. Betydelige forskelle fra DMSO behandling er markeret med en stjerne (*,

s

0,05). (B), blev IC

50 værdier beregnet af SPSS 13.0 software. Data præsenteret repræsenterer middelværdien ± S.D. af tre uafhængige forsøg. Signifikante forskelle fra ikke-behandlede celler er markeret med en stjerne (*,

s

0,05).

Diskussion

I denne undersøgelse fandt vi, at hypermethylering inden for

OCTN2

promotor er ansvarlig for nedregulering af

OCTN2

i HepG2 og LS174T celler. Vi påvises præcist graden af ​​methylering af individuelle methylerede bindingssteder for CpG i promotorregionen af ​​MSP og BSP, der omvendt var korreleret med ekspressionen af ​​OCTN2 i forskellige cancerceller. Desuden DCA forbehandling af HepG2 og LS174T celler øget oxaliplatin-induceret celledød via OCTN2 demethylering.

Den væsentlige rolle DNA methylering har tiltrukket stor interesse som en mulig mekanisme ligger til grund for afvigende ekspression af onkogener, tumor suppressor gener og DNA reparation gener i carcinomceller. De seneste resultater viser en rolle for DNA methylering i regulering af ekspressionen af ​​transportører, såsom SLC22A1, A2, A3 (OCT1, OCT2, OCT3), SLC22A18, SLC5A8, Ntcp, Oatp1b2, BSEP, ABCG2, ABCG5 /G8 [22] – [ ,,,0],27]. For at forstå den mekanisme, hvorved OCTN2 ekspression undertrykkes i HepG2 og LS174T-celler behandlede vi disse cellelinjer med demethyleringsmiddel reagens DCA og observeret en stigning i OCTN2 mRNA og protein niveauer i HepG2 og LS174T-celler, mens ingen ændring fandt sted i QBC-939 og U251-celler. En nylig undersøgelse viste også, at lave niveauer af OCTN2 blev øget med DCA i menneskelig papillomavirus16 E6- og E7- udtrykker keratinocytter [17]. DCA hæmmer DNA methyltransferase enzymer (DNMTs) og yderligere korrumperer integritet methylering aftryk, hvilket fører til forstyrrelser af epigenetiske signaturer og regulering af genekspression [28]. Således disse resultater tyder på, at nedregulering af OCTN2 i HepG2 og LS174T celler kan skyldes afvigende promotor methylering.

Analyse af de tre formodede CpG øer i

OCTN2

, vi observeret, at CpG øer vises forskellige methylering statusser i forskellige kræftceller, og at hypermethylering kunne reduceres med DCA. Derfor søgte vi at identificere, hvilke CpG ø spiller en central rolle i reguleringen af ​​OCTN2 udtryk. I luciferase reporter assay, kun promotorregionen-1 spanning -354 til +85 bp viste øget promotoraktivitet. Endvidere methylering af Region-1, som efterligner methyleringsmønstre i celler, inhiberede fuldstændigt promotoraktiviteten. Dette resultat giver bevis for, at Region-1 er en mulig faktor for OCTN2 ekspression, fordi hypermethylering af Region-1 inhiberede transkriptionsaktivitet OCTN2 i LS174T og HepG2-celler.

bisulfit genomisk sekventering påvises præcist de individuelle methylerede bindingssteder for CpG inden promotorregion-1, som var væsentligt hypermethyleret i HepG2 og LS174T sammenlignet med QBC-939 og U251-celler. Graden af ​​DNA-methylering blev omvendt korreleret med ekspressionen af ​​OCTN2 i disse cancerceller. Disse resultater kan med rimelighed forklare de lavere niveauer af OCTN2 i HepG2 og LS174T celler, sammenlignet med udtrykket i QBC-939 og U251 celler. Desuden DCA vendt methylering af CpG steder i Region-1 i HepG2-celler i overensstemmelse med stigningen i OCTN2 udtryk.

Methyleret CpG dinukleotider inden promoter Region-1 inhibere ekspressionen af ​​

OCTN2

sandsynligvis gennem to mekanismer. For det første kan mange transskription faktor bindinger blive blokeret af methylerede CpG-dinukleotider inden for

OCTN2

promotor. Vi analyserede promotor Region-1 af

OCTN2

ved TFSEARCH software (https://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html), og fandt, at konsensus bindingssteder for transkriptionsfaktor specificitet protein 1 (SP1) og myeloid zink finger 1 (MZF-1) overlappede nogle centrale CpG sites (fig S4). Yderligere arbejde er i gang for at undersøge, om methylering af specifikke CpG sites blokerer disse transkriptionsfaktorer. En anden mulig mekanisme er den afvigende regulering af DNA methyltransferase enzymer og methylering-afhængig rekruttering af nukleoprotein faktorer såsom methyl-CpG bindende protein MeCP1 og MeCP2 [29] – [31]. Vi vil undersøge, hvordan de hypermethyleret CpG steder af OCTN2 rekruttere disse methylering-relaterede proteiner og undertrykke udtryk for OCTN2.

I betragtning af den væsentlige rolle OCTN2 i kræftcellen optagelse og dermed behandling effekten af ​​oxaliplatin, methylering af

OCTN2

kan anvendes som et mål for forøgelse terapeutisk effektivitet. Efter behandling med 1 uM DCA, HepG2 og LS174T-celler blev mere følsom over for oxaliplatin, men ikke QBC-939 og U251-celler. Desuden er der i DCA behandlede celler, den forøgede ekspression af OCTN2 tillægges større oxaliplatin optagelse og mere cytotoksicitet end ikke-DCA behandlede celler. Selvom DCA i høje koncentrationer forårsager global genomisk ustabilitet og cytotoksicitet, DCA i lave koncentrationer virker hovedsageligt at inhibere DNMT snarere end at inducere celledød [32]. Således DCA blev administreret samtidigt med oxaliplatin, og den deraf restaurering af OCTN2 udtryk forbedret optagelsen og effekten af ​​oxaliplatin.

Konklusion

Som konklusion, afslørede vi den epigenetiske mekanisme i nedreguleringen af

OCTN2

i forskellige kræftceller. Promotor region spænder -354 til 85 var en afgørende faktor for OCTN2 udtryk. Graden af ​​methylerede CpG sites inden for regionen blev omvendt korreleret med niveauerne af OCTN2 i cancerceller. Anvendelse af demethyleringsmiddel, DCA, vendt hypermethyleringen status

OCTN2

promotor og øget OCTN2 udtryk, hvilket fører til øget optagelse af oxaliplatin-forårsager cancerceller til at være mere følsomme over for oxaliplatin. I betragtning af den afgørende rolle, som OCTN2 i kræftcellen optagelse og dermed behandlingseffekt af flere kemoterapeutika, forbehandling af en demethylere reagens er en mulig strategi til optimering af farmakoterapi mod kræft.

Støtte Information

Figur S1.

Methylering profiler omkring transskriptionsstartstedet af

OCTN2

i LS174T celler. DNA blev ekstraheret og underkastet bisulfit modifikation. Bisulfit modificerede DNA blev forstærket af BSP og sekventeret som beskrevet under

Materialer og metoder

. Takkede stjerne repræsenterer methylerede CpG sites

doi:. 10,1371 /journal.pone.0076474.s001

(TIF)

Figur S2.

Methylering profiler omkring transskriptionsstartstedet af

OCTN2

i QBC-939 celler. DNA blev ekstraheret og underkastet bisulfit modifikation. Bisulfit modificerede DNA blev forstærket af BSP og sekventeret som beskrevet under

Materialer og metoder

. Takkede stjerne repræsenterer methylerede CpG sites

doi:. 10,1371 /journal.pone.0076474.s002

(TIF)

Figur S3.

Methylering profiler omkring transskriptionsstartstedet af

OCTN2

i U251 celler. DNA blev ekstraheret og underkastet bisulfit modifikation. Bisulfit modificerede DNA blev forstærket af BSP og sekventeret som beskrevet under

Materialer og metoder

. Takkede stjerne repræsenterer methylerede CpG sites

doi:. 10,1371 /journal.pone.0076474.s003

(TIF)

Figur S4.

transkriptionsfaktor bindingssted analyse af promotorregionen af ​​

OCTN2

efter TFsearch software. For at afsløre den mekanisme, hvor methylerede CpG sites hæmmer

OCTN2

transskription, vi kortlagt de formodede konsensussekvenser for transkriptionsfaktorer. CpG sites er på de røde linjer. Formodede konsensus sekvenser er angivet med stiplede linjer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0076474.s004

(TIF)

tabel S1.

Primere Kvantitative RT-PCR, MSP og BSP

doi:. 10,1371 /journal.pone.0076474.s005

(PDF)

tabel S2.

Primere til opførelse af luciferase reporter vektorer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0076474.s006

(PDF)

Tak

Vi er taknemmelige for Dr. . Jie Liu og Dr. Helen Renaud, som forudsat sproghjælp.