PLoS ONE: NUDT2 Forstyrrelse hæver Diadenosine tetraphosphate (Ap4A) og nedregulerer immunrespons og kræft Promotion Gener

Abstrakte

Regulering af genekspression er en af ​​flere roller foreslået for stress-induceret nukleotid diadenosine tetraphosphat (Ap

4A). Vi har undersøgt dette direkte af en sammenlignende RNA-Seq analyse af KBM-7 kronisk myeloid leukæmi celler og KBM-7 celler, hvor

NUDT2

Ap

4A hydrolase genet var blevet afbrudt (NuKO celler), forårsager en 175-dobling i intracellulær Ap

4A. 6.288 differentielt udtrykte gener blev identificeret med

P

0,05. Af disse 980 var opreguleret og 705 nedreguleret i NuKO celler med en fold-ændring ≥ 2. Opfindsomhed

® Pathway Analysis (IPA

®) blev anvendt til at tildele disse gener til kendte kanoniske veje og funktionelle netværk. Veje forbundet med interferon respons, mønster anerkendelse receptorer og betændelse scorede højt i nedreguleret sæt af gener, mens funktioner i forbindelse med MHC klasse II-antigener var fremtrædende blandt de up-regulerede gener, der ellers viste lidt organisation i store funktionelle gen sæt. Tryptophan katabolisme blev også stærkt nedreguleret som var talrige gener vides at være involveret i tumor fremme i andre systemer, med roller i epitel-mesenkymale overgang, spredning, invasion og metastase. Omvendt har nogle pro-apoptotiske gener blev opreguleret. Større opstrøms faktorer forudsagt af IPA

® til gen nedregulering inkluderet NFKB, STAT1 /2, IRF3 /4 og SP1 men ingen større faktorer, der kontrollerer gen opregulering blev identificeret. Potentielle mekanismer for genregulering medieret af Ap

4A og /eller

NUDT2

forstyrrelser omfatter binding af Ap

4A til HINT1 co-repressor, autokrine aktivering af purinoceptorer af Ap

4A, kromatin remodeling, virkninger af NUDT2 tab på transkript stabilitet, og inhibering af ATP-afhængige regulatoriske faktorer såsom proteinkinaser af AP

4A. Eksisterende beviser favoriserer den sidste af disse som den mest sandsynlige mekanisme. Uanset, vores resultater antyder, at NUDT2 proteinet kunne være et hidtil ukendt cancer kemoterapeutisk mål, med dets inhibering potentielt udøve stærke antitumorvirkninger via flere enzymsystemer, der involverer metastase, invasion, immunsuppression og apoptosis

Henvisning:. Marriott AS, Vasieva O, Fang Y, Copeland NA, McLennan AG, Jones NJ (2016)

NUDT2

Forstyrrelse hæver Diadenosine tetraphosphat (Ap

4A) og nedregulerer immunrespons og kræft Promotion Genes. PLoS ONE 11 (5): e0154674. doi: 10,1371 /journal.pone.0154674

Redaktør: Francisco J. Esteban, University of Jaen, Spanien

Modtaget: 9. december 2015; Accepteret: April 18, 2016; Udgivet: Maj 4, 2016

Copyright: © 2016 Marriott et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante analyserede data er inden for papir og dens Støtte Information filer. Desuden er alle datafiler er tilgængelige fra ArrayExpress databasen (tiltrædelse nummer E-mtab-4104)

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af North West Cancer Research (https://www.nwcr.org) tildele numre CR968 til AGM, NJJ og NAC; CR891 til NAC; og NWCR forskning fællesskab nummer BR879 til NAC (www.nwcr.org). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Nudix hydrolaser regulere niveauerne af en lang række kanoniske og modificerede nukleotider og nogle ikke-nucleotid phosphorylerede substrater samt deltage i vigtige processer såsom mRNA decapping [1, 2]. En af de bedst undersøgte er pattedyr NUDT2. Dette enzym er blevet isoleret fra mange kilder [3, 4] og dets vigtigste substrat menes at være diadenosine 5 ‘, 5’ ” –

P

1,

P

4-tetraphosphate (Ap

4A). I dyreceller, Ap

4A kan syntetiseres ved de fleste aminoacyl-tRNA-syntetaser, DNA-ligaser, ildflueluciferase og acyl-CoA-synthetaser mens en række andre enzymer er i stand til at gøre dette i planter, svampe og bakterier [5-7 ]. Syntese regel medfører overførsel af AMP fra en acyl-AMP eller enzym-AMP reaktionsmellemprodukt til en ATP acceptor. Det kan også nedbrydes af en række enzymer foruden NUDT2, herunder FHIT [8], aprataxin [9] og ikke-specifikke phosphodiesteraser [3]. Dog er NUDT2 menes at være hovedansvarlig for at opretholde det lave niveau af intracellulær Ap

4A [10-12].

En stigning i Ap

4A som følge af aktivering af syntese, hæmning af nedbrydning eller begge har været impliceret i adskillige intracellulære processer. Genotoksiske, termiske og andre belastninger fører til øget Ap

4A [13-17], og så Ap

4A har været impliceret i reguleringen af ​​DNA-replikation efter DNA-skader og fremme apoptose [17-19]. Ap

4A kan også rejses som reaktion på eksterne ligander og fungere som en intracellulær anden budbringer [20-22]. Det fungerer også som en ekstracellulær messenger gennem dets interaktion med en række P2-receptorer [23]. Ap

4A er også en ligand for en række proteiner, herunder en multiproteinkompleks indeholdende DNA-polymerase-α [24, 25], proteinkinaser [26-28], uracil-DNA-glycosylase [29], protein chaperoner [30] den HINT1 tumor suppressor [31], 5′-nukleotidase II [32], CBS domæne proteiner [33, 34] og CFIm25 [35], men i de fleste tilfælde betydningen af ​​denne binding er ikke klart. Af særlig interesse er imidlertid den mulighed, at Ap

4A kan virke som en transkriptionel regulator. Det er blevet foreslået, at et forøget niveau af Ap

4A induceret i mastceller af eksterne faktorer aktiverer ekspressionen af ​​en undergruppe af gener styres af MITF og USF2 transkriptionsfaktorer ved at binde til og at erstatte den inhiberende HINT1 protein fra disse faktorer [ ,,,0],10, 31, 36].

for at afgøre, om transkriptionel regulering af Ap

4A er begrænset til relativt få gener eller er mere udbredt, har vi analyseret transkriptomet af en knockout derivat af KBM- 7 kronisk myeloid leukæmi (CML) cellelinie [37], hvori det intracellulære niveau af Ap

4A er øget 175 gange ved afbrydelse af

NUDT2

gen (KBM-7-NuKO, nævnt herefter som NuKO). Disse celler viser dybtgående ændringer i genekspression sammenlignet med forælder KBM-7-cellelinje med i alt 6288 signifikant differentielt udtrykte gener (DEGS) identificeret. Opfindsomhed

® Pathway Analyse blev brugt til at fremhæve de gen netværk og metaboliske og signalveje berørte, afslører nedregulering af interferon, inflammatoriske og medfødte immunrespons og opregulering af processer, der involverer MHC klasse II-antigener. Desuden er mange af de mest stærkt påvirket gener har roller i at fremme kræft metastaser og invasion, hvilket tyder på, at NUDT2 kan tilbyde en roman, pleiotrop mål for cancer kemoterapi.

Materialer og metoder

Celler

KBM-7 henvisning klon B (produkt nr. P00174E07) og KBM-7-NuKO derivat (P01289H04), hvori

NUDT2

gen er blevet inaktiveret ved retroviral gen-trap indsættelse [ ,,,0],38] blev opnået fra Haplogen og holdt ved 37 ° C i 5% (v /v) CO

2 /luft i Isocoves modificerede Eagle-medium (IMEM, Sigma) suppleret med 10% (v /v) Føtal bovinserum ( Sigma), 2 mM L-glutamin (Sigma) og 100 ug ml

-1 penicillin-streptomycin (Sigma).

Måling af Ap

4A og derivater

niveauet af intracellulær Ap

4A i log fase KBM-7 og NuKO celler blev bestemt som tidligere beskrevet ved hjælp af en følsom luminometrisk assay med mindre ændringer til brug med suspension celler [17, 39]. Celler blev høstet fra suspensionen ved centrifugering ved 500

g

i 5 minutter og anvendes til nukleotid ekstraktion. Ap

4A blev også målt i vækstmediet supernatanten fra disse celler, der blev filtreret gennem et 0,2 um Millipore-filter, deproteiniseret med 10% TCA, og derefter analyseres som ovenfor. ADP-ribosyleret derivater af Ap

4A (ADPR-Ap

4A) blev adskilt ved ionbytningskromatografi og identificeret og analyseret som beskrevet tidligere [17].

væksthæmning analyser

Celler (2 x 10

5) blev podet i 25 cm

2 kolber indeholdende 7 ml vækstmedium. Kemiske midler blev tilsat som anført, og celler dyrkes i 96 timer ved 37 ° C, hvorefter kulturer blev centrifugeret ved 500

g

i 5 minutter, cellerne blev resuspenderet i frisk medium og talt under anvendelse af et hæmocytometer. Gennemsnitlige tællinger blev normaliseret til cellen optælling af den ubehandlede kultur

RNA-Seq analyse:. CDNA bibliotek forberedelse og sekventering

Tre uafhængige prøver af total RNA blev fremstillet ud fra både KBM-7 og NuKO celler. RNA-ekstraktion blev udført ved hjælp af et Qiagen RNeasy mini kit med QIAshredder, og mængden og kvaliteten bestemmes ved hjælp af en NanoDrop og Agilent Bioanalyzer. For hver af de seks prøver, 10 ug RNA blev DNase-behandlet ved anvendelse af et Ambion TURBO DNA-

gratis

™ kit og efterfølgende oprenset ved anvendelse AMPure XP perler. 2 ug af DNase-behandlede total RNA blev derefter underkastet rRNA depletering ved anvendelse af Ribo-Zero Gold (Human /mus /rotte) kit og oprenset igen med Ampure XP perler. Vellykket depletering blev vurderet ved anvendelse af en qubit fluorometer og Agilent 2100 Bioanalyzer og alle de udtømte RNA blev anvendt til RNA-Seq bibliotek præparat under anvendelse af ScriptSeq v2 protokollen. Efter 15 amplifikationscykler bibliotekerne blev oprenset ved anvendelse Ampure XP perler. Hvert bibliotek blev kvantificeret under anvendelse qubit og størrelsesfordelingen vurderet ved hjælp af Agilent 2100 Bioanalyzer. De endelige biblioteker blev poolet i ækvimolære mængder ved hjælp af data qubit og Bioanalyzer. Mængden og kvaliteten af ​​hver pulje blev vurderet med Bioanalyzer og ved qPCR hjælp af KAPA Bibliotek Kvantificering kit til Illumina platforme på et Roche LC480II Light Cycler ifølge producentens anvisninger. Skabelonen DNA blev denatureret efter protokollen beskrevet i Illumina CBOT brugervejledning og indlæst i en koncentration på 9:00. Sekventering blev udført på én bane af et Illumina HiSeq 2000 version 3 kemi genererer 2 × 100 bp parret ende læser. Kvalitetskontrol blev opretholdt med en 1% PhiX spike-in.

Bioinformatik analyse af RNA-Seq data Salg

Basecalling og de-multiplexing af indekserede læser for hver prøve bibliotek blev udført under anvendelse casava 1.8. 2 (Illumina). Rå fastq filer blev behandlet ved hjælp Cutadapt 1.2.1 [40] med option “-O 3” sat til at fjerne adapter sekvenser af 3 bp eller mere. Læser blev yderligere trimmet hjælp Sickle 1,200 at fjerne baser lav kvalitet og til sidst læser 10 bp blev fjernet. Den TopHat2 aligner versionen 2.0.10 [41] blev anvendt til at justere den trimmede R1-R2 læse par til det humane genom henvisning samling GRCh38, som indeholder 64,253 gener. Standard parametre blev anvendt, bortset fra biblioteket typen mulighed, der var sat til “fr-secondstrand” for alle prøver, som kittet bruges produceret en anden streng bibliotek type (R1 forventes at kortlægge på 5 ‘→ 3′ streng og R2 på 3’→ 5’-strengen). Læser tilpasse til referencen i mere end én position blev kasseret og FKPM værdier (fragmenter pr kilobase udskrift per million læser kortlagt) beregnet. Differential genekspression analyse blev udført i R miljøet ved hjælp af Edger pakke [42]. De tæller data blev normaliseret tværs biblioteker bruger de trimmede Mean M-værdier (TMM) metode i Edger med standardparametre. Tagwise dispersion parametre blev estimeret og derefter anvendes til log

2fc (log

2 Fold Change) estimation og test i Edger hjælp af Sandsynlighed Ratio (LR test) [43].

P

værdier forbundet med log

2fc blev justeret for multipel testning ved hjælp af den False Discovery Rate (FDR) tilgang [44]. Væsentlige degs blev defineret som dem med en FDR-justeret

P

værdi 0,05. Alle originale RNA-Seq data, der produceres i denne undersøgelse er blevet indsendt til EMBL-EBI ArrayExpress database under tiltrædelsen nummer E-mtab-4104.

RT-PCR-analyse af udvalgte gener

RNA-ekstraktion blev udført under anvendelse af et Qiagen RNeasy mini kit med QIAshredder og cDNA blev syntetiseret ved anvendelse af en Bioline Tetro cDNA-syntesekit, både ifølge producentens anvisninger. CDNA’et blev derefter kvantificeret ved PCR ved anvendelse Maxima SYBR Green Master Mix (Thermo) og en StepOnePlus ™ Real Time PCR-system (Applied Biosystems). Primere blev opnået fra Sigma og er opført i S1 tabel. De 2

-ΔΔCt metode blev anvendt til bestemmelse relative transkriptniveauer hjælp husholdning GAPDH genet til normalisering af dataene [45].

Pathway analyse

Gener viser ≥ 2 gange up- eller nedregulering med en FDR-justeret

P

værdi 0.05 blev analyseret ved brug af QIAGEN Opfindsomhed

® Pathway Analysis software (IPA

®, QIAGEN, Redwood City, https://www.ingenuity.com) for at tildele dem til forskellige funktionelle netværk. IPA

® bruger manuelt kurateret Ingenuity® Knowledge Base, som indeholder oplysninger fra flere gen og protein udtryk, interaktion og annotation databaser som intakt, BIND og MIPS, samt fra den publicerede litteratur [46]. Vi har også brugt IPA til at identificere funktionelt beslægtede gener, der svarer til specifikke kanoniske veje, der var mest markant for datasættet fra en samling af 200 kuraterede metaboliske, celle-signaleringskaskade og sygdomsassocierede pathways. Fishers eksakte test for uafhængighed blev anvendt til at beregne sandsynligheden for, at associationen mellem generne i datasættet og den kanoniske pathway kan forklares ved en tilfældighed alene. Endelig brugte vi IPA opstrøms regulator analyse for at identificere faktorer, der kan styrer gener og pathways fremhævet af netværksanalyse til at give testbare hypoteser for genregulering af Ap

4A.

Resultater

niveau af Ap

4A i KBM-7-NuKO celler

den forælder KBM-7 linje anvendt i denne undersøgelse indeholder

BCR-ABL1

gen fusion og potentielt inaktiverende mutationer i

TP53

NOTCH1

, men mangler de andre almindelige genetiske afvigelser, der findes i myeloide maligniteter [38]. Det udtrykker størstedelen af ​​kommenterede proteiner fra en bred vifte af signalveje, hvilket gør den til en egnet cellelinje til denne undersøgelse. Den fuldstændige fravær af NUDT2 protein fra NuKO

NUDT2

sprængte blev bekræftet ved Western blotting (figur 1). Steady-state koncentration af intracellulær Ap

4A i tryksvage pattedyrceller er typisk i intervallet 0,1-1,0 pmol /10

6 celler (0,05-0,5 uM), det nøjagtige beløb er arts- og celletype-afhængige [17, 47]. Log fase KBM-7 celler havde et niveau på 0,21 ± 0,02 (

n

= 3) pmol /10

6 celler. Men NuKO derivat havde en 175-fold øget niveau af 36,9 ± 0,3 (

n

= 3) pmol /10

6 celler, der giver det klareste bevis endnu, at Ap

4A er en vigtig NUDT2 substrat

in vivo

at dette enzym spiller en væsentlig rolle i at bevare det lave baggrundsniveau af Ap

4A. Bemærk, at en Ap

4A indhold på 1 pmol /10

6 celler svarer nogenlunde til en intracellulær koncentration på 0,5 uM hvis jævnt fordelt [17], så niveauet i NuKO celler vil være omkring 20 uM. Med hensyn til, om dette høje niveau, og de deraf følgende ændringer i cellerne rapporteret her, er biologisk relevant, har vi tidligere målt op til 20 uM Ap

4A i DNA reparation-defekte celler behandlet med mitomycin C [17], mens en koncentration så høj som 775 pM er blevet rapporteret i FCεR1-aktiverede mastceller [31]. Kromatografisk analyse af Ap

4A fra NuKO celler viste, at ca. 35% var til stede i form af ADP-ribosyleret derivater (ADPR-Ap

4A), hovedsagelig mono-ADPR-Ap

4A (fig 1 ). Vi har tidligere vist, at ADP-ribosylering af Ap

4A ved PARP1 og PARP2 i kinesisk hamster EM9 celler og muse embryo fibroblaster forekommer som respons på DNA-skade [17]; dog, fremgår det, at det høje niveau af Ap

4A her er genstand for konstitutiv ADP-ribosylering.

Et nukleotid ekstrakt fra NuKO celler blev udsat for ionbytningskromatografi og fraktioner analyseret luminometrically for Ap

4A som beskrevet i Materialer og Metoder. Indsat: en prøve af rekombinante NUDT2 og proteinekstrakter af KBM-7 og KBM-7 NuKO celler blev underkastet polyacrylamidgelelektroforese og efterfølgende nitrocellulose blots probet for tilstedeværelse af NUDT2 med kanin polyklonalt anti-NUDT2 (Santa Cruz) efterfulgt af påvisning med HRP-konjugeret ged-anti-kanin IgG og ECL visualisering (ECL Select, GE Healthcare). Muse β-actin blev detekteret med HRP-konjugeret gede-anti-muse-IgG (Santa Cruz).

RNA-Seq og differentiel genekspression analyse

Ap

4A har blevet rapporteret at aktivere transkriptionen af ​​delmængder af gener kontrolleret af transkriptionsfaktorer MITF og USF2 [31, 36]. På baggrund af denne, og til yderligere at udforske fænotype af

NUDT2

knockout-celler, vi foretaget en sammenlignende analyse af transcriptomes af KBM-7 og NuKO celler ved RNA-Seq for at identificere degs. Et gennemsnit på 46,1 millioner par 100 bp parret ende læser per prøve blev genereret, at linie til referencen humane genom. Alignment Resultaterne er sammenfattet i tabel 1, der viser antallet og procentdelen af ​​læser kortlagt for hver prøve. Kortlægning procenter for de seks prøver var mellem 80,2 og 81,3%. 31.177 (48,5%) af de 64,253 reference- gener havde mindst én read afstemt mens 33,076 gener ikke havde nogen læse ordnet fra nogen af ​​de seks prøver.

Forskellen i genekspressionsprofiler mellem de to celletyper er illustreret i hovedfasen Component Analysis (PCA) plot af log2 genekspression data vist i fig 2A. De tredobbelte prøver af hver celletype er grupperet godt væk fra hinanden, hvilket indikerer en høj grad af differentiel genekspression mellem dem. Endvidere Heatmap af Pearson korrelationskoefficienterne i fig 2B er angivet, at udtrykket profiler for de tre prøver fra den samme celletype blev meget mere tæt korreleret end prøver fra forskellige celletyper, som viser, at virkningen af ​​

NUDT2

knockout på genekspression var meget stærkere end indflydelse af eventuelle tekniske eller biologiske variationer mellem prøverne. Den Heatmap viser også en meget høj korrelation (R 0,99) hos prøver fra samme celletype. Således kan vi konkludere, at den differentierede genekspression opdaget her er statistisk meget robust.

(A) PCA plot af log2 genekspression data, der viser 2

nd og 3

RD hovedkomponenter. (B) Heatmap visualisering af Pearson korrelationskoefficienter på log

2 genekspression mellem prøver. De tre prøver fra vildtype KBM-7 celler er mærket WT1-WT3 og dem fra KBM-7-NuKO celler KO1-KO3. (C) MA plot viser fordelingen af ​​gennemsnitlige genekspressionsniveauer (log

2Counts Per Million kortlagt læser) mod log

2 Fold-Change (KO

vs

WT) for individuelle gen svar. Lav udtryk gener (log

2CPM -5) er farvet orange. Væsentlige differentielt udtrykte gener (degs) er farvet rød; gener, der viser ingen ændring i udtrykket er farvet sort.

Af de 31.177 læser kortlagt (S2 Table) i alt 6.288 degs blev identificeret med en

P

-værdi (FDR-justeret ) 0,05, hvoraf 2.550 blev opreguleret og 2.285 nedreguleres med en fold-change ≥ 1,2 (Fig 2C og S3 tabel). Den MA plot i figur 2C viser en forholdsvis symmetrisk fordeling af op- og ned-regulerede gener på alle niveauer af udtryk. Af disse gener, blev 980 opreguleret og 705 nedreguleres med en fold-change ≥ 2. I begge tilfælde 88% havde FPKM ≥ 0,3 for den ene eller begge af WT og KO datasæt. Den 40 ned-stærkest og op-reguleret kommenterede gener er vist i tabel 2 og 3 henholdsvis. Bemærk, at mange af disse gener havde nul læste tæller for enten WT eller KO datasæt nødvendiggør tilsætning af en lille nul-offset pseudocount af kantskæreren software for at beregne log

2fc [42].

RNA-Seq analyse blev valideret ved at udføre real-time QRT-PCR på et udvalg af gener, der repræsenterer forskellige berørte veje (Fig 3). Disse resultater bekræftede retning af regulering (op eller ned) for alle gener undersøgt. Omfanget af ændring var også lignende for de fleste gener, med en korrelationskoefficient på 0,83 mellem de to datasæt (fig 3, indsat). Men for nogle gener med en nulværdi af FPKM for en af ​​prøverne i RNA-Seq analyse, anvendelse af pseudocount metode Edger at beregne en fold-ændring har ført til en markant anden værdi, fx

GFRA1

og

TNF

. Ikke desto mindre er de beregnede værdier Edger anvendt i de følgende diskussioner, som de er tilgængelige for alle gener og er stadig en god relativ indikation af ændringen i udtrykket. For at vise, at den observerede differentiel genekspression udelukkende korrelerer med øget Ap

4A i stedet for de relaterede ADPR-ap

4A-derivater, blev QRT-PCR-analyse også udført med RNA ekstraheret fra NuKO celler dyrket i nærvær af 100 nM KU-0.058.948, en PARP1 og PARP2 inhibitor, der forhindrer syntesen af ​​ADPR-Ap

4A arter [17]. Resultaterne var meget lig dem, der opnås i fravær af KU-0058948 (figur 3), som viser, at der for disse gener i det mindste, ADPR-Ap

4A er ikke årsagen til forskellen udtryk. Funktionen af ​​ADPR-Ap

4A, hvis nogen, er stadig uklart.

QRT-PCR analyse blev udført på udvalgte RNA’er fra KBM-7 og NuKO celler i nærvær og fravær af 100 nM af PARP-inhibitor KU-0058948 under anvendelse af primerne er anført i S1 tabel som beskrevet i Materialer og metoder og log

2 fold-ændring i udtryk plottet ved siden dem, der opnås ved hjælp af RNA-Seq analyse. Indsat: simpel korrelation plot af log

2 fold-ændringer i udtryk er opnået ved RNA-Seq (

x

-aksen) og QRT-PCR uden PARP inhibitor (

y

aksen ).

Opfindsomhed

® Pathway Analyse

for at placere genekspression data i en biologisk sammenhæng, Opfindsomhed

® Pathway Analysis (IPA

® ) software blev anvendt til at tildele DEGS til kendte kanoniske veje og funktionelle net for at forudsige de biologiske funktioner af de transskriptionelle forandringer. For enkelhed, den indledende analyse omfattede kun gener, der var op- eller nedreguleret med ≥ 2 gange (

P

0,05); Såfremt stede i de resulterende veje og netværk, gener op- eller nedreguleret med ≥ 1,2 blev også anset for at være af potentiel interesse som der ikke er nogen biologisk begrundelse for en cut-off værdi på 2. Det viste sig, at DEGS kortlagt til et stort antal veje med en signifikant berigelse score (-log (

P

-værdi)) (S4 tabel). Top rangeret inden for både op- og ned-regulerede gen sæt blev signalveje relateret til immunitet og inflammation. Pathways associeret primært med det medfødte immunreaktion, såsom aktivering af interferon regulatoriske faktorer (IRFS) ved mønstergenkendelse receptorer (PRRS), og inflammation blev specifikt beriget med nedreguleret sæt gener, mens funktioner i forbindelse med MHC-klasse II-antigener var specifikke for sættet af op-regulerede gener (tabel 4). Overvægten af ​​disse veje i datasættet kan afspejle den myeloide karakter af KBM-7 cellelinjen [37]. Disse veje er diskuteret i detaljer nedenfor.

Interferon respons og medfødte immunitet.

Interferoner er vigtige mediatorer af det medfødte immunforsvar, hvilket giver en indledende afgørende forsvar mod invaderende patogener (virus , bakterier, protozoer) efter interaktion af patogene komponenter med PRRS i forskellige cellulære rum. De kan også inhibere celleproliferation, modulere den adaptive immunreaktion, og være pro- eller anti-inflammatorisk, afhængigt af kontekst [48-51]. Indsendelse af det sæt af 4.835 degs med fold ændring ≥ 1.2 til Interferome databasen (v2.01) [52] afslørede en delmængde af mindst 1.038 degs kendt for at være reguleret af type I IFN (IFN og IFNp) i andre systemer. Omkring halvdelen af ​​disse overlappede med det sæt af 944 viser kendte regulering af type II IFN’er (IFNy). Nogle (56) viste også type III (IFNλ) regulering med 15 af disse potentielt typeunikke III (S5 tabel).

Figur 4 viser IPA

® kanoniske vej for aktivering af interferon-receptorer (IFNRs ) efter type I- og type II-interferoner, med eksempler på gener der findes at være differentielt udtrykt i denne undersøgelse fremhævet. De fleste funktioner i denne vej blev nedreguleret, med udtryk for

IFNB

at være den mest stærkt påvirket (15-fold, S3 tabel). JAK-STAT signalveje er centrale for interferon respons. I type II interferon signalering, aktiverede STAT1 homodimerer binder til GAS (Interferon Gamma Aktiveret Sequence) promotor og inducerer genekspression, mens type I-signalering involverer kombinationen af ​​STAT1-STAT2 heterodimerer med IRF9 (Interferon Responsfaktor 9), der danner ISGF3 (Interferon stimuleret Gene faktor), som derefter binder til ISRE (Interferon-stimuleret respons element) promotor.

STAT1

,

STAT2

IRF9

var alle nedreguleret (1,4, 1.8- og 3.7 gange henholdsvis), mens de pathway undertrykkere

SOCS1

og

PTPN2

blev opreguleret (1,2-1,4 gange). Selvom individuelt svag, kan den kombinerede effekt af disse ændringer alligevel være betydelige. Stigningerne i

SOCS1

PTPN2

også vise, at der ikke blot er en generel undertrykkelse af genekspression, men at negativ feedback via disse gener bevares. Endelig flere af STAT-kontrollerede gener, der nedreguleres selv er aktivatorer af yderligere IFN-respons-gener, fx

IRF1

,

IRF7

IRF9

(1,2, 3.8- og 3.7 gange henholdsvis).

Down-regulerede gener er i grøn, opreguleret gener i rødt. Farveintensiteten svarer til folden ændringer; fed grænser fremhæve gener med 2-gange ændring i udtrykket. Linjer svarer til fysiske interaktioner og pile til funktionelle relationer mellem proteiner. Solid linjer og pile indebærer direkte relationer og stiplede linier og pile indebærer indirekte relationer. Funktionelle relationer omfatter post-translationelle modifikationer, transskription regulering, proteolyse eller co-udtryk. Flade pilespidser indikerer hæmning.

kanoniske vej i figur 5 fremhæver roller de tre RIG-1-lignende helicase PRRS i det medfødte immunforsvar, RIG-1 (DDX58), MDA5 (IFIH1) og LGP2 (DHX58) i aktiveringen af ​​

IFNB

efter stimulering af virale dobbelt-strenget RNA og feedback fra IFNp på ekspressionen af ​​disse PRRS. Alle tre receptor gener nedreguleret (3.1-, 2.3- og 3.0 gange henholdsvis) (S3 Table) i NuKO celler. Desuden

IFITM2

IFITM3

, hvis produkter begrænse adgangen for mange vira [53], og alle fire antivirale iFit familiemedlemmer, der binder virale komponenter (

IFIT1

,

2

,

3 fotos og

5 fotos) [54] er nedreguleret mellem 1,6 og 6,8 gange. Andre nedreguleret antivirale gener omfatter

PKR

,

GBP1

TLR10

[55-58] (S3 tabel).

Forklaring af symboler som i figur 4.

Cytokine signalering, inflammation og NF-KB.

Interleukin-1 (IL-1) signalering markeret af IPA

® som en top nedreguleret pathway (tabel 4) med reduceret ekspression af vigtige proinflammatoriske medlemmer af IL-1 superfamilien [59]. For eksempel mRNA’erne for IL-1β, dens receptor IL-1R1 og accessorisk protein IL-1RAP formindskes 1,5-, 11.7- og 1,2 gange henholdsvis mens IL-18, IL-18R1 og IL-18RAP er nede 2.3-, 3,0- og 4,0-fold henholdsvis. Ekspression af pro-inflammatoriske

IL32

reduceres også 5-fold, mens ekspressionen af ​​tumornekrosefaktor (

TNF

eller

TNFa

), som kan aktivere både type I IFN’er og den inflammatoriske mediator NF-KB, nedreguleres 30 gange (S3 tabel). Den kanoniske, der fører til transkriptionel aktivering med NF-KB gennem IL-1, TNFa og andre ligander er vist i fig 6. NF-KB-komplekset er en vigtig mediator af inflammatoriske og immunreaktioner og reagerer på PRRS og proinflammatoriske cytokiner [ ,,,0],60]. Det kan virke synergistisk med STAT signalering med den øgede induktion af målgener følge koordinere binding af statistik og NF-KB til GAS og NF-KB initiativtagere. P50 og P52 dele af NF-KB-komplekset og

RELB

transaktivator er alle nedreguleret som mange komponenter i signalveje, der fører til NF-KB-aktivering.

det er kendt, at type i IFN’er og TNF kan gensidigt undertrykke hinandens udtryk, og det er blevet foreslået, at ændringer i cross-reguleringen af ​​disse pathways kan påvirke balancen mellem de potentielle destruktive og beskyttende roller disse cytokiner i patogenesen af ​​autoimmune inflammatoriske sygdomme, såsom systemisk lupus erythematosus (SLE) og rheumatoid arthritis (RA) [61]. IPA

® identificerer signalering i RA som en top-rangerede berørte kanonisk pathway (tabel 4) og listen over DEGS forbundet med RA og SLE er vist i S6 tabel. Selv de beskedne ændringer i udtryk i nogle andre cytokinreceptorer potentielt kunne være pro-inflammatoriske (f.eks

IL10RA

og

IL23R

), det samlede billede er en af ​​undertrykkelse af inflammation ved forhøjet Ap

4A, med nedregulering af NF-KB-signalering featuring kraftigt.

opreguleret kanoniske veje og MHC klasse II-antigener.

KBM-7-celler kan betragtes som umodne precursorer til professionelle antigen-præsenterende celler, såsom makrofager og dendritiske celler og næsten alle top 20 opreguleret kanoniske veje markeret af IPA

® indebære funktioner i forbindelse med den adaptive immunrespons, herunder antigen præsentation, OX40 signalering, allograft afvisning og B-celle-udvikling (tabel 4 og S4 tabel). Imidlertid bør det understreges, at dette i høj grad fordi disse veje alle involverer en af ​​de mest fremtrædende opregulerede gensæt, de inducerbare MHC klasse II antigener (MHC-II). MHC-II-molekyler er hovedsageligt beskæftiget sig med præsentationen af ​​antigener afledt af ekstracellulære patogener resulterer i CD4 + T-hjælper celle priming og produktion af antistoffer af B-celler [62]. Næsten alle klasse II subtype gener viser en betydelig stigning i ekspression, med nogle viser en stor stigning, fx

HLA-DOA

47 gange og

HLA-DPA1

12-fold. Således, i hvilket omfang disse kanoniske pathways kan betragtes som opreguleret som helhed er et åbent spørgsmål.

Alligevel foruden MHC-II, en række andre gener involveret i fremme af aspekter af *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P