PLoS ONE: Kvantitativ High-Resolution Genomisk analyse af Single Cancer Cells

Abstrakt

Under kræft progression, opstår specifikke genomiske afvigelser, der kan bestemme omfanget af sygdommen og kan bruges som forudsigende eller prognostiske markører. Påvisning af specifikke genamplifikationer eller deletioner i enkelte blodbårne eller dissemineret tumorceller, som kan give anledning til udvikling af metastaser er af stor klinisk interesse, men teknisk udfordrende. I denne undersøgelse præsenteres en fremgangsmåde til kvantitativ høj opløsning genomisk analyse af enkeltceller. Celler blev isoleret under permanent mikroskopisk kontrol efterfulgt af high-fidelity hele genomet forstærkning og efterfølgende analyser med bøde flisebelægning vifte-CGH og qPCR. Assayet blev anvendt til enkelte brystcancerceller at analysere det kromosomale region centreret af den terapeutiske relevante

EGFR

gen. Denne metode giver præcis kvantitativ analyse af kopital variationer i encellede diagnostik

Henvisning:. Hannemann J, Meyer-Staeckling S, Kemming D, Alpers I, Joosse SA, Pospisil H, et al. (2011) Kvantitativ High-Resolution Genomisk analyse af Single kræftceller. PLoS ONE 6 (11): e26362. doi: 10,1371 /journal.pone.0026362

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: August 17, 2011; Accepteret: September 25, 2011; Udgivet: November 30, 2011

Copyright: © 2011 Hannemann et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Bundesministerium Fur Bildung Und Forschung (BMBF FKZ: 01ES0724, https://www.bmbf.de/de/1398.php). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Under dannelse og progression af kræft, celle populationer med forskellige genetiske afvigelser opstår der repræsenterer unikke kliniske enheder huser specifikke terapeutiske mål [1], [2]. Et godt eksempel er det gen locus af epidermal vækstfaktor receptor (

EGFR

), som er en central aktør i tumor biologi og et vigtigt mål for individualiseret kræftbehandling. DNA-kopien tal for denne enkelt locus væsentligt bestemme fænotypen af ​​cancerceller og er indikatorer for patientens respons på kemoterapi eller strålebehandling [3]. Antistoffer og små molekylære inhibitorer er blevet udviklet forringe EGFR tyrosinkinaseaktivitet i forskellige tumortyper [1] – [3]

De fleste tumorer kan fjernes fuldstændigt ved kirurgi og er derfor ikke tilgængelig for gentagne prøveudtagninger at overvåge enten behandling. respons eller behandlingsrelaterede inducerede ændringer i genomiske aberrationer eller sygdomsprogression hhv. For nylig, kan disse afgørende processer blive vurderet af påvisning af blodbårne cancerceller eller dissemineret tumorceller (DTCs) i knoglemarven, som fremtrædende målsøgende orgel og større site af åbenlyse metastaser i kræftpatienter. Den molekylære analyse af disse celler kan afsløre unikke oplysninger til at skræddersy behandlinger forhindrer metastatisk progression [4], [5].

Derfor har vi udviklet en metode for en pålidelig høj opløsning kvantitativ genetisk analyse af isolerede enkelte tumorceller på eksemplet med den

EGFR

gen. Efter tilsætning blev cellerne isoleret ved mikromanipulering og efterfølgende lineær hele genomet amplifikation blev udført. Evaluering af denne procedure er blevet gjort af fin-fliser vifte-CGH og kvantitativ PCR for nøjagtigt bestemme amplituden og udvidelse af

EGFR

amplicon i enkelte tumorceller.

Resultater

Mikromanipulation og hele genomet amplifikation af enkeltceller

Den humane bryst-adenocarcinom-cellelinje MDA-MB-468 blev valgt som egnet model til evaluering metode, da den rummer en

EGFR

amplifikation og viser stærk EGFR overekspression samt viser en stemness /engageret stamcelle fænotype [6], [7]. Niveauet for amplifikation varierer mellem celler. For hele genomet amplifikation (WGA), blev ikke-faste eller svagt fikserede celler opsamlet fra glasoverfladen under anvendelse af en mikromanipulator udstyret med en kapillær designet til vores specifikke krav. Celler blev overført i en vandig omkring på en C

18-silan-belagte glas stick bærer en plet af tørret fuldstændig cellelyse-buffer (se online metoder). Cellelysatet på glasset stick blev direkte overført til et reagensglas allerede forberedt med prøven buffer for WGA at undgå ethvert tab af genomisk materiale. Proceduren er baseret på multi-forskydning amplifikation ved anvendelse af vilkårlige hexamerer og korrekturlæsning DNA-polymerase Phi29 at sikre lineær forstærkning [8]. En enkelt celle givet i 2,04-2,96 pg PCR-amplificerbart DNA (gennemsnit: 2,42 ug, SD 0,26), som er overlegen i forhold til de tidligere beskrevne resultater [9]

Transfer effektivitet mikromanipulering og troskab af WGA. af en enkelt celle, herunder

EGFR

locus på ca. 4,5 MB blev valideret med mikrosatellit PCR. Mikrosatellit loci er blevet tilpasset fra Tidow et al. [10] og detaljeret oplysninger gives som supplerende information (tabel S1, S2). Alle mikrosatellit loci kunne verificeres.

Beskrivelse af EGFR amplicon i enkelte celler ved fine fliser vifte CGH

For at kontrollere for lineær forstærkning af DNA sekvenser ved WGA og til at undersøge strukturen af

EGFR

amplicon, vi analyserede regionen huser

EGFR

gen ved en høj opløsning tofarvet fin-fliser-array-CGH (Roche NimbleGen Inc., Madison, WI, USA). De specialdesignede oligonukleotide arrays med 15 bp median sonde afstand dække en genomisk sekvens på ca. 4,7 Mbp på kromosom 7p11.2, herunder

EGFR

gen selv, og to referencepunkter regioner på kromosom 2 og kromosom 10 ud af ca. 200 kb længde hver [11]. Generelt er disse referencepunkter regioner viser kun mindre genomiske afvigelser. En korrelation plot sammenligne signalintensiteter mellem hybridisering fra opformerede DNA fra én celle i forhold til genomisk DNA opnået fra 500 celler angiver pålideligheden af ​​præparatet, pre-forstærkning trin og vifte hybridisering (figur 1c).

a: Array-CGH plots af genomisk DNA fra forskellige brystcarcinomacellelinier med forskellige

EGFR

gen kopiantal. b: Array-CGH plots af WGA amplificeret DNA fra 500 MDA-MB-468 eller enkelt MDA-MB-468 celler (indkøbt hos ATCC), hhv. Området af

EGFR

gen er afbildet i grøn. c: Korrelation plot af signalintensiteter efter arrayet hybridisering sammenligning af signalerne fra DNA fra en enkelt MDA-MB-468-celle til de signaler opnået fra DNA isoleret fra 500 MDA-MB-468 celler. Steder afbildet i gul repræsentere signalerne udenfor amplikon regionen, hvorimod pletter angivet af den blå farve repræsenterer de signaler opnået ved amplicon region på kromosom 7.

Data analyser af cellelinjer bærer

EGFR Salg amplifikationer (MDA-MB-468, A431, og BT20) afslørede en amplikon på kromosom 7, der består af en hoveddel indeholder hele

EGFR

gen. Dette centrale element er udvidet i telomeriske retning med en skarp kant ved enden (figur 1 a, b), som indikerede, at amplikon indledes med en distinkt DNA-sekvens. Fra enkelt celle analyse af MDA-MB-468 celler viser forskellige

EGFR

kopiere numrene blev de præcise amplicon grænser beregnes af udjævning funktion Quantsmooth algoritmen [12]. En yderligere forlængelse af amplikonet blev fundet i MDA-MB-468 celler med det højeste kopiantal gevinst (32 kopier), der viser en yderligere sekvens udvidelse på centromerregionen stedet (figur 1b). Dataene blev valideret af kvantitativ SYBR-green PCR ved hjælp line1 repetitive sekvenser som en iboende konstant kopi kontrol [13] (Tabel S3 og S4). Denne fremgangsmåde giver mulighed reproducerbar absolutte DNA kvantificering i en enkelt celle, som ikke er blevet rapporteret hidtil.

Beskrivelse af EGFR amplicon i enkelte celler ved qPCR

Vores næste mål var udviklingen af ​​en pålidelig analyse, der kan hjælpe beslutninger terapi i klinisk rutine. Resultaterne af den fine fliser vifte-CGH har vist, at de forstærkede områder er forskellige i længde afhængig af graden af ​​forstærkning i hele regionen (figur 1), men i alle tilfælde,

EGFR

gen i sig selv er inkluderet. Baseret på kopi nummer niveauer bestemt ved fin-fliser array analyse, vi standardiseret absolutte qPCR målinger for

EGFR

exon 4, 7, 9, 15, og 21 og den ikke-kodende 5′-sekvens af amplikon i stilling 54.485.000 i en SYBR green assay til præcist beskriver

EGFR Salg amplifikationer i en enkelt celle (tabel S5). PCR effektivitet varierede mellem 98,07% og 99,02% (gennemsnit: 98,78%, SD 0.36). Alle analyser viste konsistente resultater, som præsenteres i figur 2a. I klinisk rutine, hvor en enkel og robust assay er ønskeligt, at reduktionen af ​​disse PCR reaktioner exon 7 og 9 og i 5′-enden-sekvens er tilstrækkelig

et:. Kvantitativ PCR assays for forskellige

EGFR

exons i MDA-MB-468 kloner b: Kalibreringskurver af qPCR assays til LINE-1 kontrol og

EGFR

exon 7 og 9, som viser, at amplifikationseffektiviteter af kontrollen som samt prøve-DNA er ens. c, d: Resultater af qPCR-analyse af exon 7 og 9 i enkelte tumorceller fra kræftpatienter. c: Boxplots af qPCR målinger af 10 ikke-tumor-relaterede celler fra 3 forskellige patienter. Medianen af ​​værdierne målt i ikke-tumorceller er ca. 0,9 (vandret linie i feltet). Værdier over 95% konfidensgrænser 1,377 og 1,679 betragtes som forstærkning i exon 7 og 9. De enkelte sorte prikker repræsenterer de målte værdier i tumorceller fra patientprøver, ifølge tabellen i d.

Genomisk heterogenitet i blodbårne cancerceller og DTC befolkninger fra individuelle patienter

for at undersøge, om denne integrerende tilgang udviklet og optimeret ved hjælp MDA-MB-468 celler, som model er også velegnet til analyserne af patientprøver, vi testede blodprøver og knoglemarv prøver af patienter med metastatisk brystcancer. Celler blev fremstillet som tidligere beskrevet [5], [14]. Cytokeratin og EpCAM antistoffer anvendes som markører til påvisning af blodbårne eller dissemineret cancerceller [5]. Vi isoleret adskillige enkelte celler, farves med antistoffet A45B /B3, fra forskellige patientprøver ved mikromanipulering og udførte WGA som beskrevet ovenfor. WGA gav i 1,96-2,84 ug DNA (gennemsnit: 2,36 ug, SD 0,25), hvilket er sammenligneligt med udbyttet opnået fra enkelt dyrkede celler. WGA blev kontrolleret ved anvendelse af LINE1 DNA [13], hvilket gav en middelværdi på 330 ng (interval 3 ng-621 ng, SD 211) amplifikationsproduktet og tillod nøjagtig beregning af PCR-amplificerbart DNA i hver prøve. Fra hver patientprøve, analyserede vi fire celler ved qPCR for exon 7 og 9 (figur 2), og 5′-enden-sekvens (data ikke vist). Værdierne af

EGFR

målinger i ikke-tumorceller har en median på ca. 0,9 i begge qPCR assays, hvilket forventes at afspejle den normale kopital af 2 (box plots af figur 2c). Sammenlignet med disse værdier, en tredjedel af cellerne viste en høj

EGFR

amplifikation af mindst 5-fold (p 0,0001), og omkring 25% af prøverne viste en gevinst mellem 2- og 3-fold (p 0,001). De detaljerede resultater for de enkelte celler er vist i figur 2c og 2d. Én prøve viste ikke konsistens mellem målingerne i exonerne 7 og 9. Til denne prøve, udførte vi yderligere qPCR målinger på exon 4, 15 og 21, som alle viser en normal kopi nummer for den pågældende locus. Ingen enkelt tumorcelle præsenteret med en “normal” genkopital. Kræftceller uden forstærkning af EGFR-genet viste lav kopi talværdier ( 0,7). Disse værdier er snarere forventes at være forårsaget af variation i WGA procedure end ved tekniske artefakter for qPCR, idet den beregnede start mængde DNA fra de fleste prøver påført på qPCR reaktion ( 40 pg) er tilstrækkelig til pålidelig målinger og er i intervallet kalibreringskurverne som vist for LINE1 iboende kontrol (figur 2d).

diskussion

Formålet med undersøgelsen var at udvikle en protokol, der tillader den kvantitative genomisk analyse af enkelt tumorceller. Primære tumorceller af epitelial oprindelse er heterogene. Det er blevet spekuleret, at kun en lille del af disse celler viser specifik “stamcelle – ligesom” funktioner og kan give anledning til metastaser (revideret i [15]). Disse celler kan karakteriseres ved specifikke genomiske afvigelser, der ville give dem med vækst fordele og en mere aggressiv fænotype. Dette synspunkt understøttes af data fra EGFR inhibitor studier som sådan, EGFR-muteret adenocarcinom repræsenterer en unik klinisk enhed nødvendiggør molekylær diagnostik for terapi vejledning [1]. Endvidere frembringelsen af ​​terapi resistente cellekloner huser yderligere EGFR mutationer eller amplifikationer under behandling samt overekspressionen og amplifikation af EGFR regulerer gener, f.eks ERFI1, er allerede blevet beskrevet [2], [16] Derfor er den genomiske undersøgelse af enkelte tumorceller, som enten bor i blodet eller i knoglemarven kan bidrage til at forbedre prædiktive molekylær diagnostik. Navnlig i brystcancer, EGFR-signalering synes at være opreguleret i basal-lignende tumorer (triple-negative), især i celler med stamcelle lignende funktioner [6], [7], [17], [18]. eksisterer Foreløbige eksperimentelle data, at benetits fra EGFR målrettet terapi af cetuximab eller laptinib er relateret til EGFR forstærkning niveau [6].

Flere forskergrupper har undersøgt muligheden for at analysere en enkelt tumor celle på det molekylære niveau [19] , [20]. Det er blevet vist, at genomet bred detektering af aberrationer ved anvendelse af BAC arrays er muligt i leukocytter og cellelinje celler [21]. Desuden undersøgelser af Stoecklein et al angivet en divergens mellem den primære og systemisk sygdom [19] i esophageal kræftpatienter, der slående viser behovet for analyse af enkelte disseminerede tumorceller.

I vores undersøgelse, vi valgte MDA-MB-468-cellelinie model til at udvikle protokollen på grund af forskellige stabile EGFR forstærkning niveauer i forskellige kloner af denne cellelinie. Med dette, disse celler eller anden måde efterligne den heterogene

in vivo

situation og tjene som en velafbalanceret kontrol til bestemmelse af gen kopi niveauer. Vi kan vise, at det amplificerede DNA opnået fra en enkelt celle er af tilstrækkelig kvalitet til anvendelse i en høj opløsning fin-flisebelægning array analyse. Profilerne af enkelte celler viser mere baggrund, men i forhold til profiler fra genomisk DNA af cellepopulationen de samme amplicon grænser klart kan identificeres. Genom arrayCGH Analysen giver et godt overblik over genomet brede aberrationer i en enkelt celle, men kvantificering af de genomiske ændringer er begrænset. En qPCR tilgang kan ikke anvendes til at screene for nye afvigelser, men gør os i stand til at kvantificere kendte, potentielt klinisk relevante forstærkning og sletninger. Ved anvendelse af qPCR teknik, kunne forskelle i genkopital klart skelnes såvel på niveauet af genomisk DNA fra en pulje af celler som på den amplificerede DNA opnået fra en enkelt celle. Vi kunne vise, at celler fra en individuel patient er heterogene med hensyn til deres EGFR genamplifikation. Analysen af ​​kun en eller to celler pr blodprøve kan derfor føre til resultater, der kan ikke afspejler den sande kliniske situation. Analyse af så mange celler som muligt er afgørende for at identificere de celler, der kan ikke være målrettet med en specifik behandling på grund af heterogenitet af cellepopulationen. Dette resultat, hvis det bekræftes i et større kohorte af prøver, kunne give ny indsigt i biologi metastase og kan bidrage til at forklare svigt af målrettede behandlinger i en signifikant del af patienterne.

Anvendelsen af ​​en kvantitativ PCR-assay viser en robust og omkostningseffektiv metode, der kan etableres under rutinemæssige forhold. Sammenlignet med anvendelsen af ​​fine-flisebelægning-microarrays, som er mere omkostningskrævende og mindre robust med hensyn til fortolkning af dataene, kan dette metoder potentielt anvendes i klinisk rutine for den molekylære undersøgelser af enkeltceller. Denne fremgangsmåde for første gang viser en enkel tilgang til at kvantificere DNA mængde af en specifik genomisk region fra en enkelt celle.

Med dette præsenterer vi en pålidelig metode til den absolutte kvantitative bestemmelse af genkopier i enkelt cancer celler isoleret fra perifert blod eller knoglemarv af kræftpatienter. Denne metode kan ikke være begrænset til at undersøge biologi udbrede tumorceller, men kan også blive et nyt værktøj til vurdering af encellede genomforskning med bred anvendelighed i mange områder af eksperimentel forskning. Desuden kan man forestille fremtidige kliniske anvendelser. Ud over den undersøgelse af

EGFR

gen, vores metode kan tilpasses til at vurdere andre molekylære mål (f.eks HER2 [21]), og at analysere kræftceller i andre cytologiske prøver, når den lave procentdel af tumorceller grænser de genomiske analyser fra de nuværende metoder.

Materialer og metoder

Etik Statement

Fra patienter, der leveres blodprøver, der er indhentet skriftligt informeret samtykke. Fra knoglemarv prøver indsamlet efter obduktion, blev skriftlig godkendelse givet af familiemedlemmer. Brugen af ​​medicinske journaler, blev blod og knoglemarv er godkendt af den etiske komité af Medical Board Hamburg (referencenummer # 190.504).

cellelinjer og Dyrkning

brystcancercellelinjer MDA -MB-468, BT-20, og MCF-7 samt carcinom cellelinje A431 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i DMEM med 5% varmeinaktiveret føtalt kalveserum ved 5% CO

2. Celler blev dyrket til 70% til 80% flyder sammen inden høst og overførsel til dias til enkelt celle plukning.

Immuncytokemi

Cellerne blev inkuberet i 45 minutter med det primære antistof A45B /B3 (Micromet, München, Tyskland), efterfulgt af et vasketrin og et 30 minutters inkubation med et kanin-anti-muse-bridging antistof (Z0259, Dako, Glostrup, Danmark). Detektion er blevet udført med det monoklonale muse-APAAP-kompleks (Dako, Glostrup, Danmark) og BCIP /NBT som kromogent substrat ifølge fabrikantens protokol (BioRad, Hercules, CA, USA).

Patientprøver

Patient materiale blev opnået fra University Medical center Hamburg-Eppendorf, Tyskland. Archival knoglemarvsprøver på cytospins blev anvendt. Fra patienter, der har givet blodprøver, der er indhentet skriftligt informeret samtykke. Disse prøver blev opnået fra patienter, der gennemgår obduktion og hvor familiemedlemmerne havde givet skriftlig godkendelse til at tage knoglemarv prøver til forskningsformål. Denne procedure er blevet godkendt af den lokale etiske komité. Fra patienter, der har givet blodprøver, der er indhentet skriftligt informeret samtykke.

Berigelse procedure for blodbårne cancerceller og DTC

Knoglemarv prøver og perifere blodprøver er blevet behandlet af en Ficoll- densitetsgradient at berige mononukleære celler og eventuelt epiteliale tumorceller som beskrevet tidligere [12]. Kort tid, var rygmarv prøver opnået fra den øvre hoftebenskammen via nål aspiration og opbevares i heparinbehandlede rør. Mononukleære celler herunder tumorceller blev separeret ved Ficoll-Hypaque densitetsgradient centrifugering med en densitet på 1,077 g /ml. 7 × 10

5 celler blev cytospun på objektglas, tørret ved stuetemperatur og opbevares ved -80 ° C.

Overførsel af enkelte celler

1. Silanisering af glas sticks.

Glas pinde med en diameter på 1,9-2,3 mm blev skyllet i en time i 85 ° C i en opløsning af 10% Neodisher LaboClean FT (Dr. Weigert, Hamburg, Tyskland). HPLC-rent vand blev anvendt til alle fortyndings- og vasketrin. Efter tørring blev pindene påvirket i H

2SO

4 (98%, Merck, Darmstadt, Tyskland) i en time ved stuetemperatur og skylles i vand. Pinde fik lov at tørre i 15 minutter ved 110 ° C og efterfølgende svajede i 0,5% octadecyltrichlorsilane i octan fraktion (Fluka, Erlangen, Tyskland) i to timer. Efter inkubation i 96% ethanol i en time, blev rester af ethanol og silan fjernes ved skylning med vand grundigt og kraftigt. Sticks kan opbevares tørt og mørkt i op til otte uger.

2. Lyseringsbuffer.

Lysispufferen er sammensat af 0,25% N-lauroylsarcosin, 2 M guanidiniumthiocyanat, 0,01 M natriumcitrat, pH 7,0, og 1% dimethylsulfoxid i HPLC-rent vand. Bufferen blev steriliseret ved filtrering gennem et 0,2 um PES filter (VWR, Darmstadt, Tyskland) og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse.

3. Stick forberedelse.

Før brug DTT blev tilsat til lysis buffer ved en endelig koncentration på 60 mM. Den komplette lysepuffer blev fortyndet 1:10 med HPLC-rent vand. Til den ene ende af hver glas stick, blev 0,2 pi fuldstændig lysepuffer påført og fik lov at tørre ved stuetemperatur indtil fuldstændig tørhed. De resterende salte nu danner såkaldte Lysospot «.

4. Enkelt celle plukning

Efterfølgende celler blev indsamlet ved brug af en mikromanipulator:. Det mikroinjektor Celltram Vario og mikromanipulator TransferMan NKII (Eppendorf Instruments, Hamburg, Tyskland) var udstyret med en specialdesignet, fleksibel kapillær customTip typen III med en indre diameter på 40 um og en skrå ende (45 °), udviklet i tæt samarbejde med Eppendorf Instruments. Celler blev overført fra objektglasset under visuel kontrol ved en nuklear fluorescerende DAPI-farvning for at sikre, at hele kerner blev fanget. For at forhindre tab af materiale under overførsel og cellelysis blev celler placeret direkte ud af kapillarrøret på silan-belagt glas stick bærer Lysospot. På grund af den silan belægning, vil DNA-binding til glasset forhindres. Desuden er saltene ifølge Lysospot koncentreret til et meget lille område på grund af ændringer i overfladespændingen på grund af overtrækket. Den komplette Lysospot bliver aktiveret af opløsning på grund af den vandige omkring under overførslen af ​​den manipulerede celle. Den celleholdige glas stick blev overført til en 200 pi PCR-reaktionsrør indeholdende 9 pi prøvepuffer af Genomiphi V2 amplifikation kit (GE Healthcare Europe, Freiburg, Tyskland) og overført til -80 ° C i 15 minutter. Efter optøning blev 0,1 pi proteaseopløsning (Qiagen, Hilden, Tyskland) tilsat, efterfulgt af et inkubationstrin på 15 minutter ved 50 ° C for protein fordøjelse og et yderligere inkuberingstrin af 15 minutter ved 75 ° C i enzymdeaktivering.

Whole Genome Amplification

Hele genomamplifikation blev udført med Genomiphi V2 kit (GE Healthcare Europe, Freiburg, Tyskland) ifølge producentens protokol med de følgende modifikationer: glasset stick forbliver i reaktionsrøret under amplifikation. Amplifikationsreaktionen fik lov til at løbe i 150 minutter ved 30 ° C i et samlet volumen på 20 pi. WGA produkt blev renset op med NucleoSEQ spin-søjler (Macherey-Nagel, Düren, Tyskland) og DNA-koncentrationer blev målt ved Nanodrop1000 (Peqlab, Erlangen, Tyskland).

mikrosatelitter Detection

allel status de polymorfe gentagelser blev undersøgt ved PCR-amplifikation efterfulgt af separation på enten en 2% agarosegel eller kapillarelektroforese. Reaktionerne blev udført i et totalt volumen på 10 pi under de nedenfor angivne betingelser (tabel S1) på en Mastercycler gradient (Eppendorf Instruments, Hamburg, Tyskland). Annealingstemperaturen blev tilpasset efter de anvendte primere som vist i tabel S2. Separationen blev udført ved anvendelse af et fire-farve laser induceret fluorescens kapillarelektroforesesystem (AbiPrism 3130; Applied Biosystems, Wilmington, GE, USA) under anvendelse GeneScan Standard ROX-500 for evaluering fragment længde. Evalueringen blev udført ved hjælp Genemapper v2.03 evaluering software (Applied Biosystems, Wilmington, DE, USA).

Fin Fliselægning Array Analyse

Den fine fliser vifte designet af NimbleGen (Roche NimbleGen Inc. , Madison, WI) som beskrevet før [22] i henhold til vores tilpassede parametre (tabel S6). Baser, der er en del af repetitive elementer er blevet fjernet fra under overvejelse til sonde design. Desuden blev de udvalgte prober ikke indeholde tvetydige nucleotid koder. Yderligere kriterier blev: annealingstemperatur på 76 ° C, sonde længde mellem 50-75 bp blev sonden lov til kun at matche én gang i hele genomet i henhold til menneskelige genom samling marts 2006 (hg18), http: //genome.ucsc. edu (tabel S6), og proberne ideelt gang med en forskydning på 15 bp. Med disse specifikationer, kan cirka 395.000 sonder blive opdaget på et array. Grænserne for de amplikoner for de forskellige MDA-MB-468-cellekloner blev beregnet ved udglatning funktion af Quantsmooth algoritmen [12] og valideret bagefter ved kvantitativ realtids-PCR. Til dette formål blev et samlet beløb på 53 SYBR grønne analyser designet flankerer beregnede start- og slutpunkter deler de samme specifikationer. Assayene blev udformet til at amplificere ental genomiske sekvenser af 50-150 bps længde at sikre specifik kvantificering. Kromosom 2 og kromosom 10 blev brugt som stabile referencepunkter regioner i henhold til Naylor

et al.

[11]. Hvis det er nødvendigt, blev den beregnede start- og slutpunkter korrigeret baseret på array CGH plot og qPCR resultater.

Kvantitativ RT-PCR

kvantificering af det gennemsnitlige gen kopi antal

EGFR

blev udført under anvendelse af specifikke primere målrettet ental sekvenser af 50-150 bps inden for forskellige exoner af

EGFR

gen som angivet i tabel S3. PCR-reaktioner blev udført på en Mastercycler epgradientS Realplex4 under betingelserne i tabel S4in et samlet volumen på 15 pi. Hver prøve blev målt i tre eksemplarer. En separat kalibreringskurve blev frembragt for hver som siger i hvert forsøg under anvendelse af leukocyt-DNA fra den samme patient i området fra 10-0.15 ng pr reaktion. DNA-koncentrationer blev normaliseret med henvisning til den konstante kopiantal henvisning LINE1 [13]. Smeltende analyser blev udført efter hver kørsel for at verificere ental produkt forstærkning.

EGFR

gen kopi numre er blevet bestemt ved at beregne forholdet mellem DNA beløb i

EGFR

region divideret med DNA mængde i referenceregionen. En normal, diploide gen kopi nummer er ideelt afspejles af en (2n /2n), tre kopier af

EGFR

gen ville forventes omkring 1,5 (3n /2n). Til beregning af cut-off for at kalde en prøve vundet, blev 95% konfidensgrænser for referenceværdierne anvendte (). Alle målinger over den øvre grænse blev betragtet som en

EGFR

genkopitallet gevinst.

Støtte oplysninger

tabel S1.

PCR-protokol af mikrosatellit PCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0026362.s001

(PDF)

tabel S2.

Oversigt over sekvenserne af mikrosatellit-primere.

doi: 10,1371 /journal.pone.0026362.s002

(PDF)

tabel S3.

PCR primerpar til qPCR af

EGFR

gen.

doi: 10,1371 /journal.pone.0026362.s003

(PDF)

Tabel S4.

PCR-protokol til

EGFR

-qPCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0026362.s004

(PDF)

tabel S5.

PCR primerpar på kromosom 7.

doi: 10,1371 /journal.pone.0026362.s005

(PDF)

tabel S6.

contigs’ene til array design.

doi:. 10,1371 /journal.pone.0026362.s006

(PDF)

Tak

Vi takker A. Bauche og O. Mauermann for fremragende teknisk bistand