PLoS ONE: Virkningen af ​​Gene Dosering på Gene Expression, biologiske processer og overlevelse i livmoderhalskræft: En Genome Wide Follow-Up Study

abstrakt

Vi undersøgte rollen af ​​tumor kopiantal (CN) -altered genom (CN-AG) i carcinogenese af livmoderhalskræft (CC), især dens effekt på genekspression, biologiske processer, og patientoverlevelse. Fifty-nine human papillomavirus 16 (HPV 16) -positive CCs blev undersøgt med mikroarrays-31 til kortlægning CN-AG og 55 for global genekspression, med 27 CCs til fælles. Fem-års overlevelse blev undersøgt i 55 patienter. Sletninger og amplificeringer 2,5 Mb blev defineret som KN ændringer. Den% CN-AG var på mellem 0 til 32,2% (middelværdi = 8,1 ± 8,9). Tumorer blev klassificeret som lav (middelværdi = 0,5 ± 0,6, n = 11), medium (middelværdi = 5,4 ± 2,4, n = 10) eller høj (middelværdi = 19,2 ± 6,6, n = 10) CN. Den højeste% CN-AG blev fundet i 3. kvartal, hvilket bidrog i gennemsnit 55% af alle KN ændringer. Genom-dækkende, blev kun 5,3% af KN-ændrede gener dereguleret direkte af gen-dosering. I modsætning hertil den sats fuldt duplikeret 3. kvartal var dobbelt så høj. Forstærkning af 3q forklarede 23,2% af deregulerede gener i hele tumorer (r

2 = 0,232, p = 0,006; variansanalyse), herunder gener placeret i 3. kvartal og andre kromosomer. I alt 862 gener var udelukkende dereguleret i høje-KN tumorer, men kun 22,9% var CN ændret. Dette antyder, at de resterende gener ikke dereguleret direkte af gendosis, men ved mekanismer induceret

i trans

KN-ændrede gener. Anafase-fremmende kompleks /cyclosom (APC /C) -afhængig proteasom proteolyse, glykolyse, og apoptose blev opreguleret, mens celleadhæsion og angiogenese udelukkende blev nedreguleret i høj KN tumorer. Den høje% CN-AG og opreguleret genekspression profil APC /C-proteasomforløb proteolyse blev forbundet med dårlig patient overlevelse (p 0,05, log rank test). Sammen med glykolyse, blev de lineært forbundet med FIGO stadie (r 0,38, p 0,01, Spearman test). Derfor inhibering af APC /C-proteasomforløb proteolyse og glycolyse kan være nyttige for CC behandling. Men om de er uundværlige for tumorvækst stadig påvises,

Henvisning:. Medina-Martinez I, Barrón V, romersk-Bassaure E, Juárez-Torres E, Guardado-Estrada M, Espinosa AM, et al . (2014) Konsekvenserne af Gene Dosering på Gene Expression, biologiske processer og overlevelse i livmoderhalskræft: En Genome Wide Follow-Up Study. PLoS ONE 9 (5): e97842. doi: 10,1371 /journal.pone.0097842

Redaktør: Robert D. Burk, Albert Einstein College of Medicine, USA

Modtaget: December 6, 2013; Accepteret dateret 25. april 2014 Udgivet: 30 maj, 2014

Copyright: © 2014 Medina-Martínez et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af det nationale Råd for Videnskab og Teknologi (CONACYT, www.conacyt.mx), giver numrene 8135 /A1, 24.341 (til JB), 80680 (til SK) og 133.273 (til FF) og National University of Mexico ( www.unam.mx) indrømme nummer SDI.PTID.05.2 (til JB). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Livmoderhalskræft (CC) er den anden mest almindelige kræftform hos kvinder over hele verden, der påvirker 500.000 personer hvert år; det er den hyppigste årsag til kræft dødsfald blandt kvinder i udviklingslande [1]. De virale oncoproteiner E6 og E7 af det humane papillomavirus højrisiko-(HPV) spiller en vigtig rolle i carcinogenese. De inhiberer forskellige cellulære mål, herunder tumor-suppressor proteiner p53 og pRb, forstyrre vigtige cellulære processer, såsom apoptose og cellecykluskontrol, og føre til genomisk ustabilitet og neoplastisk udvikling [2]. På trods af skader forårsaget af disse oncoviral proteiner, CC er en sjælden komplikation af den virale infektion; de fleste infektioner er forbigående og ikke udvikle sig til neoplastiske læsioner. I gennemsnit kan 12-15 år, før en vedvarende HPV-infektion fører til CC via præmaligne stadier af cervikal intraepithelial neoplastiske læsioner [3]. Disse resultater antyder, at HPV-infektion alene ikke forårsager sygdommen, og at andre faktorer, såsom abnorme værtsgener, er forbundet med udviklingen af ​​invasiv cancer.

Genomiske ubalancer kan bidrage til dereguleret ekspression af onkogener og tumor-suppressor gener i cancerceller, og akkumulering af sådanne ændrede gener er blevet korreleret med tumor progression [4]. Adskillige kopiantal (CN) -altered regioner (CNA’er) er blevet identificeret i CC gennem tumor genomanalyse ved anvendelse af fremgangsmåder såsom komparativ genomisk hybridisering, fluorescens in situ hybridisering og mikroarrays (MAS). Gevinster på 3q [5] – [11] og 5p [5], [12] – [15] er de hyppigste kromosomale ændringer til CCS, og de er også blevet beskrevet i andre faste tumorer [16] – [18]. Den mindste konsensus region 3q forstærkning i CC kort til kromosomale cytobands 3q26-27 [6] – [10], [19], hvilket tyder på, at gener som

tert

[20], [21],

PIK3CA

[22], og

ECT2

[23], der betragtes kandidat onkogener for CC, kan være involveret i livmoderhalsen carcinogenese. I hvilket omfang disse tilbagevendende kromosomale ændringer er relevante for tumor udvikling er stadig stort set ukendt. På den anden side er den fulde amplifikation af 5p veldokumenteret i tumorprøver og cellelinjer [12], [23] – [25]. Nogle gener forstærkes i denne region, og foreslog at være involveret i CC, såsom

SKP2

,

TERT

,

TRIO

,

RNASEN

, og

PRKAA1

er overudtrykt i tumorprøver [15] og cellelinjer [12], [24].

bidrag KN ændringer til livmoderhalskræft carcinogenese er uløst på grund af en genom-dækkende mangel på korrelation mellem CNAs og genekspression [23], selv i helt forstærkede kromosomale arme såsom 3q eller 5p [23] – [24], [26] – [27]. I en tidligere undersøgelse undersøgte vi, om CNAs i cellelinjerne Calo, CaSki, HeLa, og SiHa er associeret med ændringer i genekspression [23]. Genom-dækkende, blev kun en lille procentdel af gener placeret i CNAs (15,6%) eller minimale tilbagevendende regioner (18,8%) dereguleret. Men disse procentsatser var højst 4% højere end i gruppen af ​​gener uden KN ændringer (14,8%). Disse data tyder på, at kun ca. 4% af KN-ændrede gener generelt er dereguleret direkte af gen-dosering i CC-afledte cellelinjer. Selv i genomiske segmenter bekræftet at være helt forstærkes, såsom 3q og 5p, blev procentdelen af ​​deregulerede gener ikke altid steget. I tilfælde af 5p, procentdelen af ​​deregulerede gener øges op til 33% i de 4 cellelinjer. Selvom 3q næsten helt amplificeret i Calo (93,5%) og HeLa (87,2%), at andelen af ​​deregulerede gener steg kun ca. 2 gange i HeLa (23,4%), men ikke i Calo (12,7%) sammenlignet med den i CaSki ( 13,9%) og SiHa (9,4%), som viste kun delvis amplifikation af 3q [23]. Interessant, ikke alle deregulerede gener fra duplikeret 5p og 3q blev overudtrykt. I stedet ca. 20% af gener dereguleret i 5p og mere end 50% af gener dereguleret i 3. kvartal blev nedreguleret. Derfor kan andre end gendosis faktorer, såsom epigenetiske mekanismer kan påvirke genekspression i helt amplificerede genomsegmenter. Der er ingen undersøgelser, der udforskede den globale sammenhæng mellem KN ændringer og genekspression i CC.

I denne undersøgelse har vi undersøgt 59 HPV16-positive CCs med mikroarrays-31 til kortlægning CN-AG og 55 for den globale gen udtryk, med 27 CCs til fælles. Vi undersøgte hele genomet, på et gen-for-gen-niveau, er andelen af ​​CN-ændrede gener, der er dereguleret, og omfanget af den samlede ændrede transkriptom i CC, der er dereguleret direkte eller indirekte af gendosering. Vi undersøgte også de biologiske processer i cervical carcinogenese, der er forbundet med gener dereguleret af gen-dosering og indflydelse gen dosering på den samlede patient overlevelse

Resultater

Samlet Tumor Genome Analysis:. Identifikation af kromosomer , regioner og Gener Altered i KN

i alt 673 CNAs større end 2,5 Mb blev identificeret baseret på analysen med GeneChip menneskelige Mapping 500 K (500 K) microarray: 446 amplificeringer og 227 sletninger. Disse regioner blev valideret med en anden high-density microarray (CytoScan HD2.7) i 15 af de 31 tumorer undersøgt med 500 K microarray. Den gennemsnitlige sammenfald mellem de 2 arrays var 79,3%, men steg lineært fra 70% i CNA’er af 2,5-3 Mb til 93,4% i CNAs større end 10 Mb (r = 0,93, p 0,001, Spearman korrelation, figur S1) . I virkeligheden, når de fuldstændige kromosomale arme blev sammenlignet, vises sammenhængen mellem de 2 mikroarrays var tæt på 100% (figur 1). I gennemsnit tumorer havde 22 ± 19 CNAs (interval 0-65). Fra størrelsen af ​​det haploide genom (3000 Mb), beregnede vi procentdelen af ​​CN-ændrede genom (CN-AG) for hver tumor. De varierede meget blandt tumorerne fra 0% til 32,2% procenter (middelværdi = 8,1 ± 8,9%) og fulgte en ikke-parametrisk fordeling (figur 2A, tabel 1). Tumorer blev inddelt i 3 grupper efter% CN-AG: lav (middelværdi = 0,5 ± 0,6, n = 11), medium (middelværdi = 5,4 ± 2,4, n = 10), og høj (middelværdi = 19,2 ± 6,6, n = 10; figur 2B, grå bokse). Kun 5 kromosomale arme havde en gennemsnitlig% CN-AG højere end den gennemsnitlige genom og nåede statistisk signifikans (p 0,05, chi-square; markeret med en stjerne i figur 3A). Fire af disse våben viste hovedsageligt vundet genom (3q, 5p, Xp, XQ), og kun 3 p viste en overvejende slettet genom. Den højeste procentdel blev fundet i 3q (44,3%), efterfulgt godt neden af ​​XQ (26,8%), Xp (22,4%), og 5p (21,2%, se Figur 3A). Kun KN-ændringer i kromosomer 3q, Xp og 5p viste en lineær sammenhæng med de globale ændringer i genomet (r = 0,88, p 0,0001, variansanalyse). Disse 3 kromosomer kan forklare 76% af variationen i KN (justerede r2 = 0,76), med 3. kvartal placering i toppen og tegner sig for 55% af alle KN ændringer i tumoren genomet [multipel lineær regression (MLR)].

intensitetssignalerne af enkelt nukleotid-polymorfier (SNP) eller ikke-polymorfe prober er udtrykt som log

2-forhold fra kromosomer 3, 4 og 5 af tumoren R496 undersøgt ved hjælp af 500 K microarray (øverste panel) og HD 2.7 microarray (nederste panel). I begge paneler, y-aksen viser en log

2-forhold skala fra -1,5 til 1,5, og x-aksen viser ideogram af de udforskede kromosomer med genomposition. Den vandrette linje krydser y = 0 svarer til 2 eksemplarer. Den gennemsnitlige tæthed af udforskede positioner er mere end 5 gange højere i HD 2.7 microarray end i 500 K microarray (se materialer og metoder).

Panel A viser box plots med fordelingen af ​​tumorer (n = 31) i henhold til den procentdel af den samlede, slettes eller forstærket CN-ændret genom (KN-AG). Panel B viser fordelingen af ​​tumorer, grupperet som lav (n = 11), medium (n = 10), og høj (n = 10) ifølge den procentdel af global og 3Q CN-AG. De vandrette linjer inde kasserne repræsenterer medianen (fast) og gennemsnit (stiplet), og knurhår repræsenterer minimum og maksimum værdier inden for 1,56 interkvartile område fra slutningen af ​​boksen. Værdier uden for dette område er repræsenteret ved sorte cirkler. Faldet i den akkumulerede hyppighed af tilbagevendende CN-ændrede gener, som øger antallet af tumorer, der delte den samme ændret gen, er vist for hele genomet (felt C) eller til kromosomer med signifikant høj% CN-AG (Felt D) . Kombineret gener er dem, der er blevet slettet i nogle og forstærkes i andre tumorer.

Den venstre side viser den udforskede genom (Mb) i hvert kromosom arm, der blev udforsket med 500 K microarray i 31 tumorer. Den højre side viser antallet af gener på hver arm udforsket med Human Gene 1.0 ST microarray i 27 af de tumorer, hvori CN blev undersøgt. Hver søjle repræsenterer procentdelen af ​​CN-AG (venstre) eller deregulerede gener (højre) af det kromosomale arm angivet i midten. Røde søjler angiver gevinster eller overekspression og blå søjler repræsenterer tab eller underudtryk. Den stiplede linje repræsenterer den gennemsnitlige procentdel af det globale KN-AG (8,1%, til venstre) eller procentdelen af ​​deregulerede gener (9,5%; højre) i tumoren genom. Armene markeret med en stjerne havde en gennemsnitlig andel af CN-AG eller procentdelen af ​​deregulerede gener overlegen og statistisk signifikant sammenlignet med tallene fundet i komplet tumor genom (p 0,05, chi-square)

for at identificere gener med KN ændringer, vi justeret CNAs med menneskelige gener efter position i genomet. Antallet af ændrede gener varierede fra 0 til 10.666 (middelværdi = 2.754 gener, se tabel 1) blandt tumorerne og korrelerede positivt med% CN-AG (r = 0,99, p 0,0001, Pearsons korrelation). De fleste CN-ændrede gener blev ikke fordeles mellem tumorer. Den akkumulerede hyppighed af tilbagevendende CN-ændrede gener drastisk nedsat, når antallet af tumorer, der delte den samme ændret gen steget (figur 2C). Faktisk blev der ikke gen ændres i alle 31 tumorer udforskes, og kun 3 gener (

RPL21P39

,

NLGN1

,

GM2AP1

) blev ændret i 20 tumorer. 3q gener er de hyppigst forekommende -op til 10 tumorer viste ændring af næsten 100% af den udforskede gener-, og 3q kurve blev forskudt mod højre 6 tumorer fra den nærmeste kurven for de andre kromosomer (se figur 2D). I alt 264 gener havde tilbagevendende ændringer, alle fra 3. kvartal, i 16 (51,6%) eller flere tumorer.

Vi valgte 7 af de mest tilbagevendende gener placeret på 3. kvartal (

CLDN1

,

ECT2

,

NAALADL2

,

NLGN1

,

PLOD2

,

PLSCR1

, og

PLSCR4

) at være valideret med en real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) -teknik i alle 31 tumorer og 17 kontroller. Alle gener viste en signifikant positiv korrelation (r 0,6, s 0,0001, Pearsons korrelation) mellem den gennemsnitlige intensitet (log2 udvekslingsforhold) SNP’er identificeret med mikroarrayet i CNA’er, hvor generne blev placeret i hver tumor, og antallet kopier beregnet med qPCR (data ikke vist). Når antallet af kopier, der er beregnet med qPCR blev sammenlignet mellem grupperne, den gennemsnitlige CN af de 7 udforskede gener var signifikant højere i tumorer, der havde ændringer end hos dem uden ændringer i disse 3Q gener (p 0,05, t-test, figur 4A) .

det øverste panel viser det gennemsnitlige antal kopier af 7 gener (

CLDN1

,

ECT2

,

NAALADL2

,

NLGN1

,

PLOD2

,

PLSCR1

, og

PLSCR4

) placeret i 3. kvartal udforsket med qPCR i kontroller (lymfocytter) og tumorer med 2 eller 3-4 eksemplarer identificeret med 500 K microarray. Whiskers af hver bar repræsenterer standardafvigelsen af ​​middelværdien. Den stiplede røde linje viser værdien i 2,5 eksemplarer beregnes med qPCR (se materiale og metoder). Det nederste panel viser korrelationen af ​​genekspression af 8 gener (

MCM2

,

PLOD2

,

PLSCR1

,

SMC4

,

ECT2

,

NLGN1

,

RFC4

, og

CLDN1

) placeret i 3. kvartal udforsket i 27 tumorer og 6 kontroller med både HG 1.0 ST microarray og QRT-PCR-teknikker . Log

2 værdier af de normaliserede intensitet signaler opnået med mikroarrayet (robust multichipkredsløb middelværdier) og QRT-PCR blev plottet. Trend linje (sort linje), korrelationskoefficient (r), og p-værdi blev beregnet med Pearsons korrelation test.

Analyse af Global Gene Expression

Den mængde messenger-RNA (mRNA ) transskriberet fra 21,034 gener blev undersøgt ved hjælp af microarray HG 1.0ST i 27 af de 31 tumorer undersøgt med 500 K microarray og i 17 normale cervikale epitel kontroller (figur 5, tabel 1 og tabel 2). Vi identificerede 2.006 ændrede gener (9,5%), 57,6% nedreguleres og 42,4% opreguleret (tabel S1). Når de 2 adenocarcinomer (ACC, R075 og R189 i tabel 1), og den adenosquamøst celle carcinom (ASCC; R298 i tabel 1) blev udelukket fra analyserne, fandt vi et tilsvarende antal gener og overensstemmende 95% med listen over ændrede gener. Derfor, for at opretholde stikprøvestørrelse vi inkluderer alle 27 kandidatlande.

Figuren viser analysen workflow af de 59 CC sager udforskes i denne undersøgelse. Alle CC prøver var HPV16 positive og blev undersøgt med mikroarrays-31 til kortlægning CN-AG og 55 for global genekspression, med 27 CCs til fælles. Disse 27 CCs blev anvendt til analyser af den globale genekspression og sammenhængen mellem de KN-AG og genekspression. For det hierarkiske clustering analyse blev udtrykket profiler af de 55 CC prøver inkluderet. Fem-års overlevelse blev undersøgt i 55 patienter, 51 udforsket for genekspression og 28 for KN ændringer, med 24 CCs til fælles. Se materiale og metoder sektion for de procedurer.

Hyppigheden af ​​deregulerede gener blev beregnet ved kromosom. Af de 42 udforskede arme, kun 5 (3q, 4q, 6p, 15q, og XQ) viste en højere og statistisk signifikant procentdel af deregulerede gener i forhold til den samlede procentdel (9,5%; markeret med en stjerne i figur 3B). De kromosomer, der viste den højeste procentdel var 6p (16,0%, p 0,001) og 3q (15,9%, p 0,001), efterfulgt af 4q (15,6%, p 0,001), XQ (13,0%, p 0,02), og 15q (12,9%, p 0,04); chi-square test for alle sammenligninger. Opreguleret gener dominerede i 3. kvartal og 6P, mens nedreguleret gener var mest udbredt i 4. kvartal, 15q, og XQ (se figur 3B).

Vi evaluerede udtryk for 28 gener udvalgt til validering med en QRT-PCR-teknik i 27 CC prøver og 6 kontroller (tabel S2). Vi fandt en signifikant positiv korrelation (gennemsnitlig r = 0,74, p 0,05; Pearsons korrelation) mellem de logaritmiske værdier (log2) af data opnået med QRT-PCR og microarray i 27 af de 28 gener udforsket (96,4%). Figur 4B viser korrelationen mellem de intensitetsværdier (log2) opnået med de 2 fremgangsmåder til 8 gener lokaliseret på 3Q. Disse data viste, at udtrykket værdi opgjort med microarray var temmelig pålidelig, fordi op til 96,4% af validerede gener havde en signifikant sammenhæng.

For at identificere de biologiske processer, der er forbundet med de 2.006 forskelligt udtrykte gener, vi brugte Database for anmærkning, Visualisering, og integreret Discovery værktøj (DAVID, https://david.abcc.ncifcrf.gov/). Sammenlignet med den menneskelige genom database, de 5 mest berigede klynger med de laveste p-værdier på medium stringens var cellecyklus herunder mitose, DNA metaboliske processer, herunder DNA-reparation, kromosom adskillelse, cytoskeleton organisation, og udviklingsprocesser (tabel 3). Interessant, på højeste stringens, hvor der forventes mere stramt forbundet gener i hver gruppe, de klynger, herunder mitose blev rangeret først, tredje og femte (biologiske processer i kursiv i tabel 3).

samlede gruppe af deregulerede gener blev også analyseret med Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software, og de samlede resultater var meget lig dem, der opnås med DAVID værktøjet (data ikke vist). Af de 89 kanoniske veje, IPA identificeret som ændret (p 0,05, Fisher eksakt test), der er involveret i cellecyklus og DNA-reparation rangeret øverst på listen (figur 6A)

Panel A viser. top 25 kanoniske veje identificeret i sæt af 2.006 deregulerede gener i hele sættet af tumorer. Panel B viser de 25 kanoniske veje identificeret i sæt af 862 gener udelukkende liberaliseret i høj KN tumorer. De kanoniske veje blev identificeret med opfindsomheden Pathway Analysis software. Den -log (p-værdi) og forholdet blev beregnet ved at sammenligne antallet af gener, der tilhører vejen til stede i datasæt med det humane genom database. Den p-værdi blev beregnet ved anvendelse af chi-square eller Fishers eksakte test, som er relevant, og værdierne af -log (p-værdi) højere end 1,3 (rød linje) svarer til en værdi af p 0,05. Den kanoniske vej af hypoxi inducerbare faktor (HIF1α) signalering var statistisk signifikant i de liberaliserede gener i hele sættet (43. plads) og i high-CN sæt af tumorer (26. plads).

Korrelation mellem ændringer i KN og Gene Expression

En simpel analyse af figur 3 viser, at der ikke findes nogen klar sammenhæng mellem genekspression og CNA’er. For eksempel, af de 5 kromosomer med den højeste procentdel af CN-AG, kun 2 (3q, XQ) viste en signifikant stigning i andelen af ​​deregulerede gener. Endvidere er de andre 3 kromosomer viser en betydelig stigning i deregulerede gener (4q, 6p, 15q) manglede en høj procentdel af CN-AG, selv 6p og 15q havde en andel langt under det samlede gennemsnit. Selvom overudtrykte gener dominerer i de fleste af kromosomer med en høj procentdel af gevinster, disse kromosomer har også en høj andel af nedreguleret gener, og i nogle, såsom XQ er andelen af ​​nedreguleret gener dominerer (figur 3). På den anden side, kromosomer, der vises overvejende deletioner (3p, 4p) også havde en procentdel af opreguleres gener, skønt procentdelen af ​​nedreguleret gener var dominerende.

For at forstå mere grundigt forholdet mellem CN ændring og genekspression, vi analyserede disse variabler gen ved gen i hver tumor. Udtrykket status (nedreguleret, opreguleres eller uden ændring) for hver undersøgt gen (n = 21.034) blev identificeret i hver tumor under anvendelse cutoffværdier (se materialer og metoder). KN status for hvert af disse gener blev også identificeret i hver tumor. Antallet af gener med og uden ændringer i KN og genekspression er vist for hver tumor i tabel 1. Det gennemsnitlige antal CN-ændrede gener blev 1.673, og det gennemsnitlige antal 2 kopi-gener var 19.362 (se tabel 1). I gennemsnit blev der 2.010 (9,6%) gener dereguleret i tumorer, hvoraf 241 blev KN ændret og 1769 havde 2 eksemplarer. Disse data betyder, at i gennemsnit kun var 14,4% (241/1673) af KN-ændrede gener og 9,1% (1769 /19.362) af 2 kopi gener dereguleret. Forskellen mellem de 2 undergrupper var kun 5,3% (p 0,00001, chi-square) og svarer til den gennemsnitlige fraktion af gener med KN ændringer, der kan deregulerede direkte ved gen-dosering. Især blev kun 69% af de forstærkede og deregulerede gener overudtrykt; resten blev nedreguleret. Desuden blev kun 82% af de slettede og deregulerede gener nedreguleret; resten blev overudtrykt (data ikke vist). Disse resultater er enig med observationer på kromosom-niveau.

For at undersøge om der er en lineær tendens mellem genekspression og mængden af ​​KN ændring (KN-AG), vi analyserede sammenhængen mellem de 2 variable, herunder den enkelte data for alle tumorer undersøgt. Som forventet, det samlede antal deregulerede gener steg med% CN-AG (beregnet ud fra tabel 1, r = 0,5, p = 0,007, Pearsons korrelation, figur 7). Ifølge ligningen i figur 7 (y = 32x + 1.734), i en tumor med 0% CN-AG (x = 0), er antallet af deregulerede gener er ca. 1.734 og ville blive dereguleret i andre end gendosering mekanismer. Derimod vil tumoren med den højeste% CN-AG (R365 = 32,2%, se tabel 1) har yderligere 1.034 deregulerede gener (total = 2768). Dette antal er meget tæt på den observerede antal deregulerede gener (se tabel 1) og omfattede den del af deregulerede gener, der kan deregulerede direkte ved gen-dosering. I dette ekstreme tilfælde, at antallet svarer til 37,4% af alle deregulerede gener (1034 /2.768). I hele sæt af tumorer, kun 12% (241 /2.010) af deregulerede gener i gennemsnit var KN ændret (beregnet ud fra tabel 1). Kun KN-ændringer i 3. kvartal viste en klar lineær regression med global genekspression (r = 0,51, p = 0,006, variansanalyse), og det forklarede 23,2% (justeret r

2 = 0,232, MLR) af alle ændringer i genekspression.

udviklingen i antallet af deregulerede gener med øget% CN-AG i hele sættet af 21,034 udforskede gener er vist. Den linje repræsenterer den lineære korrelation tendens for datasættet. Også vist er ligningen for den linje, korrelationskoefficienten, og p-værdi beregnet med Pearsons korrelation test.

Identifikation af liberaliserede Gener og biologiske processer forbundet med ændringer i Gene Dosering

a) dereguleret gener i lav- og høj-KN tumorer.

for at identificere de differentielt udtrykte gener i tumorer med lave og høje procenter af KN ændringer (se figur 2B, grå kasser), sammenlignede vi hver gruppe af tumorer med kontrolgruppen (n = 17) under anvendelse af SAM-metoden. Af de 21,034 udforskede gener, blev 1.757 (8,4%) dereguleret i tumorer med høj CN, men kun 1.104 gener (5,2%) blev dereguleret i tumorer med lav CN. Interessant, 895 (81,1%) af de deregulerede gener i lav-CN-gruppen også blev dereguleret i high-CN-gruppen. Forskellen i antallet af deregulerede gener mellem høj-CN-gruppen og de fælles gener (n = 862) svarer til den del af gener dereguleret i gendosis i high-CN-gruppen (49,1%).

bemærkelsesværdigt, blev kun 9,2% af generne udelukkende dereguleret i høje-KN tumorer (79 af 862) amplificeret (n = 76) eller slettet (n = 3) i 6 eller flere tumorer. De resterende gener blev CN ændret i 4-5 (n = 118), 1-3 (n = 370) eller ikke (n = 295) tumorer (Tabel S3). Baseret på disse beregninger, vi konservativt antages, at i denne gruppe af gener, der udelukkende forbundet med høj-KN tumorer (n = 862), gendosis har en direkte indflydelse på genekspression i højst 22,9% af disse gener (CN ændres i ≥ 4 tumorer). De resterende gener (CN ændret på ≤3 tumorer, n = 665), ville ikke blive dereguleret direkte af gen-dosering, men af ​​andre mekanismer, måske påvirket

i trans

af nogle KN-ændrede gener.

b) identifikation af biologiske processer, der er forbundet med tumorer med høj og lav CN.

DAVID værktøjet blev anvendt til at identificere de biologiske processer, der er beriget i den delmængde af fælles gener (n = 895), og dem dereguleret udelukkende i høj -CN (n = 862) og lav-CN (n = 209) tumorer. De klynger af biologiske processer, der findes i de fælles gener var meget lig dem beriget med hele sættet af tumorer (tabel 3 vs. tabel S4). Men nogle vigtige biologiske processer beriget med hele sættet af tumorer, såsom angiogenese, regulering af celleadhæsion og anafase-fremmende kompleks /cyclosom (APC /C) -afhængig proteasomalaktivitet ubiquitin-afhængigt protein katabolisk proces (se tabel 3) blev ikke beriget i den delmængde af gener, der deles af begge grupper. Interessant, blev disse 3 processer beriget med høje KN tumorer; Desuden har de rangeret først blandt de biologiske processer (tabel 4). Andre klynger beriget udelukkende i high-CN-gruppen, men ikke identificeret i den delmængde af fælles gener omfattede glycolyse, som andenplads, apoptose, og mRNA transport (se tabel 4). Disse data tyder på, at disse processer er tæt knyttet til gen-dosering. Processerne cytoskelet organisation, cellecyklus, og DNA emballage, om end ikke udelukkende, blev også beriget i gruppen af ​​gener associeret med høj KN tumorer, hvilket antyder, at nogle gener involveret i disse processer kan dereguleres ved gen-dosering. Alle disse biologiske processer, undtagen celleadhæsion og angiogenese, var forbundet med overudtrykte gener. Interessant, på højeste stringens, de processer af APC /C-afhængig proteasomalaktivitet ubiquitin-afhængigt protein katabolisk proces rangeret først, efterfulgt af glykolyse og DNA emballage (biologiske processer i kursiv i tabel 4). Erfaringsmæssigt er de fleste af de involverede i de biologiske processer, der er forbundet med høj-KN tumorer gener blev ikke CN ændret (figur 8). På den anden side blev der kun 2 klynger beriget i den delmængde af gener, der udelukkende dereguleret i lav-CN tumorer: celledifferentiering og forarbejdning og præsentation af peptidantigen via større histokompatibilitetskompleks klasse I (data ikke vist). Dette tyder på, at de fleste af de involverede i disse 2 processer gener dereguleret gennem andre end gen dosering mekanismer.

Vist er antallet af to-kopi eller CN-ændrede gener i ≤3 tumorer (grønne søjler) og CN -altered gener i ≥4 tumorer (blå søjler) blandt de biologiske processer, der er beriget i den delmængde af gener udelukkende dereguleret i høj KN tumorer.

for at undersøge om genekspressionsprofilerne af biologiske processer, der er forbundet med high-KN tumorer tillader adskillelse af tumorer enten ved CN eller ved biologiske processer selv, vi udførte et uovervåget hierarkisk clustering at klassificere 55 tumorer udforskes med HG 1.0 ST microarray (tabel 2), herunder de 27 tumorer udforskes for CN analyse, og 17 raske cervikale kontroller. Kun udtryk profiler af glycolyse og APC-afhængig proteasomalaktivitet proteinkatabolisk proces klart adskilt tumorerne i grupper med specifikke udtryk profiler (figur 9). I analysen af ​​glycolysen, viste dendrogram 3 hovedgrene: 1 med en stærk opreguleret profil, en anden med en kombination af svag op- og nedreguleret signaler, og en tredje med en stærk profil på nedregulering. Disse resultater viser heterogenitet i genet undertegnelsen af ​​denne biologiske proces i hele sættet af prøver. De fleste tumorer (81,8%) grupperet jævnt i de første 2 afdelinger, og et mindretal grupperet i den tredje gren (18,2%). Derimod blev alle men 3 kontroller grupperet i den tredje gren. Især blev der høj KN tumorer grupperet i den stærkt (60%) og kombineret (40%) opreguleres profiler, mens de lave KN tumorer grupperet hovedsageligt i nedreguleret (50%) og kombinerede (30%) profiler (p = 0,028 Fisher eksakt test, figur 9A)

Unsupervised hierarkisk klyngeanalyse af 55 CCS og 17 raske cervikale epitel prøver anvendes udtryk værdier af generne dereguleret fra glycolyse (panel A) og anafase-fremmende kompleks /cyclosom. (APC /C) -afhængig proteasomalaktivitet proteinkatabolisk fremgangsmåde (panel B) opnået med HG 1.0 ST microarray. Hver række repræsenterer et gen og hver kolonne repræsenterer en prøve. Prøver navn, der begynder med et “R” er CCs og med et “C” er kontrol; CCs sluttede i 1, 2 eller 3 hører til lav-, mellem- eller høje-KN-grupper, henholdsvis, mens de slutter med noget nummer ikke blev undersøgt for KN. Længden og opdelingen af ​​grenene repræsenterer forholdet mellem de prøver baseret på intensiteten af ​​genekspression. en. b. en. b. en.