PLoS ONE: CD133 /Src Axis medierer tumorfremkaldende Ejendom og Epithelial-Mesenchymale Overgang af hoved og hals Cancer

Abstrakt

Baggrund

hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) er et menneske dødelig cancer med kliniske, patologiske, fænotypiske og biologisk heterogenitet. Caner initierende celler (CICS), som er ansvarlige for tumorvækst og kombineret med gevinst på epitelial-mesenkymale overgang (EMT), er blevet identificeret. Tidligere vi beriget en delpopulation af hoved- og halscancer initierende celler (HN-CIC) med opregulering af CD133 og forbedring af EMT. Andre viser, at Src-kinase interagerer med og phosphorylerer det cytoplasmatiske domæne af CD133. Men den fysiologiske funktion af CD133 /Src signalering i HNSCCs ikke er blevet afdækket,.

Metode /Principal Finde

Heri vi bestemt den kritiske rolle CD133 /src akse modulerende stemness, EMT og tumorgenicitet af HNSCC og HN-CIC. I første omgang, nedregulering af CD133 reducerede signifikant selvfornyelse evne og udtryk for stemness gener, og fremmet differentiering og apoptotiske evne HN-CIC. Derudover knockdown af CD133 i HN-CIC også mindsket både

in vitro

maligne egenskaber, herunder celle migration /celle invasiv /forankring selvstændig vækst, og

in vivo

tumorvækst ved nøgne mus xenotransplantation assay. I modsat, overekspression af CD133 forbedret de stemness egenskaber og tumorigen evne HNSCCs. Endelig opregulering af CD133 øget phosphorylering af Src koblet med EMT transformation i HNSCCs, tværtimod stilhed CD133 eller behandling af Src inhibitor omvendt ophævet ovenfor fænotypiske effekter, der blev induceret af CD133 opregulering i HNSCCs eller HN-CIC .

Konklusion /betydning

Vores resultater foreslog, at CD133 /Src signalering er en regulerende switch at vinde i EMT og stemness egenskaber i HNSCC. Endelig kan CD133 /Src akse være et potentielt terapeutisk mål for HNSCC ved at eliminere HN-CIC’er

Citation:. Chen Y-S, Wu M-J, Huang C-Y, Lin S-C, Chuang T-H, Yu C-C, et al. (2011) CD133 /Src Axis medierer tumorfremkaldende Ejendom og Epithelial-Mesenchymale Overgang af hoved- og halscancer. PLoS ONE 6 (11): e28053. doi: 10,1371 /journal.pone.0028053

Redaktør: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: Juni 8, 2011; Accepteret 31. oktober, 2011; Udgivet: November 28, 2011

Copyright: © 2011 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse er støttet af forskningsbevillinger fra National Science Council (NSC95N444, NSC97N456, NSC99N024 og NSC100-2314-B-040-001), Taipei Veterans General Hospital (V97ER2018 og V98ER2018) og National Yang-Ming University (Undervisningsministeriet, formål for Top University Plan: 97ACD113, 97ACT302 og 98ACT302). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) er en af ​​de mest almindelige kræftformer i verden og en af ​​årsagerne til cancer-relaterede dødsfald som følge af behandling resistens [1]. Trods forbedringer i diagnose og behandling af HNSCC har de overordnede langsigtede overlevelsesrater forbedret marginalt i det seneste årti [2].

Akkumulerende data viser, at tumordannelse er drevet af en subpopulation af celler, der udviser selvfornyelse kapacitet-de påståede cancer stamceller (CSCS) eller kræft initierende celler (CICS) [3], [4]. CIC har vist sig at have kapacitet til at fremme tumorudvikling og metastase, og også bidrage til radio-resistens og kemo-resistens [5]. For nylig har vi og andre verificeret eksistensen af ​​CIC i HNSCC (HN-CIC) [6], [7], [8], [9]. Men der er mangel på beviser, hvordan cellens overflade signalering modulerende de intracellulære stemness egenskaber eller tumorgenicitet af HN-CIC.

CD133 (prominin-1), en 5-transmembrant glycoprotein, blev oprindeligt anerkendt som en bloddannende stamceller markør [10]. Følgelig CD133 er blevet betragtet som en vigtig celleoverflademarkør at repræsentere subpopulation af CIC i hjernetumorer, coloncarcinom, prostatacarcinom, hepatocellulært carcinom, thyroid carcinoma og hoved- og halskræft [8], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. Vi har tidligere påvist, at opregulering af CD133 i HN-CIC’er endvidere opreguleringen af ​​C133 i HNSCC cancervævet er negativt korreleret med overlevelsen prognosen for HNSCC patienter [8]. De seneste rapporter tyder også på, at ekspressionen af ​​CD133 i tumorvæv kunne tjene som en prognostisk indikator for tumor genvækst, ondartet progression, og patienten overlevelse [19], [20], [21]. Ikke desto mindre CD133-medieret molekylære mekanismer i reguleringen CIC i HNSCC er stadig uklar.

EMT, en cellulær transformation, der konverterer adhærerende epitelceller i migrerende mesenchymale celler, er kritisk for embryonisk udvikling og tumordannende progression af cancerceller og kræft metastase [22]. Forskere har vist, at EMT kunne fremme stamceller (SCS) egenskaber og yderligere generere celler med funktionerne i tumorfremkaldende ejendom [23], [24]. EMT program også væsentligt fastholdt tumorfremkaldende celler ejendom i HNSCC [6], [7], [25].

Src, en klassisk ikke-receptortyrosinkinase med potentiale til at forårsage transformation celle herunder ukontrolleret spredning og tab af kontaktinhibering, bliver aktiveret ved at interagere med de stimulerede membranreceptorer [26]. Det ekstracellulære signal ville blive yderligere forstærket, og transduceres gennem interaktion mellem aktiveret Src og nedstrøms mål som Ras /MAPK, PI3K /AKT og STAT3 veje [26]. Aktivering af Src afbryder celle-celle junction, fremmer invasionsevne gennem phosphorylering af β-catenin dermed forårsager nedbrydningen af ​​E-cadherin, og efterfølgende udløser EMT [27]. Endvidere Boivin et al viser, at CD133 er en roman bindende partner i Src og phosporylated af Src kinase [28].

De detaljerede molekylære mekanismer involveret i de regulatoriske forbindelser mellem EMT og stamceller gener såsom CD133 og Src stadig dårligt forstået. Heri demonstrerer vi en kritisk rolle for CD133 i styrkelsen af ​​stemness, gevinst på EMT, og fremme tumorgenicitet af HN-CIC. Derudover nedregulering af CD133 eller hæmning af CD133-induceret Src aktivering mindsker stemness egenskaber og tumorgenicitet af HNSCCs både

in vitro

in vivo.

Sidste ende vi demonstrerer betydningen af ​​CD133 /Src signalering på EMT proces HNSCC.

Materialer og metoder

cellelinjer dyrkning og berigelse af HN-CIC fra HNSCCs

To HNSCC cellelinjer, SAS [29] og OECM1 [30], blev dyrket i DMEM eller RPMI suppleret med 10% FBS (Grand Island, NY), hhv. En primær HNSCC cellelinje blev opnået fra HNSCC patient. Alle de kliniske prøver i denne undersøgelse blev godkendt og i overensstemmelse med Institutional Review Board of Chung Shan Medical University Hospital (CSMUH No: CSI0249). For berigelse af HN-CIC, de to cellelinier blev dyrket i tumor sfære medium bestående af serumfrit DMEM /F12-medium (GIBCO), N2 supplement (GIBCO), 10 ng /ml humant rekombinant basisk fibroblastvækstfaktor-basic (FGF ) og 10 ng /mL epidermal vækstfaktor (EGF) (R højre panel). Kontrollen IgG blev anvendt til at definere baseline signal i (B) og (D). Forsøgene blev gentaget tre gange, og de repræsentative resultater blev vist. Resultaterne er middel ± SD (*, p 0,05, ***, s 0,001)

Konstruktion af Lentiviral-medieret RNAi til silencing CD133

PLV-RNAi vektor. , som co-udtrykker GFP-protein i inficerede værtsceller, blev indkøbt fra Biosettia Inc. (Biosettia, San Diego, CA, USA). Fremgangsmåden til kloning af dobbeltstrenget shRNA sekvens er beskrevet i fabrikantens protokol. Lentivirale vektorer, der udtrykker shRNA som målretter human CD133 (oligonukleotidsekvens: Sh-CD133-1: 5′-AAAAGGACAAGGCGTTCACAGATTTGGATCCAAATCTGTGAACGCCTTGTCC-3 ‘; Sh-CD133-2: 5′-AAAAGGATACACCCTACTTACTATTGGATCCAATA GTAAGTAGGGTGTATCC-3′) blev syntetiseret og klonet ind pLVRNAi at generere en lentiviral ekspressionsvektor. Sh-Luc: 5’-CCGGACTTACGCTGAGTACTTCGAA CTCGAGTTCGAAGTACTCAGCGTAAGTTTTTTG-3 ‘blev anvendt til eksperimentel kontrol. Lentivirus produktion blev udført som ovenfor. Stabil PLV-RNAi udtrykte HNSCC cellelinjer blev yderligere oprenset ved cellesortering med GFP-positive celler (Figur S1c).

Side populationsanalyse

For side befolkning analyse enkelt HNSCC celler suspension på 1 × 10

6 /ml blev fremstillet i forvarmet DMEM-medium med 2% føtalt bovint serum (FBS). Hoechst 33342 farvestof blev derefter tilsat ved en endelig koncentration på 5 ug /ml i nærvær eller fravær af fumitremorgin C (FTC) (10 uM, Sigma, St. Louis, MO, USA) og blev inkuberet ved 37 ° C i 90 min med intermitterende rystning. Cellerne blev vasket med iskold HBSS med 2% FBS og centrifugeret ved 4 ° C, og resuspenderes i den samme buffer. Propidiumiodid i en endelig koncentration på 2 ug /ml blev tilsat til gating levedygtige celler. Hoechst 33342 farvestof blev anslået ved 357 nm og dens fluorescens var dobbelt bølgelængde analyseres (blå, 402-446 nm; rød, 650-670 nm). Analyserne blev udført på en FACS Vantage (BD, San Diego, CA, USA) [6].

Apoptotisk Assay

apoptotiske celler blev påvist med et Annexin V-APC kit (Calbiochem, Darmstadt , Tyskland) ifølge producentens vejledning. Efter farvning af cellerne inkuberet med 20 pg /ml propidum iodid (PI) blev analyseret ved FACS Calibur-apparat (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA) [6].

In vitro cellemigrering og invasion assay

for transwell migration analyser, 2 × 10

5 celler blev udsået i toppen kammer i et Transwell (Corning, Acton, MA) med en porøs membran (8,0 um porestørrelse). Celler blev udpladet i medium med lavere serum (0,5% FBS), og medium suppleret med højere serum (10% FBS) blev anvendt som en kemoattraktant i det nedre kammer. Cellerne blev inkuberet i 24 timer ved 37 ° C og celler, som ikke migrerer gennem porerne blev fjernet ved en vatpind. Celler på den nedre overflade af membranen blev farvet med Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich) for at vise kernerne; fluorescens blev detekteret ved en forstørrelse på 100x under anvendelse af et fluorescensmikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland). Antallet af fluorescerende celler i en total på fem tilfældigt valgte felter blev talt. In vitro celleinvasion analyse blev beskrevet tidligere [8].

blød agar kolonidannende assay

Hver brønd (35 mm) af en seks-brønds dyrkningsplade blev coatet med 2 ml bottom agar ( Sigma-Aldrich) blanding (DMEM, 10% (v /v) FCS, 0,6% (w /v) agar). Efter det nederste lag blev størknet, 2 ml topagar-medium blanding (DMEM, 10% (v /v) FCS, 0,3% (w /v) agar) indeholdende 2 × 10

4-celler blev tilsat, og skålene blev inkuberet ved 37 ° C i 4 uger. Plader blev farvet med 0,005% krystalviolet derefter kolonierne blev talt. Det samlede antal kolonier med en diameter ≥100 um blev talt over fem felter pr godt for i alt 15 felter i tredobbelte eksperimenter.

Subkutan xenografter i nøgne mus Salg

Alle dyret praksis denne undersøgelse blev godkendt og i overensstemmelse med Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) for National Yang-Ming University, Taipei, Taiwan (IACUC godkendelse nr 961.230). Stabil sh-Luc og sh-CD133 HN-CIC eller kontrol GFP og CD133-overexpresiing HNSCCs blandet med Matrigel (BD Bioscience, San Diego, CA, USA) (1: 1) blev injiceret subkutant i BALB /c nøgne mus (6- 8 uger). Tumor volumen (TV) blev beregnet ved hjælp af følgende formel:. TV (mm

3) = (længde × bredde

2) /2

Statistisk analyse

Statistisk Pakke af social Sciences software (version 13.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL) blev anvendt til statistisk analyse. Studerendes

t

test blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans af forskellene mellem eksperimentelle grupper;

s

værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Niveauet af statistisk signifikans blev sat til 0,05 for alle tests.

Resultater

nedregulering af CD133 reducerer stemness egenskaber kombineret med øget differentiering og apoptotiske kapaciteter i HN-CIC

Vi har identificeret en delpopulation af hoved- og halscancer initierende celler (HN-CICS) med forbedrede stemness egenskaber fra HNSCC celler (HNSCCs) ved sfære dannelse assay [8]. Derudover vi og andre vise opregulering af CD133 i HN-CIC [8], [31], [32]. For yderligere at undersøge, om CD133 spiller en rolle i at opretholde CICS egenskaber HN-CIC, tilgangen af ​​tab af funktion af CD133 blev først gennemført. Nedregulering af CD133 i HN-CIC blev opnået ved viral transduktion med lentiviral vektor, der udtrykker lille hårnåle-RNA (shRNA) målretning CD133 (sh-CD133-1 og sh-CD133-2), og lentiviral vektor, der udtrykker shRNA mod luciferase (SH- luc) blev anvendt som kontrol. Immunoblotting analyser bekræftede, at lentivirus udtrykker både sh-CD133-1 og sh-CD133-2 markant reduceret ekspressionsniveauet af CD133-proteinet i transducerede HN-CIC (figur 1A). Cell befolkning med overflade CD133-positive (CD133

+) blev også reduceret i sh-CD133 inficerede HN-CIC ved FACS analyser (figur 1B). Desuden HN-CIC inficeret med sh-CD133 lentivirus ikke opretholde flydende kugler, men viste mere vedhæftede epitel-lignende celler (figur 1C). Vi observerede også reduceret ekspression af stemness gener (okt-4 og NANOG) (figur 1A), men den forøgede ekspression af epitheldifferentiering markering, CK18 (figur 1 D) i CD133 knockdown HN-CIC. For yderligere at fastslå, om reduktionen i tumor sfære dannelse effektivitet med CD133 nedregulering var på grund af nedsat HN-CIC’er overlevelse undersøgte vi de apoptotiske celler under anvendelse af Annexin V plus propidiumiodid (PI) farvning. HN-CIC inficeret med sh-CD133 udtrykker lentivirus steget betydeligt procentdelen af ​​Annexin V

+ /PI

+ celler (Figur 1E). Tilsammen udgør disse data understøtter endvidere, at nedregulering af CD133 resulterede i en reduktion af CICS ejendomme og cellernes levedygtighed i HN-CIC.

Målretning CD133 ophæver in vitro og in vivo maligne egenskaber af HN-CIC

for at belyse den direkte virkning af CD133 knockdown på

in vitro

maligne egenskaber, herunder evner celle migration, matrigel invasion og forankring uafhængig vækst i HN-CIC, enkelt celle suspension af kontrol- eller CD133

–

knockdown HN-CIC blev udpladet på Transwell kammer (figur 2A), Transwell kammer overtrukket med matrigel (figur 2B) eller i blød agar (figur 2C), og analyseret. De vandrende /invasion /kolonidannelse evner CD133 knockdown HN-CIC blev væsentligt reduceret (figur 2A, 2B og 2C). Vi næste forsøgt at afgøre, om nedregulering af CD133-ekspression kunne dæmpe tumorigen evne HN-CIC

in vivo

. Notatet hæmning af CD133-ekspression betydeligt bremset tumorvækst medieret af HN-CIC (figur 2D og 2E; p 0,05; p 0,01). Derudover immunhistologisk farvning af tumorer afledt af sh-CD133 HN-CIC’er viste fald i Oct4 og forøgelse af CK18 i forhold til dem fra kontrol HN-CICS tumorer (Figur S2a og S2b). Samlet set vores data viser, at udtømning af CD133 hæmmer tumorfremkaldende aktivitet af HN-CIC

in vivo

.

For at belyse evnen til celle migration (A), celle invasivitet (B) og forankring uafhængig vækst (C) af HN-CIC (OECM1 (

øverste panel

), SAS (

nederste panel

)) med CD133 nedregulering, enkelt celle suspension af HN-CIC smittet med CD133 -specifikke shRNA eller kontrol sh-Luc lentivirus i tre dage blev udpladet på transwell, transwell overtrukket med matrigel og blød agar henholdsvis og analyseret som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultaterne er middelværdier ± SD af tredobbelte prøver fra tre forsøg. (D) Repræsentative tumorer af kontrol HN-CIC og af CD133-knockdown SAS-afledte HN-CIC blev genereret, og tumorerne blev derefter dissekeret fra det subkutane rum recipientmus (n = 3) (fase kontrast:

venstre to paneler

; GFP imaging

: højre to paneler

) (Røde pile: sh-Luc HN-CIC, Gule pile: sh-CD133-1 HN-CICS). (E) Tumorvolumen blev målt henholdsvis efter podning med CD133-knockdown eller sh-Luc-udtrykkende SAS-afledte HN-CIC. Fejlsøjler svarer til SD. (*, P 0,05, ***, s 0,001)

Overekspression af CD133 forbedrer stemness egenskaber og tumorigene potentialer HNSCCs

For yderligere at undersøge virkningen af ​​CD133 up- forordning om biologiske egenskaber HNSCCs, genereret vi stabile CD133-overekspression HNSCCs gennem lentiviral-medieret transduktion. Den vellykkede infektion på kontrol-GFP og CD133-overekspression HNSCCs, bagefter cellen sortering, varierede fra 93 til 94% (OECM1) og 97 til 91% (SAS), henholdsvis (figur S1A og S1B). De to CD133-overekspression HNSCCs (OECM1 og SAS), der vises forhøjet udtryk for CD133 ved Western blot analyser (figur 3A). Endvidere fandt vi, at sammenlignet med GFP udtrykkende kontrolceller de CD133-overudtrykker HNSCCs viste signifikant forøgelse af CD133

+ -celler ved FACS-analyser (figur 3B). Desuden viste CD133-overekspression HNSCCs forbedret tumor sfære-dannende kapacitet (figur 3C) og væsentlig forøgelse af side befolkning (SP) celler (Figur 3D). Vi bemærkede også, at øget protein niveau af Oct-4 og Nanog af CD133-overekspression HNSCCs under dyrkning med defineret serum-frit medium (figur 3E). Dernæst viste vi, at overekspression af CD133 resulterede også i øget evne på celle invasionsevne og kolonidannelse af HNSCCs (4A og 4B). At bemærke, CD133-overudtrykker HNSCCs viste også signifikant forhøjet tumorigenicitet i sammenligning med kontrol HNSCCs ved xenotransplantation analyser

in vivo

(figur 4C; p 0,05; p 0,01). Desuden analyser IHC påvist, at tumorer afledt af CD133-overudtrykkende SAS celler udviste mere Oct4 men mindre CK18-farvning (fig S2C). Kollektivt antyder disse resultater, at overekspression af CD133 fremmer stemness egenskaber og tumorigenicitet af HNSCCs.

(A) Ekspression af CD133-proteinet i HNSCCs inficeret med enten CD133-overudtrykkende eller kontrol GFP lentiviruse blev undersøgt ved western blot. Mængden af ​​GAPDH protein blev henvist som lastning kontrol. (B) Cell overflade CD133 ekspression i CD133-overudtrykkende eller kontrol HNSCCs blev analyseret ved flowcytometri. (C) Repræsentative billeder af tumor sfære dannelse evne kontrol-GFP eller CD133-overekspression HNSCCs. (D) Enkelte cellesuspensioner af stabile CD133-overudtrykkende og kontrol GFP-udtrykkende HNSCCs blev inkuberet med Hoechst 33342 i nærvær eller fravær af 10 uM fumitremorgin C (FTC), derefter analyseret ved flowcytometri for at identificere de SP-celler. (E) Total rå celle ekstraherede proteiner fra kontrol-GFP eller CD133-overekspression HNSCCs under dyrkning med defineret serum-frit medium i 2 uger blev forberedt og immunoblottedes mod anti-Oct-4, anti-Nanog, anti-CK18 eller anti-GAPDH antistoffer som indikeret. Mængden af ​​GAPDH protein af forskellige rå celleekstrakter blev omtalt som lastning kontrol for yderligere kvantificering.

Src kinase er nedstrøms modulator af CD133 om regulering af EMT i HNSCC og HN-CIC

HNSCC epitelceller kan erhverve mesenchymale træk, som letter migration og invasion gennem EMT-processen [7], [33]. I figurerne 4A, vi viste, at CD133 fremmer invasiv evne HNSCCs, så ønskede vi at undersøge, om CD133 ville modulere EMT vej. Morfologisk observation indikerede, at overekspression af CD133 i epitel-type OECM1 celler afslørede mesenchymal-lignende form ændring (figur 5A). Immunofluorescens og immunoblotting-farvning viste, at en epitel-lignende protein ekspressionsmønster (E-cadherin) blev reduceret, men en mesenchymal-lignende protein ekspressionsmønster (vimentin og fibronectin) var forøget i CD133-overudtrykker HNSCCs (figur 5B). På den anden side, nedregulering af CD133 reduceret mesenkymale markør (vimentin), men inducerede epitheliale markører (E-cadherin) i HN-CIC (figur 5C).

(A) invasionsevne evne af kontrol-GFP eller CD133 -overexpressing HNSCCs blev undersøgt som beskrevet i materialer og metoder (*, p 0,05, ***, s 0,001). (B) Anchorage-uafhængig vækst af kontrol-GFP eller CD133-overekspression HNSCCs blev analyseret (**, p 0,01, ***, s 0,001). (C) Repræsentant tumorvækst af kontrol-GFP eller CD133-overekspression HNSCCs (1X10

5 celler) i det subkutane rum modtagende mus (Røde pile: kontrol-GFP HNSCCs, gule pile: CD133-overekspression HNSCCs) (

venstre panel

). Tumor volumen blev målt efter podning af kontrol-GFP (n = 3) eller CD133-overekspression HNSCCs (n = 3), henholdsvis (

højre panel

). Fejllinjer svarer til SD (*, p 0,05, **, p 0,01).

(A) Morfologisk forskel mellem kontrol-GFP og CD133-overekspression HNSCCs. (B) Immunoblotting analyse (

højre panel

) og konfokal immunofluorescens farvning (

venstre panel

) af EMT-relaterede markører i kontrol-GFP eller CD133-overekspression HNSCCs blev analyseret. (C) De proteinniveauer af vimentin og E-cadherin i den angivne HN-CIC blev analyseret ved western blot. (D) Protein niveau af Src eller p-Src i kontrol-GFP eller CD133-overekspression HNSCCs blev analyseret ved immunblotting. (E) Enkelt celle suspension af HN-CIC blev inficeret med sh-Luc-udtrykkende eller shRNAi CD133 lentirus henholdsvis og ekspressionen af ​​Src eller p-Src i ovennævnte HN-CIC blev analyseret ved western blot. (F) CD133-overudtrykkende HNSCCs blev først behandlet med 10 pM PP2 (Src inhibitor) eller 10 pM U0126 (Erk inhibitor) i 24 timer. Ekspressionen af ​​Src, p-Src, Erk1 /2, p-ERK1 /2-, vimentin, E-caherin eller CK-18 ovenfor behandlede celler blev evalueret ved Western blot analyse med GAPDH er et internt loading kontrol. (G) CD133-overudtrykkende HNSCCs blev først dyrket med defineret serum-frit medium i 2 uger sammen med tilsætningen af ​​PP2, og ekspressionen af ​​Oct-4, Nanog, eller GAPDH-proteiner i kontrol (DMSO) eller PP2 behandlede celler blev analyseret ved immunblotting.

Src signalvejen er en vigtig formidler af EMT i HNSCC (figur S3A) [34]. Fujimoto et al har vist, at tyrosin-513 inden for CD19 er ikke kun Lyn (a Src familie kinase) bindingssted men også phosphorylering side, yderligere, vil interaktionen mellem CD19 og Lyn amplificere Src-familien kinaseaktivitet og nedstrøms kaskade [35]. Boivin et al har vist, at CD133 er et hidtil ukendt bindingspartner Src og phosporylated af Src-kinase [28]. Men hvordan samspillet mellem CD133 og Src kinase aktivere de nedstrøms virkninger, herunder forstærkning af Src aktivitet fortsat uklare? Her viste vi, at p-Src (aktiveret Src med phosphorylering) blev forøget i CD133-overekspression HNSCCs (Figur 5D). Tværtimod CD133 inaktivering reduceret aktivt Src i HN-CIC (figur 5E). Konsekvent, behandling af Src inhibitor (PP2), men ikke ERK1 /2-inhibitor (U0126) signifikant vendt mesenchymale-lignende protein ekspression mønster i en epitel-lignende én, og forøget ekspression af cytokeratin 18 (CK18), en differentiering markering, i CD133-overudtrykkende OECM1 celler (figur 5F). Overekspression af CD133 fremmer phosphorylering af ERK1 /2-i humane glioblastom-celler [36], men i vores CD133-overudtrykkende HNSCCs, behandling af ERK1 /2-inhibitor (U0126) forårsagede kun lille indflydelse på CD133-overudtrykkende induceret EMT (figur 5F og data ikke vist). Endelig PP2 behandling reducerede stemness markører (Oct4 og NANOG) og også svækket sfære dannelse evne CD133-overekspression HNSCCs under dyrkning med defineret serum-frit medium (figur 5G og data ikke vist).

CD133 nedregulering og Src hæmning ophæve p-Src aktivitet og sfære dannelse evne i den primære HN-CIC

for yderligere at verificere den fysiologiske funktion af CD133 /src akse medieret signalering i primær HN-CIC, de HN-CIC afledt af den primære HNSCC patient celler blev dannet. Endvidere blev ekspressionen af ​​CD133 i HN-CIC nedreguleres ved lentiviral-sh-RNAi. Konsekvent blev p-Src-aktivitet også nedreguleret (figur 6A). Desuden blev den sfære dannelse evne sh-CD133 primære HN-CIC’er faldet sammenlignet med den for kontrollen (sh-Luc) primære HN-CIC (figur 6B). Endelig PP2 (hæmmer af Src aktivitet) behandling til primær HN-CIC afskaffet også kuglen dannelse kapacitet (figur 6C).

(A) Protein niveau af CD133 og p-Src af lentivius medieret CD133 knockdown primære HN -CICs blev analyseret ved western blot. (B) Primær HN-CIC blev først inficeret med sh-Luc eller CD133-shRNA lentivirus. Tre dage efter den lentivirale infektion blev sfære dannelse evne virusinficerede celler derefter dyrkes under selektionsmedium registreres. (C) Nyligt beriget primær HN-CIC blev behandlet med PP2 (10 uM) i 72 timer og kuglen dannelse evne PP2 behandlede HN-CICS celler blev undersøgt. Pile angav de kugle celler.

I resumé, vores resultater foreslog, at CD133 /Src signalering spiller en stor kontakt på regulering CICS egenskaber, EMT transformation og tumorgenicitet af HNSCCs (figur 7).

Up-regulering af CD133 dermed aktiverer Src signalering (p-Src), så fremmer gevinst på EMT, forbedring af stemness egenskaber og tumorigenicitet i HNSCC.

diskussion

tumor er sammensat af en heterogen population af celler, og det er blevet observeret, at en subpopulation af celler, såkaldte cancer stamceller (CSCS) eller cancerceller initierende celler (CICS) inden tumorvæv besidder stemness egenskaber [37]. CSCS eller CIC anses for at være ansvarlig for initiering, spredning og metastaser af tumorer [38], [39], [40]. Vigtigt er det, kan eksistensen af ​​CIC forklare cancer tilbagefald på grund af radioresistance eller kemoresistens efter den kliniske behandling på kræftpatienter [5].

CD133, en celleoverflademarkør af hæmatopoietiske stamceller og endotele stamceller er blevet foreslået at være involveret i angiogenese samt kræft tumorigenicitet [41]. CD133 er for nylig blevet identificeret som en fælles CIC markør for mange tumortyper, herunder HNSCC [8], [31]. Bao et al. finder, at subpopulationen af ​​CD133

+ -celler isoleret fra hjernetumorer udviser CICS egenskaber, er resistente kemo- eller strålebehandling, og fremme angiogenese at lette hjernetumor vækst [42]. I mellemtiden, CD133

+ CIC i solide tumorer karakteriseret giver resistens over for kemoterapi [43]. Tværtimod CD133 depletion undertrykker kolonidannende evne for tyktarmskræft [44]. Derfor bedre forståelse af de biologiske karakteristika af CD133

+ CIC kan forklare den fejlslagne kræftbehandlingen, og vil give os nye terapeutiske tilgange [45].

Heri evaluerede vi rolle CD133 i opretholdelse af stemness karakteristika og tumorigent potentiale HNSCCs og HN-CIC ved lentiviral-medieret knockdown eller overekspression af CD133 (figur 1 og 3). Udtømning af CD133 fremmet differentiering og faldt i

n vivo

tumorigene egenskaber af HN-CIC (Figur 1 og 2). Henviser, overekspression af CD133 forbedrer tumor kugle-dannende evne, side population celler, stemness gener ekspression (Oct4 og Nanog) og fremmer tumorigen evne HNSCC (figur 3 og 4). Kollektivt, vores data demonstrerede først den afgørende rolle, CD133 i stænglen-lignende forbedring og tumorigenese af HNSCC og HN-CIC.

EMT, en de-differentiering program, der konverterer vedhængende epitelceller i individuelle migrerende celler, er kritisk for embryonisk udvikling, den onkogene progression af tumorceller, og cancermetastase [22]. Forbedret EMT karakteristisk er forbundet med dårlig samlet og metastase overlevelse hos patienter med HNSCC [33]. Enkelt eller kombineret overekspression af stemness faktorer, herunder Oct-4 og Nanog, var forbundet med cancer stamceller-lignende egenskaber og EMT [46], [47]. Derudover er aktiveringen af ​​Src ofte forbundet med human cancer, fordi der er tegn på en fremtrædende rolle Src i EMT og udvikling af metastaser. Endvidere CD133 er blevet beskrevet som et substrat for Src.