PLoS ONE: trækkræfter stammer fra Cancer Spheroids Lette Tumor Invasion

Abstrakt

De mekaniske egenskaber af tumorer og tumor miljø giver vigtig information til progression og karakterisering af kræft. Tumorer er omgivet af en ekstracellulær matrix (ECM) domineret af kollagen I. De geometriske og mekaniske egenskaber af ECM spiller en vigtig rolle for det indledende trin i dannelsen af ​​metastaser, forelagt af migrering af maligne celler til nye bebyggelser samt det vaskulære og lymfatiske system. Omfanget af denne celle invasion ind i ECM er en vigtig medicinsk markør for cancer prognose.

In vivo

undersøgelser viser en øget stivhed og anderledes arkitektur tumorvæv i forhold til sine sunde modparter. Den observerede parallel kollagen organisation på tumor grænsen og radial arrangement på invasionen zonen har rejst spørgsmålet om mekanismerne organisere disse strukturer. Her studerer vi effekten af ​​kontraktile kræfter stammer fra model tumor sfæroider indlejret i en biomimetisk kollagen I matrix. Vi viser, at kontraktile kræfter virker umiddelbart efter såning og deformere ECM, hvilket fører til trækstyrke radiale kræfter i matricen. Afslapning af denne spænding via skære collagen gør reducere invasion, der viser en mekanisk forbindelse mellem den strækbare tilstand ECM og invasion. Til gengæld disse resultater antyder, at trækkræfter i ECM lette invasion. Desuden samtidig sammentrækning af ECM og tumorvækst fører til kondensation og omlægning af kollagen ved sfæroid overflade. Vi foreslår en spænding-baserede model til at forklare kollagen organisation og påbegyndelsen af ​​invasion af kræfter stammer fra tumoren

Henvisning:. Kopanska KS, Alcheikh Y, Staneva R, Vignjevic D, Betz T (2016) Trækstyrke kræfter hidrørende fra Cancer Sfæroider Lette tumorinvasion. PLoS ONE 11 (6): e0156442. doi: 10,1371 /journal.pone.0156442

Redaktør: Adam J. Engler, University of California, San Diego, USA

Modtaget: December 28, 2015; Accepteret: 13. maj 2016 Udgivet: 7 Juni 2016

Copyright: © 2016 Kopanska et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Data kan tilgås fra:. https://osf.io/up847/

Finansiering: Dette arbejde har modtaget støtte under programmet «Investissements d’Avenir» lanceret af den franske regering og gennemført af ANR med referencerne ANR – JCJC SVSE 5 2011 (TB) og LABEX CelTisPhyBio ANR-10-LBX-0038 ANR-10-IDEX-0001-02 PSL (TB, KK og DV), Cells-in-Motion Cluster of Excellence (EXC 1003 – CIM) , University of Münster, Tyskland (TB), Institut Thématique Multi-organismes Kræft – Plan Kræft 2014-2019 og Ecole Doctorale Frontières du Vivant (FDV) – program Bettencourt (RS). Den intravital billeddannelse blev støttet af Fondation pour la Recherche Médicale (FRM nr DGE20111123020), er Cancerople-IdF (n ° 2012-2-EML-04-IC-1), Inca (Cancer National Institute, n ° 2011-1 -mærket,-IC-4), og SiRIC (INCA-DGOS- 4654), PICT-IBiSA og Nikon Imaging center @ CNRS-Institut Curie

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Metastase er en væsentlig dødsårsag for kræftpatienter og slutresultatet af en flertrins proces, der involverer lokal tumor invasion, formidling af tumorceller til fjerne organer og en tilpasning til forskellige væv [1]. Mekanismerne i invasion er ofte blevet undersøgt i fortiden [2]. Invaderende celler ofte vise karakteristiske Epithelial til Mesenchymale Transition (EMT) markører, såsom ned- regulering af E-cadherin og opregulering af vimentin, og miste nogle epitel egenskaber, såsom apical- basal polaritet [3].

tumormikromiljøet er kendetegnet ved markante mekaniske egenskaber sammenlignet med raske væv. Ekstracellulære matrix (ECM), hovedsagelig bestående af kollagen [4], akkumulerer i tumor stroma og den er ansvarlig for stivhed stigning observeret i mange tumorer [5]. Tumor progression er også ledsaget af et særskilt kollagen arkitekturer [6], betegnes tumorassocierede kollagen signaturer (TAC’er), som er blevet korreleret til patientens prognose. Indledningsvis er der en stigning i kollagen mængder i det omgivende væv (TAC-1). I de senere stater collagenfibre blive rettet ind parallelt med tumoren overflade (TAC-2) [4-6]. Endelig i invasive tumorer, der findes, collagenfibre skal justeres vinkelret på tumor grænse (TAC-3), som også korrelerer med retningen af ​​cellulær invasion [7]. TAC er blevet beskrevet som en prognostisk markør for patientens overlevelse [5]. Tilsvarende er en stærk sammenhæng mellem metastatisk potens og intratumoral matrix tilpasning, herunder radiale og parallel opretning af kollagen fibre blevet beskrevet i kolorektal cancer musemodel [8]. En positiv feedback mellem tumor medierede ændringer i collagen og kræft samt cancer associeret celletyper er blevet foreslået [9], hvilket kan forklare den stabile og reproducerbare forekomsten af ​​disse kollagenstrukturer.

modifikationer af tumor stroma vides at være et resultat af biokemiske /enzymatiske processer, hvor cancerceller samt cancer associeret fibroblaster (CAF) spiller en central rolle i nedbrydning og remodellering af matricen [8,10-12]. Denne biokemiske remodeling er blevet grundigt undersøgt og afhænger af nedbrydning af matrixmetalloproteinaser (MMP’er) og ECM stivhed ved lysyloxidase (LOX) [10]. Afstivning af matrixen blev foreslået at være den drivende faktor for invasion [13], men nyere undersøgelser identificerer matrixen porestørrelse snarere end stivhed som den kritiske egenskab modulerende cancercelleinvasion [14,15]. Her fat vi spørgsmålet, i hvilket omfang en ren mekanisk ombygning af tumor ECM kan genereres af de kræfter, der anvendes af tumorcellerne på ECM. Sådanne trækkræfter på ECM, der oprettes enten af ​​kræftcellerne selv, eller ved cancer associerede fibroblaster (CAF) vides at bidrage til matrixen afstivende og fiberen tilnærme tumoren [16-23].

på grund af den rumlige kompleksitet tumor 3D miljø, regulering og resultatet af trækkraft kræfter på kollagen er vanskelige at studere

in vivo

. Men de seneste fremskridt i udviklingen af ​​pålidelige 3D

in vitro

kræftmodeller, tillade dissektion af en mekanisk remodeling proces. Især har flercellede kræft sfæroider indlejret i ECM vist sig nyttigt at studere invasion [24,25]. Undersøgelser med disse 3D sfæroide-modeller viste, at cellerne aktivt ændrer den omgivende matrix ved mekanisk tilpasning og belastning afstivning [26]. I hjernen tumor sfæroide systemer, har både kompressionstryk og spændinger på matrixen mikromiljø blevet vist at være forbundet med tumorens invasive dynamik [27]. De detaljerede dynamik og korrelation mellem den mekaniske remodellering og invasion er endnu ikke blevet undersøgt. Derudover viste undersøgelser at mekanisk tryk og ECM elasticitet regulere vækst af sfæroider [28,29]. Salg

Tidligere undersøgelser viste, at enkelte kræftceller udøve trækkræfter på fibrillære matrixproteiner, der fører til ECM deformation [12]. Analyse af kollagen fiber tilpasning

in vivo

in vitro

havde foreslået, at kræfter, der stammer fra tumoren klumpformet er vigtige for denne tilpasning [7,20,21,23]. Mens kontraktile kræfter er blevet observeret i den enkelt celle sammenhæng at omarrangere kollagen fibre [12,30], væksten af ​​en tumor snarere foreslår skubber af ECM ved tumor overflade, som effektivt komprimerer kollagen matrix. Derfor kan to bidrag kompression isoleres, en skubbende kraft på grund af tumorvækst og en trækkraft, der påføres ved cancercellerne på ECM. På tumor overflade kollagen kan spænde, men også bryde eller blive nedbrudt. Virkningen af ​​kontraktilitet i andre cellesystemer, såsom fibroblaster er blevet godt undersøgt, hvor det blev vist, at kollagen sammentrækning skaber mønstre af spænding og fibre “alignment, som letter cellemigrering [31-33]. Betydningen af ​​spændinger i celle migration er også leveret af undersøgelser på dyrkning fibroblaster i flydende, lav spænding 3D geler samt forankret (behersket), høj spænding geler [34,35].

Det primære formål med arbejde i dette papir er at undersøge effekten af ​​tumor-medierede ECM s sammentrækning og at vise, at spændingen er genereret og påvirker celle invasion.

Resultater

Tre-dimensionel model af kræft celle invasion

for at undersøge invasion af kræftceller i ECM vi brugte en tidligere beskrevet 3D kollagen invasion assay, der var tilpasset til vores eksperimenter (S1A og S1B fig) [25,36]. Sfæroider afledt fra den murine koloncarcinomcellelinie CT26 [37], transficeres stabilt udtrykke cytoplasmatisk GFP, registreres ved spinding disk mikroskopi at visualisere invasion. CT26-celler er karakteriseret ved en mesenchymal fænotype, især ved manglende E-cadherin-ekspression [37]. Derfor har de en meget høj invasiv potentiale og som de støder på et gunstigt miljø (ECM) de migrerer ud af klumpformet. Multicellulære sfæroider blev dannet ved anvendelse af en klassisk agarose pude protokol og indlejret i kollagen type I bundet til overfladen af ​​skålen (S1B Fig). Kollagengel blev polymeriseret ved stuetemperatur (≈22 ° C) for at tilvejebringe matrixarkitektur sammenlignes med

in vivo

. Geraldo et al. viste, at kollagen polymeriseret

in vitro

i stuetemperatur ligner fibre fundet

in vivo

i dyremodeller med et netværk bestående af en blanding af et par tynde bundter og mange tykke bundter varierende fra 0,72 op til 1,56 um tykkelse. I modsætning hertil collagen polymeriseres i 37 ° C viste ikke ligheder til dyrevæv [38]. I vores undersøgelse blev valgt den fysiologisk mere relevant polymerisation tilstand ved stuetemperatur (S1c Fig og S1 film) [25]. Dette er endvidere støttet af

in vivo

studie i mus tyktarmskræft, hvor vi observere organisation ligner den rekonstituerede system, der anvendes her.

Fig 1A viser repræsentative konfokal fluorescens billeder (3D-projektion) af en GFP-CT26 sfæroide, hvor celler formidler fra klumpformet i ECM, dermed efterligne invasion.

(a) Radial profil sfæroide s GFP fluorescens over 72 timer invasion i collagen type I. Forskellige zoner af sfæroide kan skelnes: mørkt område, der tidligere er beskrevet som nekrotisk kerne (stiplet linje), proliferativ rand (stiplet linie) og invasion (linje og skraverede område). Indsæt: repræsentativt billede af sfæroide (GFP) 24 timer efter podning. Scale bar: 100 um. (B) Morfologi ændringer over tid af forskellige størrelser sphæroider podet i i kollagen type I. Spheroids blev afbildet i lyse felt og fluorescens (GFP). Målestok: 200 um. (C) Vækst kinetik spheroids for tre forskellige indledende størrelser ( 300 um, 350-400 um og 400 um). Værdier er gennemsnit ± standardafvigelse for n = 6-12 fra tre uafhængige forsøg.

Sfæroider stigning i størrelse (fig 1B) som følge af celleproliferation. Som vist ved Alessandri et al. [36], kernen i CT26 sfæroider er nekrotisk, ligner andre sfæroide systemer. I modsætning hertil celler ved randen aftages og invadere ind i collagen. I radiale profiler af GFP-fluorescens kan observeres den tidsafhængige udvikling af forskellige zoner. Ved t = 0h (Fig 1A, gul) fluorescensen i den indre sfæroid er kun lidt mindre end ved grænsen. Men efter 24 timer tre zoner er tydelige, (Fig 1A, rød): det nekrotiske kerne (det mørke område inde i sfæroide lav signalintensitet), den proliferative rand (signal intensitetstoppe), og invasion zone (skraverede område). Disse funktioner efterligne morfologi

in vivo

tumorer [24].

For at vælge den optimale indledende størrelse spheroids der ville indeholde tre forskellige zoner, vi analyserede vækst (Fig 1C) og invasion af sfæroider af tre forskellige diametre, nemlig 450 um, 350 um og 250 um (fig 1B). Det mørke område i mindre sfæroider (250 um) bliver synlig efter ca. tre dage, hvor sfæroiden har nået 300 um i diameter (Fig 1B), mens større sfæroider udvikle kernen allerede efter én dags dyrkning i kollagen. For at teste om den oprindelige størrelse af sfæroider påvirker invasionen, vi kvantificere invasionen område for sfæroider af forskellige initiale diametre og finder ingen betydning afhængighed af den relative invasion område på den oprindelige klumpformet størrelse (p-værdi 0,05) (data ikke vist ). Da de små sfæroiderne viser fortsat vækst og give letteste adgang til 3D-billedbehandling, vi udelukkende bruger sfæroider mellem 300-350 um i indledende størrelse for denne undersøgelse.

Kræftceller kontrakt kollagen netværk

At studere den dynamiske omlægning af kollagen matrix under invasionen vi optrådt live billeddannelse med en tidsopløsning på 1 time over 24 timer (S2 Movie). Sfæroiden indledende størrelse stiger over tid (figur 2A, lyse felt og GFP) og i 9 timer første celler observeres at forlade klumpformet (begyndende invasion) (fig 2A hvid pil). Fordelingen af ​​invaderende celler efter 24 timer er ensartet omkring sfæroid.

(A) Image sekvens af CT26-GFP (grønt) celleinvasion i TAMRA-mærket collagen type I (rød). Celler initiere invasion (hvid pil) efter ca. 9 timer (indtræden af ​​invasion). Scale bar: 50 pm. (B) Kymographs af kollagen og celler fra billedsekvensen (S2 Film). Billeder blev taget hver time i 24 timer. Scale 50 um og 3 timer. (C) forstørrelse af boxed region viser bevægelse af collagenfibrene mod sfæroid. Den kymograph illustrerer de to antagoniserende bevægelser kompression på grund af klumpformet vækst (tæt på klumpformet, blå pil og blå linje), og kollagen sammentrækning i invasionen zone (striber hen mod klumpformet, gule pil og gul linje). (D) Zoom ind konfokale billeder af CT26-GFP flercellede kræftcelle kugleformet med celler invaderer (grøn) i collagen type I-netværk (rød), der viser kollagen organisation: parallelle fibre (hvid pil) og radiale fibre (gul pil). Skala 20 pm. (E) Collagen fiber orientering i) Farvekodede orientering map. ii) Kvantitativ orientering måling (tabel-vinkler) på udvalgte ROIs (cirkler). Klumpformet overflade orientering: 45 °, orientering normal til overfladen: -45 ° (F) Collagen signaturer findes i en enkelt NiCd /p53

– /- mus intestinal tumor er filmede med intravital to-foton mikroskopi. i) TAC-1, krøllet kollagen struktur; ii) TAC-2, lige og justeret collagen, parallelt til tumoren kant og iii) TAC-3, collagen aligned vinkelret til tumoren kant. Epiteliale kræftceller (nuklear GFP, grøn), kollagen (SHG, magenta). Pilespidser peger på særskilte collagen organisation. Scale barer, 50 um.

Som kollagen polymerisering i nærværelse af klumpformet, kan vi observere penetration af gelen i første cellelag (Fig 2A og 0t). Derudover billederne repræsenterer maksimale fremskrivninger af 40 pm tykke z-stakke, hvilket også vil føre til en vis overlay. Over tid ændrer kollagen organisation som funktion af afstanden til sfæroid. Nemlig, er kollagenfibre rettet ind parallelt med kanten af ​​sfæroid på tæt (hvid pil Fig 2D) og fremtræder radialt på linie længere væk fra overfladen (gul pil Fig 2D). Denne tilpasning blev kvantificeret ved måling af vinkelorientering i forskellige positioner (Fig 2e). Det skal bemærkes, at kun få celler har nået regionen med tilpasningen vinkelret på overfladen. Dette udelukker, at omlægningen skyldes massiv omlægning af kollagen ved tumorceller, for eksempel ved skabelse af hulrum i collagen under migrering. Vores fund af denne variabel arrangement bekræfter lignende

in vivo

og

in vitro

rapporter [6,39]. Den afhængige organisation tid vist i figur 2A tillader overvågning kollagen ændringer i løbet klumpformet vækst og invasion. Vi observerer (Fig 2A), at kollagen er ombygget 24h, skifter fra en isotrop organisation på tidspunktet 0h beskrevet parallelle orientering på overfladen, og at forekomsten af ​​radiale bundter i det omgivende ECM. Mulig parallel opretning af fibre under kollagen polymeriseringen fase ikke overholdes, men kan være over løsningen af ​​de aktuelle data. Slørede områder, der observeres omkring sfæroid kan være forbundet til den enzymatiske nedbrydning af celler eller celler i forskellige z positioner. Tidligere forsøg har vist, at skubbe kræfter i den voksende klumpformet alene kan allerede føre til parallelle opretning ved klumpformet overfladen [40].

kymograph (Fig 2B og 2C) viser en rig skubbe /trække adfærd. Mens kollagen tæt sfæroidet overflade skubbes udad af sfæroidet vækst, 30 um væk fra dette skubber zone vi observere en trækning af collagen mod klumpformet, hvilket resulterer i en samlet sammentrækning af kollagen ECM omkring sfæroid. Den kymograph (Fig 2C) illustrerer de to antagoniserende bevægelser kompression som følge af klumpformet vækst (hvid pil) og kollagen sammentrækning i invasionen zone (gul pil). Denne noget selvmodsigende adfærd samtidig presser (på grund af kugleformet vækst, blå linje, fig 2C) og trække (ved celle kræfter, gul linje, Fig 2C) skaber en kompression zone ved klumpformet overflade, hvor kollagen er omarrangeret tangerer klumpformet ( fig 2). Endvidere er de trækkræfter deformere collagen radialt, således i sig selv skaber en præferentiel opretning af fibrene vinkelret på klumpformet overflade (Fig 2D), der meget ligner den fiber alignment observerede

in vivo

(fig 2F). En sådan adfærd er også kendt fra klippede kollagen fibre

in vitro

[30].

Cell-induceret collagen sammentrækning går forud invasion

kymograph-baserede inspektion viser, at kollagen sammentrækning starter umiddelbart efter podning sfæroiden i ECM, mens cellerne invadere først senere. For at undersøge timingen af ​​sammentrækning og invasion vi tal på sin tid afhængighed. Invasion måles på grundlag af fluorescerende billeder af GFP-positive CT26 celler (Fig 3A), ved at kvantificere det område af celler, der synes løsrevet fra klumpformet og normalisere det med det område, som den klumpformet (S2 Fig). Den collagen sammentrækning detektion (Fig 3B) er baseret på en tidligere beskrevet korrelation algoritme anvendes på lyse felt billeder [41], der er valideret ved at spore fluorescerende perler indlejret i kollagen gel (S3-S5, S8 og S9 figurerne).

(A) Valg af billeder, der viser celleinvasion (grøn) i collagen i løbet af 48 timer. På cirka 9-12 timer cellerne begynder at forlade klumpformet (indtræden af ​​invasion). (B) Initial lyse felt billede af klumpformet i kollagen til tiden 0 timer og hastighed kort over kollagen sammentrækning. Pile angiver retningen af ​​sammentrækning og farvekode henviser til hastigheden af ​​kontraktion (rød-høj og blå-lav). De mørke blå felter maske bevægelse af celler og væksten af ​​klumpformet, som ikke tages i betragtning ved beregning af forskydning hastighed kortet. Til kvantificering gennemsnitlige forskydning hastighed blev beregnet ud fra 100 um området uden for klumpformet angivet med de stiplede linier. (C) Hastigheden af ​​collagen kontraktion (um /time) over en periode på 66 timer. Forskellige faser kan skelnes for sammentrækning hastighed: Ia- initiering med forøget acceleration, Ib- reduceret acceleration og II-opbremsning, adskilt af den stiplede linje. Invasion debut er angivet med gul skygge. (D) Blå linje viser den kumulative af den gennemsnitlige collagen deformation (i fig 3C) og invasion område (rød). Invasionen området blev normaliseret for hver prøve til den oprindelige klumpformet område. Scale bar: 150 um (lyse felt og GFP) og 300 um (hastighed kort). Alle værdier er gennemsnit ± standardafvigelse (n = 19) fra fem uafhængige forsøg.

Den resulterende hastighed kort sekvens (Fig 3B) visualiserer kontraktile flow hastighed som farvekode, mens pilene giver retning af strømningen. Allerede 3 timer efter såning, opdage vi en kontraktile kollagen flow (lyseblå til grøn skygge) mod sfæroide (sorte pile). Den sammentrækning aftager radialt og viser nogle tangentielle variationer. Sammentrækningen zone omkring sfæroid udvider over tid og sammentrækning hastighed typisk topper ved ca. 30 h post-podning, efterfulgt af en gradvis nedsættelse.

kontraktionen kvantificeres ved at beregne den sammentrækning hastighed i et område på 100 um omkring sfæroiden overflade for hver ramme (fig 3B hvid cirkel). Fig 3C viser den resulterende tidsafhængige sammentrækning hastighed gennemsnit over flere forskellige sfæroider (n = 19). De overordnede reproducerbare egenskaber viser, at klumpformet model kan anvendes til at studere variation af invasion og mekaniske interaktioner mellem sfæroid og modellen ECM.

Tre faser kan skelnes fænomenologisk (Fig 3C). I den første fase (la) sammentrækning straks iværksættes efter prøveforberedelse med en veldefineret sammentrækning hastighed. Den sammentrækning accelererer med en lineær hastighed stigning indtil 12h efter såning. Den anden fase (Ib) starter med en ændring i hastighed stigning og varer indtil omkring 30h, når sammentrækning hastighed toppe. I visse tilfælde, sammentrækning selv plateauer til en stabil, lavere hastighed i anden fase (se S3 Fig). Efter at have nået toppen sammentrækningen hastighed ved ca. 30 til 33 timer observere vi en generel deceleration af sammentrækning ned til en næsten vækst stopper med en endelig hastighed på kun 0,1 + – 0,02 um /time i slutningen af ​​omkodning (66 h) ( fase II). Ved at sammenligne tid afhængighed af den samlede collagen deformation med invasion område (Fig 3D) fandt vi, at sammentrækning forud invasion i gennemsnit med ca. 9-12h, hvilket bekræfter resultaterne af kymograph i Fig 2. Starten af ​​invasion vises kun, når den gennemsnitlige kollagen deformation på 2-4 um (fig 3D). Interessant, i begyndelsen af ​​fase II (33h), vi observerer en mild acceleration af invasion (Fig 3D) forekommer på det tidspunkt, sammentrækning hastighed toppe. Endvidere viser disse resultater, at invasionen område fortsætter med at stige i fase II, selvom kollagen sammentrækning bremser (fase II), hvilket antyder, at det ikke er kollagen bevægelse, der påvirker invasionen.

Kollagen sammentrækning skaber spændinger i netværket

Collagen sammentrækning antyder, at cellerne på det ydre lag af sfæroid trække på fibrene. Vi ønskede at bestemme, om collagen bevægelsen var et resultat af cellernes aktive trækkræfter eller blot skyldes viskos strømning på grund af kollagen fordøjelse ved sfæroiden overflade. Betydningen af ​​trækkraft var indlysende, når podning to sfæroider i nærheden. I denne opsætning observere vi at celler migrerer overvejende hele området mellem sfæroider. Denne migrationsmønstre svarer også til mønstret af de forventede trækkræfter (S4 Fig), som blev observeret i andre modelsystemer [31-33,35,42]. I sådanne multi-sfærisk eksperimenter, den observerede radiale justering er typisk mere udtalt end i single klumpformet analyse.

For at estimere de elastiske trækkræfter i kollagen vi ablateret collagen 48h efter såning ved hjælp af en 800 nm pulseret laser ( fig 4A og S6 film). På dette tidspunkt-punkt collagen flow har stort set stoppet, hvilket betyder, at systemerne har enten afslappet nogen mekanisk spænding ved viskos strømning eller at en mekanisk ligevægt er etableret, hvor trækkræfter fra cellerne afbalanceret mekanisk spænding i collagen. Kollagen afbildes før og efter ablation med en tid-opløsning på 10 sek. Vellykket ablation bekræftes ved refleksion mikroskopi på samme konfiguration, som ikke afhænger af et fluorescenssignal, men tilstedeværelsen af ​​collagenfibrene.

(A) For at undersøge tilstedeværelsen af ​​spænding i det øjeblik, hvor sammentrækning har næsten stoppet, collagenfibre blev skåret 48 timer efter udsåning af en CT26 GFP sfæroid i collagen: (i) Repræsentative billeder af ablation område ved 0 og 30 sekunder efter udskæring. Hvid pil angiver positionen af ​​sfæroide. Den firkantede giver ablaterede område og den stiplede linje repræsenterer valgt til kymograph i iii linje. (Ii) Co-lokalisering af kollagenfibre før og 30 sekunder efter ablation udført siden af ​​klumpformet (hvid pil). Rød og grøn farve påføres refleksion fluorescens før og efter snittet henholdsvis visualisere flytning af kollagenfibre. Scale bar: 20 pm. (Iii) Kymograph af frame sekvens fra S6 Movie. Den røde linje sporer tilbagetrækning fiber. Stammen er defineret som u = L

d /L

0, og er i eksemplet præsenteret 0,23. Målestok: 15 um (lang bar) og 10 sekunder (korte bar). (B) Styring eksperiment i kollagen uden klumpformet. Ingen spænding overholdes, da der ikke er tegn på tilbagetrækning efter snittet. Scale bar: 15 pm (lang bar) og 10 sekunder (kort bar)

Vi observerer en indledende forskydning hurtig fiber lige efter opskæring (figur 4A ii ​​og S6 film), efterfulgt af en kontinuerlig rådnende. afslapning proces. Fibre flytter til modsatte retninger, som angivet på kymograph (Fig 4A iii). Kontrol geler uden sfæroider viser ingen tegn på spænding og afspænding (Fig 4B). Den observerede bevægelse viser direkte, at netværket er på dette tidspunkt-punkt stadig under mekanisk spænding. Dette antyder, at sammentrækning er forårsaget af kræfter, der dannes af sfæroide. Desuden, at tilbagetrækningen efter snittet flugter i retning af sfæroidet viser, at cellerne på klumpformet trække i collagen, som direkte forklarer de observerede kollagen strømme. Stamme (Fig 4A iii) blev beregnet ved at dividere deformation længde

L

d dele på snittet (i um) med afstanden fra de afskårne i hvilke der ingen bevægelse af kollagen blev målt efter snittet også i um (

L

0

). Den gennemsnitlige belastning efter snittet viste sig at være u = 11 + – 5,3% (middel + – SEM n = 14)

Invasion er lokalt undertrykt i fravær af spænding

For at bestemme. et forhold som muligt mellem trækkræfterne anvendes af klumpformet til kollagen og cancercelleinvasion, vi asymmetrisk lempet spænding ved macrosurgery eksperimenter. Dette blev gjort ved en række efterfølgende eksperimenter på kollagengeler med indlejrede sfæroider, hvor gelerne er asymmetrisk skåret på den ene side af sfæroide (S5 Fig) lige efter collagen polymeriseres (Fig 5A). Under kollagen kontraktion, er den opbygget af mekanisk spænding i retningen ud mod snittet undertrykkes på grund af den frie grænse. Invasion og sammentrækning overvåges over 72 timer (S7 Film) og en asymmetri for invasion kan observeres (fig 5A, 72 timer). Mens der på den side af snittet collagenet stadig kontrakter, vi observere en inhibering af celleinvasion på både, den side, der vender snittet (lyseblå skraverede område Fig 5B) og den modstående side mod indersiden af ​​gelen (lyserød skraverede område fig 5B). Men på de to sider vinkelret på snittet, er invasion lettes (hvidt område Fig 5B). Dette blev kvantificeret ved at måle den gennemsnitlige fluorescensintensitet fra cellerne uden for sfæroid som funktion af vinkel. Mens 0h, ingen stærk afvigelse af fluorescensen bliver tydeligt, allerede efter 24 timer er der en svag stigning i kanterne af de afskårne område, som bliver meget dominerende efter 72h som kvantificeres ved af to toppe i fig 5B. Da kontraktile styrker ikke er afbalanceret i retning af snittet, vi observerer en samlet bevægelse af sfæroid væk fra de afskårne, hvilket igen reduceret spænding opbygget på siden modstående snittet. Interessant, ser vi også et fald på invasion i retningen modstående snittet (Fig 5B lys rød). Faldet af invasion kvantificeres ved at sammenligne invasionen i retning af snittet og resten af ​​sfæroidet (Fig 5C, n = 54 sfæroider)

(A) Collagen (z projektion, 4x objektiv).: rød TAMRA collagen blev polymeriseret og skåret med skalpel på den ene side. Venstre billeder viser invasionen af ​​GFP-positive celler (grøn) ved 0, 24 og 72 timer efter podning. Den stiplede linje angiver en kant af snittet kollagen og pilen viser retningen af ​​kollagen sammentrækning. Højre: Fluorescerende billeder af kantet rulles sfæroid hvor hver vandret linje svarer til den radiale fluorescensintensitet profil. Y-aksen af ​​disse billeder svarer til de forskellige vinkler. Pile viser området for invasion på den side af snittet. Den sorte stiplede linje gør venstre grænse af området anvendes til at beregne den gennemsnitlige fluorescens som vist i B. (B) Gennemsnit fluorescensintensitet af celler, der strækker sig over den indledende sfæroid overflade som en funktion af vinkel Θ. Dette bruges til at estimere udvæksten af ​​celler fra den oprindelige klumpformet størrelse. De forskellige farver repræsenterer den gennemsnitlige intensitet efter 0 (rød), 24 (grøn) og 72 timer (violet) af invasion. Skraveringen af ​​grafen viser den side der vender snittet (lyseblå), den modstående side mod indersiden af ​​gelen (lys rød) og de to sider vinkelret på snittet (hvidt område). Den stiplede linie repræsenterer udvækst i sfæroider indlejret i hel collagen på de tilsvarende tidspunkter. (C) Invasion området kvantificering på den side af snittet (efter 0 timer) og gennemsnitlig invasion område på uskåret side. Invasion område blev kvantificeret som i figur 3 (gennemsnit ± standardafvigelse, n = 54 af 6 uafhængige forsøg). (D) Skitse af spænding-afhængige invasion model.

Diskussion

Ligesom mest motile celler, kræftceller anvender fysiske kræfter på deres omgivende matrix [9,43] og dynamisk remodel ECM. Begge egenskaber tyder på, at de aktivt kan ændre deres miljø, og disse ændringer kan forbedre vilkårene for kræft celle invasion [16].

Mens effekter mellem migrerende celler og ECM allerede tidligere er blevet studeret på enkelt celle niveau det skal påpeges, at undersøgelser af klumpformet niveau gør det muligt at få indsigt i mulige kollektive virkninger. Den store krop på enkelt celle arbejde bruges til at forstå kraft og spænding elementer i sådanne mekanisk isolerede systemer. Enkelte celler er blevet vist at anvende kontraktile kræfter og spændinger på collagen, der resulterer i både mekanisk og biokemisk remodeling, ligner den sfæroide. Men på grund af de begrænsede kræfter enkeltceller virkningerne på global ECM arkitektur forbliver små sammenlignet med virkningen af ​​kræft sfæroider. Undtagelser fra denne er frit svævende, lav spænding geler, hvor matricen ikke er i stand til at modstå trækkræfter enkelte fibroblaster.