PLoS ONE: Shiga Toxin Receptor Gb3Cer /CD77: Tumor-Association og lovende Terapeutisk Target i bugspytkirtlen og Colon Cancer

Abstrakt

Baggrund

Trods fremskridt i adjuverende kemoterapi i de seneste årtier, pancreas og tyktarmskræft er fortsat almindelige dødsårsager på verdensplan. Bakterielle toksiner, som binder specifikt til celle overfladeeksponerede glycosphingolipider, er en potentiel hidtil ukendt terapi. Vi bestemt udtryk for globotriaosylceramid (Gb3Cer /CD77), Shiga toksin-receptoren, i humane pancreas og colon adenokarcinomer.

Metode /vigtigste resultater

Tissue lipid ekstrakter af matchede par af kræft og tilstødende normalt væv fra 21 pancreas og 16 coloncancer-patienter blev undersøgt med tyndtlagschromatografi overlay assay kombineret med en hidtil ukendt massespektrometri tilgang. Gb3Cer /CD77 blev lokaliseret ved immunfluorescens mikroskopi af kryosnit fra maligne og tilsvarende raske vævsprøver. 62% af pancreas og 81% af kolon adenokarcinomer viste øget Gb3Cer /CD77-ekspression, mens 38% og 19% af ondartet bugspytkirtel og kolon væv, henholdsvis ikke gjorde det, hvilket indikerer en sammenslutning af denne markør med neoplastisk transformation. Også blev Gb3Cer /CD77 forbundet med dårlig differentiering (G 2) i bugspytkirtelkræft (P = 0,039). Massespektrometrisk analyse fremgår fremme ekspressionen af ​​de Gb3Cer /CD77 med lange (C24) og kortkædede fedtsyrer (C16) i maligne væv og pegede på tilstedeværelsen af ​​hydroxylerede fedtsyrer lipoforms, som foreslås at være vigtige for receptor målretning. De kunne påvises i 86% af pancreas og omkring 19% af kolon adenokarcinomer. Immunhistologi af vaevskryosnit angivne tumor-sammenslutning af disse receptorer.

Konklusioner /Betydning

Øget ekspression af Gb3Cer /CD77 i de fleste pancreas og colon adenokarcinomer beder overvejelse af Shiga toksin, dens B-underenhed eller B-subunit-derivater som nye terapeutiske strategier til behandling af disse udfordrende maligniteter

Henvisning:. Distler U, Souady J, Hülsewig M, Drmic-Hofman i, Haier J, Friedrich AW, et al. (2009) Shiga Toxin Receptor Gb3Cer /CD77: Tumor-Association og lovende Terapeutisk Target i bugspytkirtlen og tyktarmskræft. PLoS ONE 4 (8): e6813. doi: 10,1371 /journal.pone.0006813

Redaktør: Georg Häcker Tekniske Universitet München, Tyskland

Modtaget: Marts 30, 2009; Accepteret: 22 Juni 2009; Udgivet: 28 August, 2009

Copyright: © 2009 Distler et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse er blevet finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (URL: www.dfg.de) indrømmer FR2569 /1-1 og MU845 /4-1, den Graduiertenkolleg GRK1409 /1 (URL: http: //zmbe.uni-muenster.de/GRK1409 /) og Deutsche Krebshilfe (URL: www.krebshilfe.de) give DKH 106742. de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende. interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

bugspytkirtlen og tyktarmskræft er den fjerde og næsthyppigste årsager til kræft dødelighed i den vestlige verden, henholdsvis tegner sig for skønnet. 84,250 dødsfald i 2008 i USA alene [1]. Med en median overlevelse periode på omkring 6 måneder og 5-års overlevelsesrater 5% bugspytkirtelkræft blandt de mest dødbringende af de almindelige tumorer. Prognosen for patienter med coloncarcinomer med fjernmetastaser på diagnosetidspunktet er næsten lige så dårlig som for pancreascancer [2]. Kun omkring 10-15% af de bugspytkirtlen kræftpatienter er kandidater til potentiel kurativ kirurgi [3], [4], hvilket understreger det presserende behov for at udvikle nye strategier til behandling af patienter med disse inoperable tumorer. Målrettede behandlinger, for eksempel baseret på bakterie- og plante toksiner eller monoklonale antistoffer, som genkender celleoverflade glycosphingolipider (GSL’er), der er overudtrykt i bugspytkirtlen og /eller tyktarmskræft, kan vise sig at være lovende tilgange til supplerende terapi efter operationen [5] -. [9]

GSL’er, der består af en hydrofil oligosaccharidkæde og en hydrofob ceramid membran-anker [10], er udtrykt som integrerede bestanddele af lipidklumper i den ydre blad af plasmamembranen [11]. Ud over deres involvering i celle vækstregulering og celleadhæsion [12], celleoverflade-eksponerede oligosaccharidkæder af GSL’er “tjene” som bindingssteder for bakterier [13] og udnyttes af forskellige toksiner, herunder Shigatoxiner (Stxs), for overfladen binding , intracellulær menneskehandel og signalering arrangementer [14]. Stxs (også betegnet verotoxins), som er fremstillet af patogene

Escherichia coli

stammer [15] – [19], tilhører AB

5 familien af ​​bakterielle toksiner. De består af et enzymatisk aktivt A-underenhed, der inhiberer protein-biosyntese ved at modificere værten rRNA og et ikke-toksisk homopentameric B-underenhed [20], [21]. B-pentamer binder sig til sin fortrinsret GSL receptor globotriaosylceramid (Gb3Cer /CD77) og udløser internalisering af AB

5-Gb3Cer komplekset ved receptor medieret endocytose

via

clathrin-coatede vesikler [22] eller ved endocytiske ruter, der ikke involverer clathrin-coatede pits [23]. Toksinet-receptorkomplekset undergår retrograd transport gennem Golgi netværket til det endoplasmatiske reticulum. Efter retro-translokation i cytosolen [24], et molekyle af den processeres proteolytisk A

1-underenheden kan inhibere proteinsyntese og dræbe en celle.

Aberrant ekspression af GSL’er forekommer i næsten alle mennesker og dyr cancere [12], [25] og mange tumorassocierede antigener er nu kendt for at være GSL’er. Forøget ekspression af Stx-receptor Gb3Cer /CD77 er blevet rapporteret om forskellige faste tumorer såsom ovariecancer [26] og brystkræft [27] eller malign meningeom [28]. For nylig er forøget ekspression af Gb3Cer /CD77 blevet beskrevet som korrelering med udviklingen af ​​metastaser i tyktarmskræft [9], [29]. Gb3Cer /CD77 muliggør også tumorspecifik plasmamembran lokalisering af proteiner (e. G. Hsp70) [30]. Som celleoverflademolekyler, tumorassocierede GSL’er er tilgængelige for antistoffer eller GSL-bindende toksiner (dvs. Stx), hvilket gør dem kandidat mål for onkologiske anvendelser [31]. Følgelig Stx-ligand Gb3Cer /CD77 er i øjeblikket under efterforskning som et potentielt mål kandidat til toksin-baserede terapi [28], [29], [32], [33].

I denne undersøgelse analyserede vi pancreas og tyktarmskræft væv for ekspression af Gb3Cer /CD77, under anvendelse af tyndtlagschromatografi (TLC) af GSL ekstrakter fra væv og immunhistologisk farvning af vaevskryosnit. Øget udtryk for STX-receptorer kunne påvises i de fleste bugspytkirtlen og tyktarmskræft væv, hvilket indikerer en forening med neoplastisk transformation. Endvidere strukturelle modifikationer af lipidankre af tumorassocieret Gb3Cer /påvistes CD77 arter i cancervæv fra begge tumor typer anvender en hidtil ukendt massespektrometri metode, kombineret med TLC immunodetektion [8], [34]. Således forbedrede udtryk og lipid ændringer af Gb3Cer /CD77 i karcinomer gør dette mål en lovende kandidat til Stx og /eller Stx-konstruktioner i onkologiske anvendelser af både bugspytkirtel og kolon maligniteter.

Materialer og Metoder

Etik Statement

The Local Etisk Komité Medical Council of Westfalen-Lippe og det medicinske fakultet ved universitetet Hospital Münster (Münster, Tyskland) godkendte den aktuelle undersøgelse (referencenummer 1IXHai). Alle patienter blev informeret og givet samtykke skriftligt.

Kirurgiske Prøver

Undersøgelsen blev udført ved hjælp af prøver af pancreas (n = 21) og kolon (n = 16) adenokarcinomer fra patienter, som havde gennemgået kirurgi for deres primære tumorer [5]. Tumorhistologi blev bestemt efter kriterierne i UICC [35]. De clinicopathologic karakteristika kohorte af patienter med kræftsvulster er beskrevet i supplerende tabeller S1 og S2. Tumorprøver blev lynfrosset i flydende nitrogen umiddelbart efter kirurgisk indgreb og opbevaret ved -80 ° C indtil analyse. Tilsvarende kontrol prøver blev opnået fra den samme patient på samme orgel stedet uden makroskopisk tumor engagement, der blev bekræftet ved histologisk undersøgelse.

Forberedelse af Lipid Uddrag fra kirurgiske prøver

Væv var homogeniseret og ekstraheret to gange med 2 ml chloroform /methanol (1/2, vol /vol), 2 ml chloroform /methanol (1/1, v /v), og 2 ml chloroform /methanol (2/1, vol /vol). De kombinerede supernatanter af hvert væv ekstrakt (12 ml) blev tørret ved rotationsfordampning og phospholipider blev forsæbet ved inkubation i 4 ml vandig 1 N NaOH i 1 time ved 37 ° C. Efter neutralisering med 400 pi 10 N HCI blev prøverne dialyseret mod deioniseret vand og tørret ved rotationsinddampning. Ekstrakterne blev justeret til definerede volumener chloroform /methanol (2/1, v /v) svarende til 0,1 mg vådvægt pr pi.

Oprensning af Stx1

Stx1 blev oprenset fra

E. coli

C600 (H19J) bærer

stx

1

gen fra

E. coli

O26: H11 stammen H19 [36]. Kort fortalt blev bakterierne desintegreret ved sonikering og ekstraheret med polymyxin B (3000 U /ml) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Tyskland). Efter centrifugering blev supernatanten indeholdende rå Stx1 koncentreret ved ultrafiltrering og udsat for kromatografi på hydroxylapatitsøjle efterfulgt af chromatofokusering [37]. Søjlefraktionerne indeholdende Stx1 blev samlet, dialyseret og portioner blev opbevaret ved -70 ° C indtil anvendelse. Renhed af Stx1 præparat blev overvåget ved SDS-PAGE, og den strukturelle integritet af toksinet blev kontrolleret ved peptidkortlægning anvendelse af massespektrometri [21]. Biologisk aktivitet blev bestemt ved Vero-celle cytotoksicitet [38].

Anti-Gb3Cer /CD77 og anti-Stx1 antistoffer

forberedelse og specificitet af polyklonale kylling anti-Gb3Cer /CD77 antistof, der genkender Galα1 -4Galβ1-4Glc-rest af Gb3Cer /CD77 arter er blevet beskrevet [39], [40]. Stx1 blev detekteret med musen IgG1 monoklonalt anti-Stx1 antistof 109/4-E9b (Sifin, Berlin, Tyskland).

Højtydende tyndtlagskromatografi (TLC) og reference GSL’er

En blanding af neutrale GSL’er fra humane erythrocytter, der består af monohexosylceramide, lactosylceramid, Gb3Cer /CD77, og globotetraosylceramide (Gb4Cer), blev anvendt som reference [40] for TLC antistof og stx1 overlay analyser. Kontoplanen for GSL’er følger IUPAC-IUBM anbefalinger 1997 [41]. Reference- GSL’er og væv lipid ekstrakter blev påført på glas-backed silica gel 60 præcoatede højtydende tyndtlagskromatografi (TLC) plader (nr 1.05633.0001;. Merck, Darmstadt, Tyskland) med en automatisk applikator (Linomat IV, CAMAG, Muttenz, Schweiz) og separeret i chloroform /methanol /vand (120/70/17, hver efter volumen., med 2 mM CaCl

2). Reference- GSL’er blev farvet med orcinol.

TLC Overlay Assay

Gb3Cer /CD77 blev påvist under anvendelse af overlejrede polyklonale kylling antistof eller Stx1 som beskrevet [40], [42]. Primær anti-Gb3Cer /CD77 og sekundært alkalisk phosphatase-mærkede antistoffer (Dianova, Hamburg, Tyskland) blev anvendt i 1:2000 fortyndinger. Bundne sekundære antistoffer blev visualiseret ved farveudvikling med 0,05% (w /v) 5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat-p-toluidin-salt (BCIP, nr 6368,3;. Roth, Karlsruhe, Tyskland). De immunofarvede chromatogrammer blev vasket med glycinpuffer og opbevaret ved -20 ° C. Blå immunpositive Gb3Cer /CD77-bånd blev kvantificeret med en CD60 scanner (Desaga, Heidelberg, Tyskland, software ProQuant

R, udgave 1.06.000). Gb3Cer /CD77 beløbene blev bestemt semikvantitativt som relativ udtryk sammenlignet med reference- GSL’er. De sekundære densitometriske data (se “Statistisk analyse” nedenfor) blev anvendt til at definere 4 kategorier af tumor udtryk i forhold til de normale væv ved formel cut-point analyse: høj overekspression (kategori I, 4000 x), moderat overekspression (kategori II, 700 x 4000), svarende udtryk (kategori III, -700 x 700), og sænket udtryk (kategori IV, x -700) for bugspytkirtlen karcinom og høj overekspression (kategori i, 2000 x), moderat overekspression (kategori II, 200 x 2000), svarende udtryk (kategori III, -200 x 200), og sænket udtryk (kategori IV, x -200) for coloncarcinom henholdsvis

Immunhistokemi.

immuncytokemisk farvning blev udført som beskrevet [8]. Kort fortalt blev kryosektioner (4 um) inkuberet med anti-Gb3Cer /CD77-antistof (1:15) og et anti-CD31-antistof (1:200) (muse IgG1, klon MEM-05, Immunotools, Friesoythe, Tyskland). Antistoffer, der binder til Gb3Cer /CD77 og CD31 blev detekteret med dichlorotriazinylamino fluorescein (DTAF) -mærkede anti-kylling-IgY antistof (Dianova) og Alexa Fluor 568-konjugeret anti-muse-IgG-antistof (Invitrogen, USA, CA), fortyndet 1: 40 og 1:250 hhv. For negative kontroller blev immunhistokemi udført under anvendelse kylling præimmunt serum og irrelevant muse IgG1-antistof (Immunotools). Kerne-DNA af cellerne blev farvet med 4 ‘, 6-diamidine-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI, Sigma-Aldrich, USA). Fluorokromkonjugerede mærkede antistoffer og DAPI-farvede kerner blev evalueret under et fluorescens mikroskop (Axioskop, Zeiss, Jena, Tyskland), original forstørrelse × 40 (mål linse Plan-Neofluar, numerisk apertur 0,75), efter offentliggjorte protokoller [43]. For at bekræfte den hydrofobe karakter af målet for anti-Gb3Cer /CD77-antistoffer, blev lipider ekstraheret med methanol og chloroform /methanol (1/1, v /v) fra de monterede sektioner før farvning.

Infrarød Matrix-assisteret laser desorption /Ionisering ortogonal Time-of-Flight (IR-MALDI-o-TOF) massespektrometri

specifikationerne for IR-MALDI-o-TOF massespektrometer (MDS Sciex, Concord, Ontario , Canada) og direkte TLC-IR-MALDI-MS-analyse fra immunpositive bånd af Stx1 TLC overlay assay er detaljeret beskrevet af Distler et al. [34]. GSL’er blev analyseret i den positive ion-tilstand ved hjælp glycerol som matrix.

Statistisk analyse

Primære densitometriske data immunofarvede Gb3Cer /CD77 bands og sekundære densitometriske data, opnået fra forskellen værdier matchede par beregnet ved fratrække normale fra relaterede tumor væv værdier, blev samlet med softwarepakken SPSS version 14.0.2 (SPSS Inc., Chicago, IL) for ikke-parametrisk statistisk analyse. Tegnet test blev anvendt for sættet af primære densitometriske data til at undersøge betydningen af ​​forholdet mellem Gb3Cer /CD77-ekspression og neoplastisk transformation. Medianen test blev udført for primære og sekundære densitometriske data til at teste, om Gb3Cer /CD77-ekspression var signifikant forskellig blandt tumorer omfatter forskellige clinicopathologic kategorier. Korrelationskoefficienter blev beregnet for sorteret værdier af den primære densitometrisk data af normale og tumorvæv henholdsvis og sorteret forskelsværdier. Kendall er τ blev brugt til at vurdere graden af ​​association mellem Gb3Cer /CD77-udtryk og histopatologisk sortering. Alle tests blev to tailed og αwas sat til 0,05.

Resultater

Vi undersøgt væv fra 21 pancreas og 16 colonadenocarcinom patienter til ekspression af Stx-receptor Gb3Cer /CD77 (for struktur se figur 1 ). Til dette formål rå lipid ekstrakter og kryosnit fra postoperativ matchede par af maligne

versus Salg tilstødende upåvirkede væv fra de samme patienter blev analyseret ved hjælp af TLC overlay teknik og immunfluorescens mikroskopi. For at få yderligere strukturelle detaljer tumorassocierede modifikationer af Gb3Cer /CD77 arter er et hidtil ukendt massespektrometri tilgang anvendes der kombinerer TLC immunodetektering med IR-MALDI-o-TOF-MS [8], [34]. De våde vægte af de undersøgte ondartede og sunde væv og de tilsvarende patologi data er anført i supplerende tabeller S1 og S2.

Prøver fra rå lipid ekstrakter svarende til 2 mg væv vådvægt normal (N) og tumorvæv (T) blev samtidigt adskilt ved TLC. Neutrale GSL’er fra humane erythrocytter tjente som positiv reference i overlay assay (R, 10,8 ug) og orcinol farvning (O, 16,0 ug). Den synopsis af Gb3Cer /CD77-ekspression i ondartede væv af både tumor enheder er angivet i tabel 1, og de histopatologiske data fra bugspytkirtlen og coloncarcinomer er opsummeret i supplerende tabeller S1 og S2, hhv. Repræsentative eksempler på bugspytkirtlen (A) og coloncancer (B) af tumor kategori I til IV, er vist. Ingen af ​​de undersøgte colon-carcinomer blev fundet med lige ekspression af Gb3Cer /CD77 i det tilstødende normale væv (B). Således kategori III forblev ledig i kohorten af ​​patienter. C, struktur Stx1 receptor Gb3Cer (D18: 1, C16: 0). Den ceramid (Cer) lipid anker vises fortrinsvis i raske væv med C24 eller C16 fedtsyre, men konstant sphingosin (D18: 1).

TLC Immunodetektion af tumor-associerede Gb3Cer /CD77 i bugspytkirtlen og Colon Kræft

Identiske portioner af rå lipid ekstrakter af matchede par fra neoplastiske og tilsvarende upåvirkede væv blev udsat samtidigt til TLC, efterfulgt af TLC overlay påvisning af Gb3Cer /CD77 hjælp Stx1 og anti-Gb3Cer /CD77-antistof. Positive bånd blev rangordnet efter de forskellige udtryk for Gb3Cer /CD77; Nummer 1 angiver den højeste intensitet (tabel 1). Baseret på densitometri blev tumorer inddelt i fire kategorier: lige fra høj (I), og moderat (II) overekspression, lig (III), og sænket ekspression (IV)

pancreascancer

Figur 1A viser fire enkelt repræsentant Stx1 TLC overlay pletter af tumor og relaterede sundt væv ekstrakter, der hver repræsenterer en af ​​de fire kategorier af pancreascancer. I alt 61,9% af de undersøgte bugspytkirtelcarcinomer viste moderat til høj overekspression af Gb3Cer /CD77, hvorimod 14,3% udviste lige og 23,8% formindsket Gb3Cer /CD77-ekspressionsniveauer (se tabel 1). Globotetraosylceramide (Gb4Cer), kendt som “lav affinitet” ligand af Stx1, var ikke målbart i pancreas tumorer og tilstødende normale væv ved hjælp Stx1 som afsløring værktøj. TLC immunostains beskæftiger den polyklonale anti-Gb3Cer /CD77-antistof var ens i resultater til dem, der opnås med Stx1 TLC overlay undersøgelser, som viser lidt højere følsomhed i sporing af Gb3Cer /CD77-arter (se supplerende figur S1A).

Colon kræftformer.

Figur 1B viser tre enkelt repræsentant Stx1 TLC overlay pletter af colon cancer matchede par, der hver repræsenterer en af ​​de tre kategorier verificerede i colon kræftformer. Gb3Cer /CD77 var moderat til højt overudtrykt i 81,3% af maligne

versus

sundt kolon væv. Ingen af ​​colontumorer udviste lige ekspression resulterer i ledig kategori III. Mindre Gb3Cer /CD77 blev påvist i 18,8% af tumorvævet (se tabel 1). Som i pancreas væv, Gb4Cer var målbart i kolon tumorer og tilstødende normale væv ved hjælp Stx1 som afsløring værktøj. De parallelle TLC immunostains beskæftiger den polyklonale anti-Gb3Cer /CD77-antistof er vist i supplerende Figur S1B.

immunhistokemisk Påvisning af tumor-associerede Gb3Cer /CD77 i bugspytkirtlen og tyktarmskræft

Binding af anti- Gb3Cer /CD77-antistof til frosne snit af bugspytkirtlen og tyktarmscarcinomceller væv og til tilsvarende raske væv af de samme patienter blev overvåget histokemisk. Snit blev co-immunfarvet med et antistof mod endothelcelle markør CD31, og cellekerner blev visualiseret med DAPI fluorochrom.

For eksempel omfattende antistofbinding til pancreatiske tumorceller (T) blev påvist for patient 18 (tumor kategori i) som vist i figur 2A. I modsætning hertil blev lidt eller ingen Gb3Cer /CD77 findes i normalt pancreasvæv (N). Lejlighedsvis endotelceller i blodkarrene, er kendt for at bære Gb3Cer /CD77 [21], [39], [43], viste også positiv farvning i bugspytkirtlen malignt væv.

Dele af normal (N) og tumorvæv (T) af pancreascancer patient 18 (A) og for tyktarmskræft patient 13 (B) blev immunfarvet med anti-Gb3Cer /CD77-antistof og coimmunostained med et antistof mod endotelcelle markør CD31. Cellekerner blev påvist med DAPI. Skalapanelerne svarer til 20 pm. Repræsentative eksempler på tumorer i kategori I er vist (se tabel 1). De histopatologiske data bugspytkirtel og tyktarm karcinom er opsummeret i supplerende tabeller S1 og S2, hhv.

Immunohistokemiske sammenligninger viser høj Gb3Cer /CD77 ekspressionsniveauerne i kolon tumorer (T), som eksemplificeret for patient 13, figur 2B. I modsætning hertil tilstødende normale væv (N) fra den samme patient manglede Gb3Cer /CD77. Angiogenese forekommer blive fremført i nogle undersøgte tyktarmskræft, hvilket fremgår af CD31 og Gb3Cer /CD77-positive endotelceller i tumormassen.

Kontrolsnit inkuberet med muse IgG1 isotypekontroller samt med kylling præimmunserum farvede ikke . Efter GSL ekstraktion af væv, Gb3Cer /CD77 ikke længere påvises med antistoffet (data ikke vist).

Strukturel karakterisering af tumor-associerede Gb3Cer /CD77 i bugspytkirtlen og tyktarmskræft

stx1 positive bånd af TLC-separerede lipid ekstrakter blev analyseret direkte på TLC-pladerne efter TLC-IR-MALDI-MS som beskrevet [34]. Massespektre blev erhvervet i positiv ion-mode og blev opdaget alle Gb3Cer /CD77 arter som enkeltvis opladet monosodiated molekylære ioner.

pancreascancer.

Kombineret Stx1 afsløring og TLC-IR-MALDI-MS demonstrere individuelle sammensætningsmæssige ændringer i overeksprimeres Gb3Cer /CD77 arter i neoplastisk forhold til upåvirket pancreasvæv (f.eks patient 19 (tumor kategori i), figur 3). Analysere den øverste af Stx1 positive tredobbelte bånd af tumoren (T, venstre panel, indsat), mest rigelige [M

3 * + Na]

+ molekylære ioner peger på tilstedeværelsen af ​​Gb3Cer (D18: 1 /D18: 0, C24: 0) med mættet D18: 0 sphinganine foruden de mere almindelige enkeltumættet D18: 1 sphingosin (sphingenine). Det samme gælder for den mindre [M

2 * + Na]

+ og [M

1 * + Na]

+ ioner, som refererer til strukturerne i Gb3Cer (D18: 1 /D18 : 0, C23: 0) og Gb3Cer (D18: 1 /D18: 0, C22: 0), hhv. I modsætning hertil kunne kun lave ekspression af Gb3Cer /CD77 påvises i den øvre Stx1 positivt bånd af normalt pancreasvæv som vist i figur 3 (N, venstre panel). Den høje overflod [M

4 + Na]

+ ioner i den nedre Stx1 positive bånd af tumoren (T, midterste panel) indikerer stærk overekspression af Gb3Cer (D18: 1, C16: 0) i tumorvæv sammenlignet til meget lav hyppighed ioner i den tilsvarende raske væv (N, midterste panel). Imidlertid blev den mest fremtrædende strukturel ændring findes i den laveste Stx1 positivt bånd af cancervævet ved påvisning [M

5 * + Na]

+ ioner (T, højre panel), som var udetekterbar i normalt væv ( N, højre panel). Sammenlignet med Gb3Cer (D18: 1, C16: 0) (T, midterste panel), skiftet i 16 atommasseenheder indikerer hydroxylering af ceramiddelen, der fører til den foreslåede struktur for Gb3Cer (D18: 1, H16: 0) bærer en hydroxyleret C16: 0-fedtsyre. Desuden ioner ved

m /z

1064,65 indikerer tilstedeværelsen af ​​Gb3Cer (D18: 0, H16: 0). Denne slående ceramid modifikation forekom i 85,7% af bugspytkirtlen tumorer hidtil undersøgte. En synopsis af de foreslåede strukturer af Gb3Cer /CD77 arter er fastsat i den supplerende tabel S3.

Lipid ekstrakter svarende til 2 mg vådvægt af normal (N) og tumorvæv (T) af patient 19 (tumor kategori I, se tabel 1 og Supplerende tabel S1) blev samtidigt adskilt ved TLC efterfulgt af overlay-analyse under anvendelse Stx1. De Stx1 positive Gb3Cer /CD77 bands, der er markeret med pilespidser i mellemværker, blev analyseret ved TLC-IR-MALDI-MS. Den fremherskende [M

3 * + Na]

+ molekylære ioner af det øvre bånd af tumorvævet (T, venstre panel) svarer til Gb3Cer (D18: 1 /D18: 0, C24: 0) og mindre ioner kunne henføres til Gb3Cer (D18: 1 /D18: 0, C23: 0) og Gb3Cer (D18: 1 /D18: 0, C22: 0), hhv. I det øvre bånd af normalt væv (N, venstre panel) meget lavere intensiteter af disse molekylære ioner blev observeret. Den høje rigelige [M

4 + Na]

+ ioner af det nedre bånd i tumoren (T, midterste panel) repræsenterer Gb3Cer (D18: 1, C16: 0), som er detekterbar kun i spormængder i normalt væv (N, midterste panel). Analyse af den laveste bånd af tumoren (T, højre panel) viste [M

5 * + Na]

+ -ioner, som er vejledende for hydroxylerede Gb3Cer (D18: 1 /D18: 0, H16: 0) . Dette Gb3Cer /CD77-variant kunne ikke påvises i normale væv (N, højre panel).

m /z

værdier af molekylære ioner og foreslåede strukturer af Gb3Cer /CD77-varianter af maligne og tilstødende normale væv samt referencer fra humane erythrocytter er opført i Supplerende tabel S3.

coloncancerformer.

Stx1 detektion kombineret med TLC-IR-MALDI-MS tilladt os at profilere de individuelle strukturer af overeksprimeres Gb3Cer /CD77 arter som eksemplarisk vist for patient 16 i figur 4 (T, venstre panel) . Høj rigelige [M

3 + Na]

+ ioner peger på Gb3Cer (D18: 1, C24: 1 /C24: 0) som de mest sandsynlige Gb3Cer /CD77-varianter i den øvre Stx1 positivt bånd, ledsaget af mindre udtales [M

2 + Na]

+ og [M

1 + Na]

+ ioner, som svarer til Gb3Cer (D18: 1, C23: 0) og Gb3Cer (D18: 1, C22: 0), hhv. De samme ioner, men med meget lavere intensitet blev opnået fra den øvre Stx1 positivt bånd af det normale væv (N, venstre panel). I det nederste bånd af tumor (T, midterste panel), fremtrædende [M

4 + Na]

+ ioner kunne tildeles Gb3Cer (D18: 1, C16: 0) struktur, som også er påviselig i det normale væv, men med mindre ion intensitet (N, midterste panel). I den laveste band [M

5 * + Na]

+ ioner indikere tilstedeværelsen af ​​Gb3Cer (D18: 1, H16: 0) variant med hydroxyleret C16: 0-fedtsyre, som ikke blev fundet i normalt væv (N, højre panel). Denne bemærkelsesværdige ceramid modifikation blev fundet i ca. 19% af colon tumor TLC immunostains hidtil undersøgt. En synopsis af de foreslåede strukturer af Gb3Cer /CD77 arter er fastsat i den supplerende tabel S3.

Lipid ekstrakter svarende til 2 mg vådvægt af normal (N) og tumorvæv (T) af patient 16 (tumor kategori II, se tabel 1 og Supplerende tabel S2) blev samtidigt adskilt ved TLC efterfulgt af overlay-analyse under anvendelse Stx1. De Stx1 positiv Gb3Cer bands, der er markeret med pilespidser i mellemværker, blev analyseret ved TLC-IR-MALDI-MS. Den fremherskende [M

3 + Na]

+ molekylære ioner af det øvre bånd af tumorvævet (T, venstre panel) svarer til Gb3Cer (D18: 1, C24: 1 /C24: 0) og mindre rigelige [M

2 + Na]

+ og [M

1 + Na]

+ ioner til Gb3Cer (D18: 1, C23: 0) og Gb3Cer (D18: 1, C22: 0 ), henholdsvis. I det øvre bånd af normalt væv (N, venstre panel) meget lavere intensiteter af tilsvarende molekylære ioner blev observeret. Den stærke [M

4 + Na]

+ ioner af det nedre bånd i tumoren (T, midterste panel) repræsenterer Gb3Cer (D18: 1, C16: 0), som er detekterbar i lave mængder i normal væv (N, midterste panel). Analyse af den laveste bånd af tumoren (T, højre panel) viste [M

5 * + Na]

+ -ioner, som er vejledende for hydroxylerede Gb3Cer (D18: 1, H16: 0). Dette Gb3Cer /CD77-variant kunne ikke påvises i normale væv (N, højre panel).

m /z

værdier af molekylære ioner og foreslåede strukturer af Gb3Cer /CD77-varianter af maligne og tilstødende normale væv samt referencer fra humane erythrocytter er opført i Supplerende tabel S3.

Statistisk analyse

Box plots af de primære densitometriske data fra TLC overlay assay bestemt Gb3Cer /CD77 niveauer i bugspytkirtlen (n = 21 patienter) og kolon (n = 16 patienter) væv leveres (figur 5A og B, henholdsvis). Overekspression af Gb3Cer /CD77 optaget i 81,3% af tyktarmskræft sammenlignet med tilstødende sunde væv var signifikant (P = 0,021), mens forøget ekspression af Gb3Cer /CD77 i 61,9% af maligne pancreas væv ikke var signifikant (P = 0,189). I både bugspytkirtlen og tyktarmskræft, har tilstedeværelsen af ​​Stx-detekteret Gb3Cer /CD77 bands ikke korrelerer til nogen klinisk-patologiske parametre (for patologiske data ser Supplerende tabeller S1 og S2). Men for pancreas tumorer, forskellen værdier Gb3Cer /CD77-ekspression korrelerer med graden af ​​tumor differentiering (P = 0,039, τ = 0,396), hvilket indikerer højere niveauer af Gb3Cer /CD77 i mindre differentierede maligniteter. Denne sammenhæng mellem dårlig differentiering af tumorer hos patienter med Gb3Cer /CD77 overekspression i malignt pancreas væv er afbildet i boksen parceller på figur 5C. Afslutningsvis ekspressionen af ​​Gb3Cer /CD77 er større i mindre differentieret malignt væv tyder på Stx receptoren som en potentiel markør for dårlig differentiering af pankreatiske tumorer.

Kasserne er afgrænset foroven og forneden ved 25% og 75 % percentiler. Linjerne i kasserne og de små torve angiver median og middelværdier og de to × minimum og maksimum værdier, hhv. A, men ikke signifikant (P = 0,189, n = 21), en forøget ekspression af Gb3Cer /CD77 kunne observeres i pancreas tumorer sammenlignet med normale væv. B, er udtryk for Gb3Cer /CD77 mærkbart steget i tumor kolon væv i forhold til, at der i de tilstødende normale væv indikerer en sammenhæng mellem Gb3Cer /CD77 udtryk og neoplastisk transformation (*, P = 0,021, n = 16). C, korrelation mellem Gb3Cer /CD77-ekspression og pankreatisk tumor differentiering (n = 20 patienter, fordi en tumor ikke kunne tildeles; se tabel 1). Tumorer blev inddelt i to grupper efter histopatologisk grading: grade≤2 (n = 14 patienter) og lønklasse 2 (n = 6 patienter). Rank korrelation analyse af forskel værdier peger på en statistisk signifikant højere Gb3Cer /CD77-ekspression i bugspytkirtel tumorer gradueres som . 2 (*, P = 0,039, τ = 0,396)

Diskussion

Ved klyngedannelse i lipid raft membran mikrodomæner [11], [44], oligosaccharidkæderne af GSL’er udviser stærke bindende aktiviteter over for deres ligander [45]. Derfor tumorassocierede GSL’er, dvs. GSL’er viser forhøjet udtryk i kræft sammenlignet med normale væv, er perfekt egnet til tumor diagnose og målrettede anticancer behandlinger [31], [46], [47]. Derfor har antistoffer, lectiner eller toksiner med GSL bindingsspecificiteter skabt stor interesse for onkologi.