PLoS ONE: Identifikation af Fem serumprotein Markers til påvisning af kræft i æggestokkene af antistof Arrays

Abstrakt

Baggrund

Protein og antistof arrays er dukket op som en lovende teknologi til at studere protein-ekspression og protein funktion i en high-throughput måde. Disse arrays repræsenterer også en ny mulighed for at profilere protein ekspressionsniveauerne i kræftpatienters prøver og identificere nyttige biosignaturer for klinisk diagnose, klassificering sygdom, forudsigelse, lægemiddeludvikling og patientpleje. Vi anvendte antistof arrays til at opdage et panel af proteiner, som kan tjene som biomarkører til at skelne mellem patienter med kræft i æggestokkene og normale kontroller.

Metode /vigtigste resultater

Ved hjælp af en case-kontrol undersøgelse design 34 ovariecancer patienter og 53 aldersmatchede raske kontroller, vi profileret ekspressionsniveauerne for 174-proteiner under anvendelse af antistof-array teknologi og har bestemt CA125 niveau ved hjælp af ELISA. Ekspressionsniveauerne for de proteiner blev analyseret under anvendelse 3 diskriminant metoder, herunder kunstigt neuralt netværk, klassificeringstræ og split-pointtal analyse. Et panel af 5 serum proteinmarkører (MSP-alpha, TIMP-4, PDGF-R-alfa, og OPG og CA125) blev identificeret, som effektivt kan påvise ovariecancer med høj specificitet (95%) og høj følsomhed (100%), med AUC = 0,98, mens CA125 alene havde en AUC på 0,87.

konklusioner /betydning

Vores pilot undersøgelse har vist lovende sæt af 5 serum markører for æggestokkene påvisning kræft.

Henvisning: Jiang W, Huang R, Duan C, Fu L, Xi Y, Yang Y, et al. (2013) Identifikation af Fem serumprotein Markers til påvisning af kræft i æggestokkene af antistof Arrays. PLoS ONE 8 (10): e76795. doi: 10,1371 /journal.pone.0076795

Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA

Modtaget: April 15, 2013; Accepteret: August 28, 2013; Udgivet: 8 oktober 2013

Copyright: © 2013 Jiang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev delvist støttet af RayBiotech Biomarkør Discovery Pilot Grant. Forfatterne vil gerne udtrykke deres tak for støtte af de førende videnskabsmand projekt for Guangzhou økonomiske udvikling distriktet (2009L-P180); Program hundrede førende innovatører og iværksættere (LCY201111); Guangdong innovative forskerhold program (201001s0104659419), og forskningsbevillinger fra den økonomiske udvikling distriktet Guangzhou (2010Q-P450). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Weidong Jiang, Ruochun Huang og RUO-Pan Huang er medarbejdere i RayBiotech, Inc. , der udvikler og kommercialiserer protein array-teknologier og produkter. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kræft i æggestokkene er den tredje hyppigste kræftform og er en af ​​de førende årsager til kræft død blandt kvinder i USA og Europa [1-3]. De fleste symptomer på kræft i æggestokkene er vage og ligner dem ofte opleves med mere almindelige, ikke-livstruende sundhedsmæssige betingelser; disse kan omfatte abdominal hævelse eller oppustethed, bækkensmerter eller ubehag, lændesmerter, tab af appetit eller følelse fuld hurtigt, vedvarende fordøjelsesbesvær, gas eller kvalme og ændringer i tarm eller blære vaner. Som følge heraf er næsten 80% af patienter med ovariecancer diagnosticeret på senere stadier. Desværre, det 5-årige overlevelsesrate for patienter med klinisk fremskreden kræft i æggestokkene er kun 15% til 20%, i slående kontrast til et 5-års overlevelse på over 90% for patienter med stadium I sygdom. Derfor er det vigtigt at opdage og udvikle biomarkører for æggestokkene kræftscreening og tidlig påvisning.

I øjeblikket, CA-125 og billedbehandling er de 2 mest almindelige tilgange til æggestokkene kræftscreeningstest. Men disse 2 markører, enten anvendt alene eller i kombination, er ikke anvendelige screening eller diagnostiske formål på grund af lav specificitet og /eller sensitivitet. For eksempel har serum CA-125 vist sig at have en følsomhed på . 98%, men en specificitet på kun 50-60% for den tidlige fase sygdom [4-6]

Flere undersøgelser er blevet rapporteret at identificere serum ovariecancer biomarkører hjælp multiplex antistof array-teknologi [7-9]. Dr. Lokshin gruppe identificeret en gruppe af 6 serumprotein markører, herunder interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), epidermal vækstfaktor (EGF), vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF), monocyt-kemoattraktant-protein -1 (MCP-1), og CA-125, som vist signifikant forskel i serumkoncentrationer mellem ovariecancer og kontrolgrupper med 84% sensitivitet ved 95% specificitet [7]. Dr. Gil Mor gruppe identificeret et panel af 6 biomarkører, CA-125, osteopontin (OPN), insulin-lignende vækstfaktor 2 (IGF-II), makrofag migration inhibitorisk faktor (MIF), leptin og prolactin, som viste en følsomhed på 95,3 % og en specificitet på 99,4% til påvisning af ovariecancer [8]. Brug human biotin-baserede antistof arrays, vi screenede serum udtryk profiler af 507 proteiner i serumprøver fra 47 patienter med ovariecancer, 33 patienter med benign æggestokkene masser og 39 raske, alder-matchede kontroller og identificerede væsentlige forskelle i proteinekspression mellem normal kontroller og patienter med kræft i æggestokkene (

P

0,05). Ved analyse klassificering og split-pointtal analyse af disse 2-grupper, en 6-markør panel af proteiner, som bestod af interleukin-2-receptor-alfa (IL2Rα), endothelin, osteoprotegerin (OPG), vaskulær endothelial vækstfaktor D (VEGF-D ) og betacellulin (BTC), kan anvendes til at skelne Ovariecancerpatienter fra normale individer [9]. Disse undersøgelser tyder på, at antistof-array teknologi har vist stor løfte i opdagelsen og udviklingen af ​​serum ovariecancer biomarkør profiler og kraftigt, at serum cytokin paneler kan være nyttige som biomarkører for tidlig påvisning af kræft i æggestokkene.

I denne undersøgelse, vi brugt vores 174-markør, sandwich-ELISA-baserede antistof array-paneler til at screene serumprøver fra 34 æggestokkene kræftpatienter og 53 normale, sunde personer med henblik på at identificere et serum protein markør panel til påvisning af kræft i æggestokkene.

Resultater

Validering af 174-markør semikvantitative cytokin arrays (figur 1, 2)

Panel A (til venstre) viser stærk intra-assay korrelation (samme prøve analyseret på samme objektglas , testet på samme dag); Panel B (midten) viser stærk inter-assay korrelation (samme prøve analyseret på forskellige objektglas, testet på forskellige dage); Panel C (højre) viser dårlig korrelation mellem cancer og normale prøver analyseret på samme objektglas, testet på samme dag

Panel A (til venstre) viser repræsentative fluorescerende signal billeder til arrayet G6.; Panel B (midten) viser repræsentative fluorescerende signal billeder til arrayet G7; Panel C (højre) viser repræsentative fluorescerende signal billeder til arrayet G8.

I denne undersøgelse har vi anvendt antistof-array teknologi til at bestemme ekspressionsniveauerne profiler af 174 cytokiner i serum fra patienter med ovariecancer og alders- matchede raske normale kontroller. Cytokiner i denne undersøgelse omfattede antiinflammatoriske cytokiner, proinflammatoriske cytokiner, vækstfaktorer, angiogene faktorer eller kemotaktiske cytokiner, blandt andre. Nogle af disse cytokiner angiveligt ændres i æggestokkene kræftpatienter fra vores egne undersøgelser og litteratur, men vores brede skærm af 174 proteiner også mange andre typer af markører som del af en “uvildig” tilgang for at bruge højt indhold high-throughput cytokin antistof-arrays at profilere cytokinniveauer fra ovariecancer patienters serum med det mål at identificere potentielle diagnostiske biomarkører.

først vi yderligere bestemt reproducerbarheden af ​​assayet i analyse af humant serum under anvendelse scatter-plot-analyse. Intra-slide reproducerbarhed for glas-slide-baserede arrays blev vurderet ved at teste replikere alikvoter af de samme prøver med to under-arrays trykt på samme glas og analyseret på samme tid. Den indbyrdes slide reproducerbarhed blev bestemt under anvendelse af to forskellige sider trykt med de samme arrays blev analyseret under anvendelse dobbelte portioner af de samme prøver på to forskellige dage. De Pearson korrelationskoefficienter for intra-slide og inter-slide reproducerbarhed var 0,923 (

P

0,001) og 0,899 (

P

0,001) henholdsvis tyder høj reproducerbarhed af analysen. I modsætning hertil Pearson korrelationskoefficienten for cancer vs. normale prøver var 0,226 (

P

0,005)., Hvilket antyder, at cancer prøver og normale prøver er fra to forskellige populationer

Dernæst serum fra i alt 34 patienter med ovariecancer og 53 raske kontroller blev analyseret for ekspressionsniveauer af 174 cytokiner med det formål at opdage nye diagnostiske markører for ovariecancer. Disse serumprøver blev primært opnået fra vores samarbejdspartnere og var alders- og køn-matchede (tabel 1). Menneskelig Cytokine Antibody Arrays blev brugt til at profilere ekspressionsmønstre for 174 cytokiner i alle 87 patienters serumprøver. Signalintensiteten er proportional med ekspressionsniveauet af et individuelt protein i hver prøve. Array data blev derefter normaliseret på grundlag af gennemsnittet positive styresignal intensitet hvert array. De mediane signalintensiteter af hver plet blev derefter korrigeret for lokal baggrund. At etablere et signal tærskel, signalintensitet cut-off værdi blev bestemt ved +/- 2SD af 10 pufferblindprøve kontrol signalintensiteter, hvor grupperingerne var inkuberet med blokerende buffer i stedet for patientens serumprøver. Eventuelle værdier, som overstiger tærskelværdien signal blev anset som rigtige signaler (dvs. en positiv påvisning af cytokin). Værdier lavere end signalet cut-off blev tildelt en værdi på 1. Hvis målte signal intensitet værdier fra alle prøver for en bestemt cytokin blev en, blev disse cytokiner fjernet fra listen til yderligere analyse.

Kræft i æggestokkene

Sund Kontrol

I alt Antal

3453Mean Age61.751.2Median Age6656.2Age Range26-7928-79

Cancer Characteristis

Histologi

serøs Adenoocarcinoma29Mucous Adenocarcinoma4Germline tumor1

Stage

Stage I4Stage II3Stage III IV25NA2Table 1. Undersøgelse befolkningskarakteristika.

CSV Hent CSV

Identifikation af serum proteinmarkører med kunstigt neuralt netværk analyse (figur 3)

3a. Kunstig neurale netværk analyse af 174-markør antistof array-resultater, der sammenligner ovariecancer og raske kontrolpersoner. Prøver, der repræsenterer både den indstillede træning og forudsigelse sæt er afbildet i grafen.

3b. De øverste 8 markører med den største effekt i kunstigt neuralt netværk analyse af 174-markør antistof arrays i æggestokkene og raske kontrolpersoner præsenteres.

Efter normalisering og filtrering, blev dataene derefter udsat for kunstig neurale netværk (ANN) analyse. blev tilfældigt inddelt Data signal intensitet for de enkelte patienter i træningssættet (N = 51) eller forudsigelse sæt (N = 36). I forudsigelse discovery fasen, blev den indstillede uddannelse analyseret med leave-en cross-validering tilgang. Gennem denne analyse, blev identificeret i alt 8 prædiktorer. Disse 8 prædiktorer blev derefter anvendt til at forudsige sygdomsstatus i forudsigelse sæt. Den korrekte overenskomst forudsagt sygdomsstatus ved hjælp af 8-markør panel med klinisk diagnose i træningssættet og forudsigelse sæt var 82% og 80% henholdsvis.

Identifikation af 5-markør panel til påvisning af kræft i æggestokkene (figur 4 og 5)

Panel A (øverst til venstre): Dot histogram plot med 5-analyt split-point score klassificering af sera fra raske kontrol (N) og ovariecancer (CA). Korrekt klassificeret normale serumprøver skal have en score på 0 til 2, mens prøver fra æggestokkene kræftpatienter skal have en score på 3 og 5; Panel B (øverst til højre): ROC-kurven for 5-markør panel af split-score analyse af kræft i æggestokkene vs. raske kontrolpersoner. ROC er kurven afbildet af følsomhed (sande positive) mod 1-specificitet (falske positive) værdier; Panel C (nederst til højre): Tabel hjælp fem-markør split-point score til at klassificere æggestokkene kræftpatienter. En cut-off score på 3 blev anvendt.

Dernæst af disse 8 markører, valgte vi 4, makrofagstimulerende protein alfa (MSP-alpha), vævsinhibitor af metalloproteinaser-4 (TIMP-4 ), blodpladeafledt vækstfaktor receptor alpha (PDGF-R-alpha), og osteoprotegerin (OPG), for hierarkiske klyngeanalyse hjælp SPSS software. Brug af 4-markørpanel ovenfor, blev 83% af prøverne korrekt identificeret (95% af raske kontrolpersoner og 62% af ovariecancere).

Endelig blev alle 87 prøver analyseret ved de ovenfor identificerede 4 serummarkører plus CA125 hjælp split-point score analyse. Brug af cutoff score på 3, 100% ovariecancer og 95% sunde kontrolprøver blev identificeret korrekt, hvilket giver den samlede korrekt aftale på 96,6%.

Da CA125 er den mest udbredte markør for kræft i æggestokkene, vi sammenlignet AUC mellem CA125 alene til den for vores 5-markør panel, som bestemt af ROC kurver. CA125 alene har en AUC på 0,87. På den anden side, vores nyligt identificerede 5-markør panel har en AUC på 0,98. Således har vores pilotundersøgelse identificeret en lovende sæt af 5 serum markører for tidlig påvisning af kræft i æggestokkene.

Validering af 5-markør panel til påvisning af kræft i æggestokkene med ELISA-assay (figur 6)

Niveauer af to proteinmarkører (MSP-alfa og TIMP-4) er identificeret som værende udtrykkes forskelligt i kræft i æggestokkene prøver ved hjælp af antistof arrays blev bekræftet med ELISA. De antistof array-data var fuldstændig overensstemmende med ELISA data i klassificere sera fra patienter med ovariecancer og raske kontrolpersoner. Antistof array-data er vist som median matrix signalintensitet (FI), og ELISA data er vist som gennemsnitlig proteinkoncentration (ng /ml).

For at bekræfte multipleks detektering af array-data, udførte vi single-target ELISA-assays til kvantitativ måling ekspressionsniveauerne af disse cytokiner individuelt, og disse resultater blev sammenlignet med array-data. De relative ekspressionsniveauer for proteiner målt ved array og ELISA var ens (se figur 6). Alle 4 markører (MSP-alfa, TIMP-4, PDGF-R alfa, og OPG) identificeret af ANN analyse og split-point score analyse blev bekræftet af ELISA kits. Figur 6 viser repræsentative data for to af disse markører, MSP-α og TIMP-4.

Discussion

CA125 er en af ​​de vigtigste biomarkører for ovariecancer. Det er ofte brugt effektivt til overvågning behandlingsrespons og afsløre tilbagefald af kræft i æggestokkene. Men CA125 alene er ikke et nyttigt diagnostisk markør for klinisk anvendelse på grund af sin lave specificitet; med en henvisning cutoff værdi på 35 IU /ml, viste CA125 begrænset specificitet på 50-60% med følsomheden af ​​ 98% for den tidlige fase sygdom [4-6]. Elevation af CA125 kan påvises i omkring 0,2-5,9% sund kvindelig og 2.2-27.8% patienter med benigne æggestokkene sygdomme [10]. Elevation af CA125 blev observeret i kun 50% af trin I æggestokkene kræftpatienter og forhøjes til 90% eller derover i fase III og IV ovariecancer patienter [11].

På grund af den kompleksitet og heterogenitet af ovariecancer det er usandsynligt, at en enkelt biomarkør vil være i stand til at detektere alle undertyper og stadier af sygdommen med en høj specificitet og følsomhed. Ved at søge litteratur og anden kilde, Drs. Polanski og Anderson har udarbejde en liste over 1261 proteiner menes at være udtrykkes forskelligt i human cancer [12]. Blandt disse er 260 kandidat biomarkører betragtes som “højt prioriterede”, fordi de er blevet impliceret som potentielle cancermarkører i flere publikationer i litteraturen og fordi de fleste af dem er blevet rapporteret at være påviselige i serum eller plasma. Vi inkluderede mange af disse biomarkører i vores antistofbaseret biomarkør screening.

Cytokiner er en forskelligartet gruppe af proteiner bestående af cytokiner, kemokiner, vækstfaktorer, interferoner, adipokiner og lymfokiner og spille mange kritiske roller fysiologisk og patologisk processer. Det er også velkendt, at cytokiner, kemokiner, vækstfaktorer, angiogenesefaktorer, proteaser, apoptotiske faktorer, receptorer, adhæsionsmolekyler og adipokiner spiller vigtige roller i cancerudvikling, progression og metastase. Voksende tyder på, at et komplekst cytokin netværk er involveret i kræft i æggestokkene. En række autokrine og parakrine cytokin loops er blevet identificeret i ovariecancer og påvirke biologi denne tumor. Påvisning af ekspressionsmønstre af flere cytokiner kan give ny indsigt om kræft biologi, identificere nye molekylære mål for kræftbehandling og opdage nye biomarkører for diagnose og prognose af sygdom [13,14].

I denne undersøgelse har vi demonstreret effektiviteten af ​​screening af et semi-kvantitativ, sandwich-baserede antistof-array detektion et panel af 174 markører i serum fra 34 patienter med ovariecancer og 53 aldersmatchede raske kontroller til at identificere et panel af 5 serum proteinmarkører, herunder CA125, at effektivt kan opdage kræft i æggestokkene med høj specificitet (95%) og høj følsomhed (100%) med AUC på 0,98. Disse markører blev valideret med ELISA-assay.

Vi observerede, CA125 alene har en AUC på 0,87, på den anden side, vores nyligt identificerede 5-markør panel har en AUC på 0,98, hvilket indikerer forbedret effektivitet, når påvisning af CA125 kombineres med andre 4 formodede protein biomarkører for detektion af ovariecancer (TIMP-4, OPG, PDGF-R-alpha, og MSP-alpha).

TIMP-4 hører til matrixmetalloproteinase (MMP) superfamilien. MMP’er er væsentlige elementer i extraceullular matrix (ECM) nedbrydning, herunder regulering af frigivelsen af ​​ECM-bundne cytokiner og vækstfaktorer, som fører til angiogenese, cellulær invasion og med tiden i mange cancere, metastase. Disse MMP’er tæt kontrolleret og reguleret af flere TIMP’er, hvoraf flere synes at spille en afgørende rolle i tumorigenese. Chegini Lab har rapporteret forhøjet udtryk for TIMP-4 i kræft i æggestokkene væv ved IHC-analyse, der angiver dens potentielle rolle i tumorigenese af ovariecancer [15].

OPG tilhører TNF superfamilien og kan være knyttet til den nukleare faktor kappa-let kæde-enhanceren af ​​aktiverede B-celler (NFKB) og tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) signalveje. OPG blev først identificeret ved dens evne til at regulere homøostase af knogle remodellering. Piche Lab rapporterede dog, at OPG kan tjene som sådan overlevelse faktor ved at beskytte TRAIL-induceret apoptose i æggestokkene cancerceller, hvilket indikerer dens potentielle rolle i udviklingen og progressionen af ​​ovariecancer [16].

PDGF-R-alfa er en receptor i PDGF-superfamilien. Tjener som angiogene vækstfaktorer, PDGF’er spiller vigtig rolle i cellevækst, kemotaxi, angiogenese og, i forbindelse med kræft, genopbygning af tumor stroma mikromiljøer. Jakobsens Lab rapporteret, at PDGF-R-alpha udviste højere ekspression i ovariecancer væv sammenlignet med tilstødende normale væv [17]. Det blev også rapporteret, at PDGF-R alpha udtrykkes oftere i serøse carcinomer end i endometriod og mucinøse tumorer [18], hvilket er i overensstemmelse med resultaterne af vores undersøgelse, hvor de fleste af tumorer testet (29 af 34) var serøs .

MSP er en vækstfaktor involveret i aktivering makrofagstimulerende receptor-1 (MSTR1). A-kæden af ​​MSP (MSP-alpha) secerneres ved spaltning af pro-MSP. Der er rapporter, der viser, at MSP-vejen spiller en vigtig rolle i tumormetastase [19].

Sammenfattende hjælp 174-markør cytokin-antistof-array teknologi, der er konstateret vi et panel af 5 serum proteinmarkører som kan detektere æggestokkene kræft med både høj specificitet og høj følsomhed, hvilket indikerer dens lovende ansøgning skræddersyet medicin til æggestokkene påvisning kræft. Derudover mene, at en relativt lille stikprøve (N 100), der anvendes i denne undersøgelse opnåede en ekstremt høj følsomhed (100%) og relativt høj specificitet (95%), tilbyder vi nogle håb om, at validering af multi-biomarkør panel dag kan være nyttigt at screene for en dødelig kræft, der sjældent bliver diagnosticeret i de tidlige stadier.

protein og antistof arrays er dukket op som en lovende teknologi til at studere protein-ekspression og protein funktion i en high throughput måde. Disse protein og antistof arrays præsentere en ny mulighed for at profilere protein ekspressionsniveauerne i kræftpatienters prøver og identificere nyttige biosignaturer for lægemiddeludvikling og patientpleje. Vores 5-markør panel effektivt kunne skelne ovariecancer fra raske kontroller Disse 5 individuelle markører er ikke unikke for ovariecancer, som det fremgår af deres udtryk i andre typer kræft, herunder brystkræft [18-22], lungekræft [23], kolorektal kræftformer [24], prostatakræft [25,26], hepatocellulært karcinom [27], pancreascancer [28], osv Derfor vil det være meget vigtigt og interessant at undersøge, om denne kombination af 5-markører kan registrere andre cancertyper såvel. To af de vigtigste komponenter i biomarkør opdagelse program er af høj kvalitet af patienternes prøver og høje-indhold screening og avanceret teknologi. Derfor vil kombinationen af ​​gennemprøvede antistof-baseret detektion teknologi og platforme fra os og velkarakteriserede præ-diagnostiske prøver fra PLCO på National Cancer Institute (NCI) giver en enestående mulighed for biomarkør opdagelse og validering [29,30]. Disse undersøgelser vil ikke kun tjene til at validere den specifikke biomarkør panel identificeret i denne undersøgelse; de vil være med til at validere brugen af ​​antistof arrays som en high-throuput tilgang til at identificere kræft biomarkører for sygdomme screening og detektion.

Materialer og metoder

Denne protokol er blevet godkendt af sterling institutionelle gennemgang bestyrelse. IRB ID: 3303. Gennemgangen bord er sterling uafhængig tjeneste, Inc ligger i 6300 beføjelser Ferry Road, suite 600-351, Atlanta, GA 30339. Skriftligt samtykke blev opnået, når indsamling af prøver fra både patienter og raske kontrolpersoner

Etisk Statement

skriftligt samtykke blev opnået, når indsamling af prøver fra både patienter og raske kontrolpersoner.

prøvetagning

De serumprøver fra 34 patienter diagnosticeret med tidlig-fase (I og II) eller sene (III og IV) æggestokkene og 53 aldersmatchede raske kontrolpersoner, der indgår i undersøgelsen, blev indsamlet fra den tilknyttede hospital, Sun Yat-sen University. Kort fortalt blev ca. 2 ml veneblod fra patienter. Serum blev opsamlet og opbevaret ved -80 ° C indtil brug. Information om kræft i æggestokkene diagnose, iscenesættelse, histologi, grad og alder var til rådighed for os, men de unikke identifikation af patienten, såsom navn, adresse, fødselsdato, blev ikke givet.

Antistof-array teknologi

Semi-kvantitative sandwich-baserede antistof arrays (RayBio

® Menneskelig Cytokine Array G-Serie 2000) blev udviklet som 3 forskellige arrays (human Cytokine arrays G6, G7 og G8), der hver repræsenterer et unikt sæt af 54 til 60 antigenspecifikke antistoffer til påvisning i alt 174 serummarkørerne på et objektglas matrix. Et par af antistoffer er påkrævet for at detektere hver analyt. Objektglas blev trykt som 4 eller 8 identiske sub-arrays bestående af pletter af hvert antigen-specifik apture antistof til den opstilling. De tilsvarende detektionsantistoffer var biotinmærket og kombineres som en enkelt cocktail reagens til senere brug. Trykte objektglas blev anbragt i kammeret assemblies at muliggøre inkubation af hver sub-array med en anden prøve. Efter blokering hver sub-array med en blokerende buffer, blev sub arrays inkuberet med serumprøver. Efter omfattende vask til fjernelse af ikke-specifik binding, blev den cocktail af biotinylerede detektionsantistoffer tillægges arrays. Efter omfattende vask blev array-objektglas inkuberet med et streptavidin-konjugeret fluor (HiLyte Fluor ™ 532, fra Anaspec, Fremont, CA). De fluorescerende signaler blev derefter visualiseret under anvendelse af laser-baserede scanner systemet (GenePix 4200A, Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) under anvendelse af grønne kanal. For at øge nøjagtigheden blev to gentagelser pr antistof spottet, og gennemsnittet af den mediane signalintensiteter for begge pletter (minus lokal baggrund subtraktion) blev anvendt til alle beregninger. Gennem disse forbedringer, kan vi få en variationskoefficient (CV) på ca. 10% ved hjælp af vores glas-slide-platform.

ELISA-analyse

ELISA blev udført i overensstemmelse med RayBio® ELISA manual (RayBiotech , Inc., Norcross, GA, USA). Kort fortalt præ-coatede 96-brønds ELISA-plader med indfangede antistoffer blev først blokeret af en blokerende buffer. Identiske alikvoter (100 mikroliter per brønd) af fortyndede sera og flere fortyndinger (dvs. koncentrationer) af standard protein blev påført på ELISA-pladen. Pladerne blev derefter inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur (RT). Ubundne materialer blev vasket ud, og biotinyleret anti-cytokin detektionsantistof blev tilsat til hver brønd. Pladerne blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask blev 100 mikroliter af streptavidin-konjugeret HRP-reagens sat til brøndene, og pladen blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter omfattende vask blev farveudvikling udført ved inkubering med HRP-substrat. Efter tilsætning stopopløsning blev den optiske densitet (OD) ved 450 nm bestemmes for hver brønd under anvendelse af en mikropladelæser, og koncentrationerne af prøverne blev bestemt ved sammenligning med de faste koncentrationskurver.

Dataanalyse

En justeret t-test blev anvendt til at teste signifikans mellem protein ekspressionsniveauer i cancer og æggestokkene sunde kontrolprøver.

P

værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

For at bestemme den tærskel signal, signaler fra de arrays blev målt i fravær af prøver (ved anvendelse blokerende buffer som en blank) og gentaget 10 gange. De signaler, der genereres ved hjælp af blindprøver blev midlet og standardafvigelsen (SD) blev beregnet. Signaler med værdier lavere end den gennemsnitlige blank signal + 2 x SD blev betragtet som baggrund.

data blev også analyseret ved hjælp af neurale netværk. Denne kraftfulde værktøj tillader os at finde fælles protein udtryk profiler at forudsige kræft. I fase én undersøgelse blev 80% af prøverne randomiseret til træningssættet og de resterende 20% af prøverne blev anvendt som test sæt. Fordelen ved denne fremgangsmåde er den succes forudsigelse vil blive mere nøjagtige over tid, efterhånden som der foreligger flere data.

Data blev også analyseret ved split-pointtal analyse. Opdelingen punkt opdeler udfaldsrummet i to intervaller, en for kræft i æggestokkene og en for normale kontroller. Den bedste split-point score på hver markør blev valgt for at sikre minimering af forkert klassificerede prøver. For hver markør, blev en score på 0 overdraget til en prøve, hvis det faldt i den normale kontrol interval for denne markør; en score på 1 blev tildelt til en prøve, hvis det faldt i kræft i æggestokkene interval. Samlet set blev en person tildelt en score som summen af ​​disse tildelte scorer for

N

forskellige markører. Derfor rækken af ​​sådanne score var mellem 0 til

N

. En given tærskel (

T

) blev valgt til optimalt adskilt ovariecancer fra raske kontrolpersoner, dvs. en given person med en samlet score

T

forudsiges at have normal status, hvorimod en individuel med en samlet score .

T

blev diagnosticeret som kræft i æggestokkene

Ud fra ovenstående data, vi beregnet specificitet, sensitivitet, positiv prædiktiv værdi (PPV) og negative prædiktive værdi (NPV) . ROC blev også bestemt.

Tak

Vi takker Brett Burkholder for konstruktive diskussioner og redigering af dette dokument.