PLoS ONE: MIR-143 og MIR-145 Regulere IGF1R at undertrykke Cell Proliferation i kolorektal Cancer

Abstrakt

Insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor (IGF1R) er en transmembrane receptor, der aktiveres af insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF-1) og ved en relateret hormon kaldet IGF-2. Det hører til den store gruppe af tyrosinkinasereceptorer og spiller en vigtig rolle i colorektal cancer ætiologi og progression. I denne undersøgelse anvendte vi bioinformatiske analyser for at søge efter miRNA, der potentielt er målrettet IGF1R. Vi identificerede specifikke målsteder for MIR-143 og MIR-145 (MIR-143/145) i 3′-utranslaterede region (3′-UTR) af IGF1R genet. Disse miRNA er medlemmer af en klynge af miRNA, der er blevet rapporteret at udvise tumorsuppressoraktivitet. I overensstemmelse med bioinformatiske analyser, vi identificeret en omvendt korrelation mellem miR-143/145 niveauer og IGF1R protein niveauer i kolorektale kræft væv. Ved overekspression miR-143/145 i Caco2, HT29 og SW480 colorectal kræftceller, vi eksperimentelt valideret, at miR-143/145 direkte genkender 3′-UTR af IGF1R udskrift og regulerer IGF1R udtryk. Desuden blev de biologiske konsekvenser af målretning af IGF1R by miR-143/145 undersøgt ved celleproliferationsassays

i

vitro

. Vi viste, at undertrykkelsen af ​​IGF1R af miR-143/145 undertrykte proliferation af Caco2 celler. Tilsammen vores resultater giver evidens for en rolle miR-143/145 klynge som en tumor suppressor i kolorektal cancer gennem hæmning af IGF1R oversættelse

Henvisning:. Su J, Liang H, Yao W, Wang N, Zhang S, Yan X, et al. (2014) MIR-143 og MIR-145 Regulere IGF1R at undertrykke Cell Proliferation i kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (12): e114420. doi: 10,1371 /journal.pone.0114420

Redaktør: Cecilia Williams, University of Houston, USA

Modtaget: 19 Maj 2014; Accepteret: November 10, 2014; Udgivet: December 4, 2014

Copyright: © 2014 Su et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Basic Research Program Kina (973 Program) (nr 2014CB542300), National Natural Science Foundation Kina (nr 81.101.330, 31.271.378 og 81.250.044.) og Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (nr BK2011013 og BK2012014.)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft i verden, og det er mere udbredt i de udviklede lande [1]. Det anslås, at den rå gennemsnitlige forekomst af kolorektal cancer i Sydøstasien for begge køn var 6.95 /100000 befolkning i 2008 og forekomsten øges med alderen [2]. På molekylært niveau, opstår colorektal cancer fra en række genetiske og epigenetiske ændringer, som inaktiverer tumorsuppressorgener og aktiverer onkogener [3]. Imidlertid er de grundlæggende mekanismer bag tarmkræft initiering og progression forbliver stort set ukendt.

Insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor (IGF1R), en tyrosinkinasereceptor for IGF-1 og IGF-2, ofte overudtrykkes i tumorer og er veldokumenteret i cellekultur, dyreforsøg og mennesker spiller en rolle ved malign transformation, progression, beskyttelse mod apoptose og metastase [4], [5]. IGF receptorfamilie består af tre transmembrane proteiner, og IGF1R genet er lokaliseret på kromosom 15q26, som koder for et enkelt polypeptid på 1367 aminosyrer, som udtrykkes konstitutivt i de fleste celler [5]. IGF1R aktivering fører til autophosphorylering af tyrosiner 1131, 1135 og 1136 i kinasedomænet, efterfulgt af phosphorylering af juxtamembrane tyrosiner og carboxyterminale seriner [6]. Dette efterfølges af rekruttering af specifikke docking mellemprodukter, herunder insulin-receptor substrat-1 (IRS-1), Shc og 14-3-3-proteiner [7], [8]. Disse molekyler knytte IGF1R til forskellige signalveje, hvilket tillader induktionen af ​​vækst, transformation, differentiering og beskyttelse mod apoptose [9]. Ved IGF-1-binding, IGF1R aktiverer PI3K /Akt kaskade, som fremmer G1 til S cellecyklusprogression og hæver celleproliferation [10], [11]. IGF1R overudtrykkes under kolorektal carcinogenese, med den højeste ekspression observeret i de prolifererende celler i bunden af ​​tyktarmen krypter [11], [12]. Dog forbliver rolle IGF1R i kolorektal cancer, som skal belyses.

Gennem det seneste årti, en ny klasse af små RNA molekyler kaldet microRNA (miRNA) er dukket op som vigtige regulatorer af indledningen og progression af menneskelig cancere, herunder colorectal cancer [13] – [15]. miRNA er små (-22-nukleotider lang), enkeltstrenget ikke-kodende RNA-molekyler, der negativt regulerer genekspression ved binding til 3′-utranslaterede region (3′-UTR) af mål-mRNA molekyler, hvilket resulterer i enten nedbrydning af transkriptet eller inhibering af translation [16] – [18]. Mange miRNA arbejde sammen med hinanden for at finjustere proteinekspression på globalt plan. Således miRNA spiller en væsentlig rolle i post-transkriptionel genregulering. Vigtigere, nyere undersøgelser viser, at dysregulering af miRNA er forbundet med humane maligniteter og foreslå en kausal rolle miRNA i cancer ætiologi [19]. miRNA formentlig spille en rolle i kræft, fordi de kan påvirke oversættelse og stabilitet af målrettede onkogener eller tumor undertrykkere, som i sidste ende påvirke cellulære fysiologi [19], [20]. For eksempel MIR-143 og MIR-145 (MIR-143/145), som er placeret i en klynge i 5q32-33 kromosomale region, der nedreguleres i mange cancertyper, herunder colorectal cancer [21], [22] . MIR-143 og MIR-145 har vist sig at have anti-tumorigen aktivitet, herunder involvering i forskellige cancer-relaterede processer såsom proliferation, invasion og migration [23].

Selvom dysregulering af IGF1R og miRNA er forbundet med tumorigenese i human colorectal cancer, er lidt om miRNA, der virker på IGF1R. I denne undersøgelse fandt vi, at IGF1R blev reguleret direkte af miR-143 og miR-145 i kolorektale cancerceller. Desuden viste vi, at miR-143/145 kan hæmme IGF1R udtryk til at undertrykke spredning af kolorektal cancer celler.

Materialer og metoder

humant væv

tyktarms kræft væv og parrede tilstødende noncancerous væv blev opnået fra patienter, der gennemgår kirurgiske indgreb på The First Affiliated Hospital i Anhui Medical University (Hefei, Kina). Både tumorer og noncancerous væv blev udsat for histologisk analyse til diagnostisk bekræftelse. Den patologiske type af hver kræft blev identificeret som adenocarcinom. Skriftligt samtykke blev leveret af alle de patienter eller deres værger, og den etiske komité i The First Affiliated Hospital i Anhui Medical University godkendt alle aspekter af denne undersøgelse. Vævsfragmenter blev straks nedfrosset i flydende nitrogen på tidspunktet for kirurgi og opbevaret ved -80 ° C. De kliniske funktioner i patienter er anført i tabel S1in File S1.

Cell kultur

De humane kolorektale cancer cellelinjer Caco2, HT29 og SW480 blev købt fra Shanghai Institute of Cell Biology, kinesisk Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Caco2-celler blev dyrket i DMEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Gibco) i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO

2; HT29 og SW480-celler blev dyrket i RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Gibco) i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO

2.

RNA-isolering og kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra de dyrkede celler og væv under anvendelse af Trizol Reagent (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Assays at kvantificere modne miRNA blev udført under anvendelse TaqMan microRNA prober (Applied Biosystems, Foster City, CA) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt, 1 ug totalt RNA blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af AMV-revers transkriptase (Takara, Dalian, Kina) og en stamme-loop RT primer og en tiendedel af cDNA blev anvendt pr qPCR reaktion (Applied Biosystems). Reaktionsbetingelserne var som følger: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 minutter og 85 ° C i 5 minutter. Real-time PCR blev udført under anvendelse af et TaqMan PCR kit og en Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Reaktionerne blev inkuberet i en 96-brønds optisk plade ved 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Alle reaktioner blev kørt tredobbelt. Efter reaktionerne var fuldstændige, blev tærsklen cyklus (C

T) data bestemmes ved hjælp af faste tærskel indstillinger, og den gennemsnitlige C

T blev bestemt fra tredobbelte PCR. En sammenlignende fremgangsmåde C

T blev anvendt til at sammenligne hver betingelse til kontrol- reaktioner. U6 snRNA blev anvendt som en intern kontrol, og den relative mængde af miRNA normaliseret til U6 blev beregnet med ligning 2

-ΔΔCT, hvor ΔΔC

T = (C

T miRNA-C

T U6)

målret- (C

T miRNA-C

T U6)

kontrol.

for at kvantificere IGF1R og GAPDH mRNA, 1 ug total RNA blev omvendt transskriberet til cDNA under anvendelse af oligo d (T) 18-primere (Takara) og Thermoscript revers transkriptase (Invitrogen). Reaktionsbetingelserne var som følger: 42 ° C i 60 min og 70 ° C i 10 minutter. Real-time PCR blev dernæst udført med RT produktet, SYBR Green farvestof (Invitrogen) og specifikke primere til IGF1R og GAPDH. Sekvenserne for primerne var som følger: IGF1R (sense): 5′-GCCAAGCTAAACCGGCTAAA-3 ‘; IGF1R (antisense): 5’-TATCCTGTTTTGGCCTGGACATA-3 ‘; GAPDH (sense): 5’-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3 ‘; og GAPDH (antisense): 5’-CGCTCATTGCCGATAGTG-3 ‘. Reaktionerne blev inkuberet ved 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 1 min. Efter reaktionerne var fuldstændige, C

T-værdier blev bestemt ved at sætte en fast tærskel. Den relative mængde af IGF1R mRNA blev normaliseret til GAPDH.

miRNA overekspression

miRNA overekspression blev opnået ved transfektion af celler med en miRNA mimic, et syntetisk RNA oligonukleotidduplex efterligner miRNA precursor. Syntetiske RNA-molekyler, herunder prækliniske MIR-143, præ-MIR-145 og en kodet negativ kontrol-RNA (præ-MIR-kontrol), blev indkøbt fra GenePharma (Shanghai, Kina). Caco2, HT29 og SW480-celler blev podet i plader med 6 brønde og transficeret ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) den følgende dag, når cellerne var ca. 70% sammenflydende. For miRNA overekspression eksperimenter, 100 pmol af præ-MIR-143, 100 pmol af præ-MIR-145 eller 50 pmol af både præ-MIR-143 og præ-MIR-145 blev anvendt. Ved 6 timer efter transfektion blev mediet til Caco2-celler ændret til DMEM suppleret med 2% kalvefosterserum og mediet for HT29 og SW480-celler blev ændret til RPMI-1640 suppleret med 2% føtalt bovint serum. Cellerne blev høstet ved 24 timer eller 48 timer efter transfektion til isolering af total RNA eller protein.

Plasmidkonstruktion og siRNA interferens assay

En mammal ekspressionsplasmid (preceiver-M02 -IGF1R) udformet til specielt at udtrykke den åbne læseramme i fuld længde (ORF) af humant IGF1R uden miR-143/145 responsive 3′-UTR blev indkøbt fra GeneCopoeia (Germantown, MD, USA). En tom plasmid tjente som en negativ kontrol. SiRNA (sense: 5′-GCGGCUGGAAACUCUUCUATT-3 ‘; antisense: 5′-UAGAAGAGUUUCCAGCCGCTT-3’) målrettet humant IGF1R blev designet og syntetiseret ved Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). En scrambled siRNA (Invitrogen) blev inkluderet som en negativ kontrol. Overekspressionen plasmid eller siRNA blev transficeret ind Caco2-celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Totalt RNA eller protein blev isoleret 24 timer eller 48 timer efter transfektion. IGF1R mRNA og protein ekspressionsniveauer blev vurderet ved kvantitativ RT-PCR og Western blotting.

Luciferase reporter assay

Hele 3′-UTR af human IGF1R blev amplificeret ved PCR under anvendelse af human genomisk DNA som en skabelon. PCR-produkterne blev derefter indsat i p-MIR-reporterplasmid (Ambion, Austin, TX, USA). Indsættelsen blev bekræftet at være korrekt ved DNA-sekventering. For at teste bindingsspecificiteten, sekvenserne, der interagerer med frøet sekvensen af ​​MIR-143 og MIR-145 var muteret (fra UUGGGAG til AACCCUC for MIR-143 bindingssted og fra UUGGGAG til AACCCUC for MIR-145 bindingssted), og mutanten IGF1R 3′-UTR blev indsat i et tilsvarende luciferasereporterplasmid. For luciferase reporter assays, Caco2, HT29 og SW480-celler blev podet i 24-brønds plader og co-transficeret med 0,8 ug af ildflue-luciferase-reporterplasmid, 0,8 ug β-galactosidase (β-gal) ekspressionsplasmidet (Ambion), og lige mængder (20 pmol) af mIR-143/145 mimic eller en kodet negativ kontrol RNA under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen). Den β-gal-plasmid blev anvendt som en transfektionseffektivitet kontrol. Celler blev høstet 24 timer efter transfektion og analyseret for luciferaseaktivitet under anvendelse af et luciferase-assay kit (Promega, Madison, WI, USA).

Protein isolation og Western blotting

celler eller væv blev lyseret i en RIPA-lysepuffer (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,25% natriumdeoxycholat og 1 mM EDTA, pH 8,0) med frisk tilsat protease inhibitor cocktail (Roche) i 30 minutter på is og blev derefter centrifugeret ved 16.000 x g ved 4 ° C i 10 minutter. Supernatanten blev opsamlet, og proteinkoncentrationen blev beregnet med et BCA protein assay kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Proteiner blev separeret ved SDS-PAGE (Bio-Rad). Efter elektroforese blev proteinerne elektrooverført til PVDF-membraner (Bio-Rad) og derefter blokeret med 5% skummetmælk i 1 time. Membranerne blev dernæst inkuberet med primære antistoffer ved 4 ° C i 12 timer. Efter tre vaske i TBST blev membranerne inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Efter tre vaske blev membranerne inkuberet med SuperSignal West Pico kemiluminescens-substrat (Pierce). Den samme membran blev også probet med en GAPDH antistof for at tjene som en loading kontrol. IGF1R og GAPDH-antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling (# 3018) og Santa Cruz Biotechnology (sc-25.778), henholdsvis.

Celleproliferationsassay

Caco2-celler blev udpladet med 5 x 10

4 celler per brønd i plader med 96 brønde og derefter inkuberet natten over i DMEM suppleret med 10% FBS. Celler blev opsamlet ved 12, 24, 48 og 72 timer efter transfektion. Efter transfektion blev 10 pi Cell Counting Kit-8 (# C0038, Beyotime) tilsat til den tilsvarende test brønd og inkuberet i 1 time. Absorbansen blev målt ved en bølgelængde på 450 nm.

edu proliferationsanalysen

For at vurdere celleproliferation, blev Caco2 celler podet i 24-brønds plader. Cellerne blev inkuberet under standardbetingelser i komplette medier. Transfektion af celler blev udført den følgende dag som beskrevet ovenfor. Otteogfyrre timer efter transfektion blev celledeling detekteret ved hjælp af inkorporering af 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EDU) med edu Cell Proliferation Assay Kit (Ribobio, Guangzhou, Kina). Kort fortalt blev cellerne inkuberet med 50 pM edu i 3 timer før fiksering, permeabilisering og edu-farvning, der blev udført ifølge producentens protokol. Cellekernerne blev farvet med DAPI (Sigma) i en koncentration på 1 ug /ml i 10 min. Andelen af ​​celler, som indarbejdes edu blev bestemt ved fluorescensmikroskopi.

Statistisk analyse

Alle Western blotting og proliferation assay billeder er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. Kvantitative RT-PCR og luciferase reporter assays blev udført tre gange, og hver enkelt forsøg blev gentaget flere gange. Resultaterne er præsenteret som middelværdier ± SE af mindst tre uafhængige forsøg. Observerede forskelle blev betragtet som statistisk signifikant ved p. 0,05 hjælp t-test

Resultater

Identifikation af bevaret miR-143 og miR-145 target sites inden for 3′-UTR af IGF1R

Tre beregningsmæssige algoritmer, herunder Targetscan [24] og RNAhydrid [25], blev anvendt i kombination til at identificere potentielle miRNA, der er målrettet IGF1R. Alle tre algoritmer forudsagde miR-143 og miR-145 som regulatorer af IGF1R. De forudsagte interaktioner mellem miR-143/145 og målstederne i 3′-UTR af IGF1R er illustreret i figur 1A. blev observeret én forudsagt hybridisering mellem både MIR-143 og MIR-145 og 3′-UTR af IGF1R. Selv om de to målområder i 3′-UTR af IGF1R var nær hinanden, de steder var ikke-overlappende. Der var perfekt komplementaritet mellem frøet region (kernesekvensen, der omfatter de første 2-8 baser af det modne miRNA) og de beslægtede mål. De minimale fri energi værdier af hybridiseringer mellem miR-143 og IGF1R og mellem miR-145 og IGF1R var -19,8 og -24,8 kcal /mol henholdsvis som er godt inden for området af ægte miRNA målgruppen par. Endvidere blev MIR-143/145 bindingssekvenser i IGF1R 3′-UTR højt konserveret på tværs af arter. Således blev MIR-143 og MIR-145 valgt som kandidater til yderligere eksperimentel verifikation.

(A) Skematisk beskrivelse af de hypotetiske duplexer dannet af interaktionerne mellem bindingsstederne i IGF1R 3′-UTR (top ) og mIR-143/145 (nederst). Den forudsagte frie energi værdien af ​​hver hybrid er angivet. De steder frø anerkendelse betegnes, og alle nukleotider i disse regioner er stærkt konserverede over adskillige arter, herunder menneske, mus og rotte. (B) Kvantitativ RT-PCR-analyse af MIR-143 og MIR-145-niveauer i seks par af kolorektal cancer væv (C) og noncancerous væv (P) prøver. (C og D) Western blot-analyse af IGF1R proteinniveauer i seks par af prøve C og P. C: repræsentativt billede; D: kvantitativ analyse. * P 0,05; ** P. 0,01

Identifikation af en omvendt korrelation mellem miR-143/145 niveauer og IGF1R protein niveauer i kolorektal cancer væv

Interessen for miR-143/145 klynge og IGF1R blev også støttet af den nylige identifikation af disse to miRNA som kandidat tumorsuppressorer [26] og IGF1R som et onkogen i kolorektal cancer [8]. Derefter undersøgte vi, om miR-143/145 niveauer omvendt blev korreleret med IGF1R proteinekspression i kolorektale kræft væv. Efter bestemmelse af miR-143/145 og protein niveauer af IGF1R i seks par af kolorektal cancer væv og tilsvarende noncancerous væv, viste vi, at miR-143 og MIR-145 niveauer konsekvent blev nedreguleret i kolorektale cancer væv (figur 1B) , mens IGF1R protein niveauer var dramatisk højere i de kolorektale cancer væv (Figur 1C og 1D). Disse resultater viste, at miR-143/145-ekspressionsniveauer omvendt korreleret til IGF1R proteinekspression i humane kolorektale cancer væv.

Validering af IGF1R som et direkte mål for MIR-143/145

korrelation mellem miR-143/145 og IGF1R blev undersøgt yderligere ved at evaluere IGF1R udtryk i humane kolorektale cancer cellelinjer Caco2, HT29 og SW480 efter overekspression af miR-143/145. I disse eksperimenter blev overekspression opnået ved transfektion Caco2, HT29 og SW480-celler med præ-MIR-143 og /eller præ-MIR-145, som er syntetiske RNA-oligonukleotider, der efterligner MIR-143 og MIR-145 precursorer. Den effektive overekspression af miR-143/145 vist i figur 2A, 2F og 2K. Som forventet, overekspression af miR-143 og /eller miR-145 betydeligt undertrykt IGF1R protein niveauer i Caco2, HT29 og SW480-celler (figur 2B, 2C, 2G, 2H, og 2L, 2M). For at bestemme de lovgivningsmæssige niveau, hvor miR-143/145 påvirket IGF1R udtryk, vi gentog ovennævnte eksperimenter og undersøgt ekspressionen af ​​IGF1R mRNA efter transfektion. Overekspression af miR-143/145 påvirkede ikke IGF1R mRNA stabilitet (figur 2D, 2I og 2 N). Disse resultater viste, at MIR-143/145 regulerer specifikt IGF1R ekspression på post-transkriptionel niveau, som er den mest almindelige mekanisme for animalske miRNA.

(A, F og K) Kvantitativ RT-PCR-analyse af miR -143/145 niveauer i Caco2, HT29 og SW480 celler behandlet med en kodet kontrol, præ-mIR-143, præ-mIR-145 eller både før mIR-143 og præ-mIR-145. (B, C; G, H og L, M) Western blot-analyse af IGF1R proteinniveauer i Caco2 celler behandlet med en kodet kontrol, præ-MIR-143, præ-MIR-145 eller både før MIR-143 og præ -miR-145. B, G og L: repræsentativt billede; C, H og M: kvantitativ analyse. (D, I og N) Kvantitativ RT-PCR-analyse af IGF1R mRNA-niveauer i Caco2, HT29 og SW480 celler behandlet med en kodet kontrol, præ-MIR-143, præ-MIR-145 eller både før MIR-143 og præ- miR-145. (E, J og O) Direkte erkendelse af IGF1R 3′-UTR af miR-143/145. Caco2, HT29 og SW480-celler blev co-transficeret med ildflueluciferase reportere indeholdende enten vildtype (WT) eller mutant (MUT) MIR-143/145 bindingssteder i IGF1R 3′-UTR og en kodet kontrol, præ-miR- 143, præ-mIR-145 eller både før mIR-143 og præ-mIR-145. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne analyseret under anvendelse af et luciferase-assay kit. Resultaterne vises som forholdet mellem ildflue-luciferase-aktivitet i Mir-143/145 transficerede celler til aktiviteten i kontrolceller. * P 0,05; ** P. 0,01

For at afgøre, om de negative regulatoriske virkninger af miR-143/145 om IGF1R udtryk blev medieret gennem binding af miR-143/145 til de forudsagte målsteder i 3 ‘-UTR af IGF1R mRNA, den fulde længde 3′-UTR af IGF1R indeholdende to forudsagte mIR-143/145-bindingssteder blev indsat nedstrøms for ildflue-luciferase-genet i et reporterplasmid. Det resulterende plasmid blev transficeret ind Caco2, HT29 og SW480-celler sammen med en transfektionskontrol plasmid (β-gal) og enten præ-MIR-143/145 eller krypterede negative kontrolprøver RNA’er. Som forventet blev luciferaseaktiviteten markant reduceret i celler transficeret med præ-MIR-143 og /eller præ-MIR-145 (figur 2E, 2J og 2O). Endvidere har vi introduceret punktmutationer i de tilsvarende komplementære sites i 3′-UTR af IGF1R at eliminere de forudsagte MIR-143/145-bindingssteder. Denne muterede luciferase reporter var upåvirket af overekspression af miR-143/145 (figur 2E, 2J og 2O). Dette fund foreslået, at miRNA bindingssteder stærkt bidrog til miRNA: mRNA-interaktion, der formidlede den post-transkriptionel repression af IGF1R udtryk. Afslutningsvis vores resultater viste, at miR-143/145 direkte genkender og binder til 3’-UTR af IGF1R mRNA-transkript at undertrykke IGF1R ekspression i kolorektale cancerceller.

MIR-143 og MIR-145 kan undertrykker proliferation i kolorektale cancerceller

Vi fokuserede næste på at studere de roller miR-143/145 i IGF1R regulering. Fordi IGF1R er afgørende for reguleringen af ​​spredning og cellecyklus progression, vi evaluerede effekten af ​​miR-143/145 om kolorektal cancer proliferation ved hjælp af en CCK-8 assay. Til støtte for den opfattelse, at miR-143/145 fungerer som vigtige cancer undertrykt miRNA [26], Caco2, HT29 og SW480 celler transficeret med præ-miR-143/145 viste undertrykt proliferation (figur 3A, 3E og 3I). Desuden vurderede vi rollen som IGF1R på celleproliferation. At vælte IGF1R blev en siRNA målrettet IGF1R designet og transficeret ind Caco2, HT29 og SW480 celler. At overudtrykke IGF1R, blev et plasmid, der udtrykker den IGF1R ORF transficeret ind Caco2, HT29 og SW480 celler. Den effektive overekspression eller knockdown af IGF1R er vist i figur S1 i File S1. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viser, at IGF1R fremmer celledeling [27], Caco2, HT29 og SW480-celler transficeret med IGF1R overekspression plasmid tilvækst på et betydeligt højere sats (figur 3C, 3G og 3K), hvorimod IGF1R knockdown med siRNA signifikant undertrykte proliferation (figur 3B, 3F og 3J). Således er den anti-proliferative effekt af IGF1R knockdown lignede MIR-143/145 overekspression. Endvidere har vi konstrueret en IGF1R overekspression plasmid resistent over for MIR-143/145 (ved eliminering af 3′-UTR). Sammenlignet med celler transficeret med præ-miR-143/145, cellerne transficeret med præ-miR-143/145 og den IGF1R overekspression plasmid udviste signifikant højere opformeringsrater (figur 3D, 3H og 3L), hvilket antyder, at MIR-143/145 resistent IGF1R reddet undertrykkelse af IGF1R af miR-143/145 og svækkede den anti-proliferative effekt af mIR-143/145.

(A, E og i) CCK-8 levedygtighed assays blev udført 12, 24, 48 og 72 timer efter transfektion af Caco2 (a), HT29 (E) og SW480 (i) celler med en kodet kontrol, præ-mIR-143, præ-mIR-145 eller både før mIR-143 og præ -miR-145. (B, F og J) CCK-8 levedygtighed analyser udførtes 12, 24, 48 og 72 timer efter transfektion af Caco2 (B), HT29 (F) og SW480 (J) celler med enten et kodet kontrol siRNA eller IGF1R siRNA. (C, G og K) CCK-8 levedygtighed analyser udførtes 12, 24, 48 og 72 timer efter transfektion af Caco2 (C), HT29 (G) og SW480 (K) celler med enten en kontrol vektor eller en IGF1R overekspression vektor. (D, H og L) CCK-8 levedygtighed analyser udførtes 12, 24, 48 og 72 timer efter transfektion af Caco2 (D), HT29 (H) og SW480 (L) celler med enten en kodet kontrol, præ-miR -143/145 eller både før miR-143/145 og den IGF1R overekspression vektor. * P 0,05; ** P. 0,01

For yderligere at teste den biologiske effekt af IGF1R målrettet miR-143/145 på væksten af ​​kolorektal cancer celler, effekten af ​​miR-143/145 og IGF1R på celle proliferation blev undersøgt med en edu assay et immunokemisk påvisningsmetode, der måler nukleotidanalog inkorporering i nyligt replikeret DNA. I overensstemmelse med resultaterne fra CCK-8 assay procentdelen af ​​edu-positive celler var signifikant lavere i celler transficeret med præ-MIR-143/145 (figur 4A og 4B). Tilsvarende blev signifikant flere edu-positive celler observeret i cellerne med IGF1R overekspression, hvorimod IGF1R-siRNA transficerede celler viste den modsatte virkning på celleproliferation (figur 4C og 4D). Disse resultater igen vist, at nedsat IGF1R niveauer gav samme fænotype observeret af miR-143/145 overekspression. For yderligere at undersøge den funktionelle sammenhæng mellem miR-143/145 og IGF1R blev Caco2 celler samtidigt transficeret med præ- miR-143/145 og den IGF1R overekspression plasmid. Som forventet overekspression af IGF1R dramatisk reddet den undertrykkende effekt af miR-143/145 om celleproliferation (figur 4E og 4F). Taget sammen demonstrerer resultaterne, at MIR-143/145 undertrykke celleproliferation med lyddæmpende IGF1R.

De røde fluorescerende celler er i S-fasen af ​​mitose, og de blå fluorescerende celler repræsenterer alle cellerne. (A og B) The edu proliferationsassay blev udført 48 timer efter transfektion af Caco2-celler med en kodet kontrol, præ-MIR-143, præ-MIR-145 eller både før MIR-143 og præ-MIR-145. A: repræsentativt billede; B: forholdet mellem edu-positive Caco2 celler. (C og D) The edu proliferationsassay blev udført 48 timer efter transfektion af Caco2-celler med en kodet kontrol siRNA, IGF1R siRNA, styrevektor eller IGF1R overekspression vektor. C: repræsentativt billede; D: forholdet mellem edu-positive Caco2 celler. (E og F) The edu proliferationsassay blev udført 48 timer efter transfektion af Caco2-celler med en kodet kontrol plus styrevektor, en kodet kontrol plus IFG1R overekspression vektor, præ-MIR-143/145 plus styrevektor, eller præ-miR -143 /145 plus IFG1R overekspression vektor. E: repræsentativt billede; F: forholdet mellem edu-positive Caco2 celler. * P 0,05; ** P. 0,01

Diskussion

I løbet af de seneste årtier, store fremskridt i vores forståelse af kolorektal cancer biologi har ført til forbedrede diagnostiske og prognostiske teknikker og til udvikling af nye målrettede behandlinger. Effektiviteten af ​​nye behandlinger forbliver begrænset af en kombination af lægemiddelresistens og ved vor begrænsede forståelse af tumor celle signalveje. For nylig er en vigtig rolle for IGF1R i tilblivelsen og progression af colorektal cancer opstået [28] – [30]. Således IGF1R tilbyder en særligt lovende molekylær mål for kolorektal cancer terapi. Men meget lidt er kendt om reguleringen af ​​IGF1R udtryk i kolorektal cancer. Således er de molekylære mekanismer, der ligger IGF1R regulatoriske pathways skal fuldt belyst.

I denne undersøgelse vi forudsagde IGF1R at være et mål for MIR-143 og MIR-145, som er en klynge af miRNA, der har været rapporteret i mange undersøgelser, som skal nedreguleres, og til at fungere som tumor undertrykkere i de fleste kræftformer [21], [22]. Efter måling af ekspressionsniveauerne af MIR-143/145 og IGF1R i human colorectal cancer væv og parret noncancerous væv, vi har registreret en omvendt korrelation mellem MIR-143/145 niveauer og IGF1R proteinniveauer. Endvidere ved overekspression miR-143/145 Caco2-celler, vi eksperimentelt valideret, at MIR-143/145 direkte inhiberede IGF1R oversættelse. Endelig viste vi, at miR-143/145 hæmmet IGF1R udtryk og dermed undertrykte spredning af kolorektal cancer celler

i

vitro

. Resultaterne afgrænse en roman regulerende netværk beskæftiger miR-143/145 og IGF1R at finjustere celleproliferation. Vi gav også tegn på, at restaurering af IGF1R udtryk kan vende miR-143/145-undertrykt celleproliferation. Interessant nok blev det tidligere vist, at MIR-145 kan målrette insulinreceptor substrat-1 (IRS-1) og IGF1R i colon cancerceller [31] – [33]. Men mens en IRS-1 resistent over for miR-145 kan redde kolon kræftceller fra miR-145-induceret væksthæmning, en IGF1R resistent over for miR-145 undlod at redde tyktarmskræft celler fra væksthæmning [33]. Dette er ikke i overensstemmelse med vores resultater. Det forekommer, at hvorvidt MIR-145 kan målrette IGF1R at regulere cellevækst afhænger af cellen og tumortyper. Under forskellige omstændigheder, kan miR-145 udøve forskellige funktioner. Ikke desto mindre er resultaterne af vores og andres understrege, at miR-143/145 kan fungere som tumor-undertrykkende miRNA, og at målretning af IGF1R kan være en mekanisme, hvormed miR-143/145 klynge udøver sin tumor undertrykkende funktion. Derfor kan modulation af IGF1R af MIR-143/145 forklare, hvorfor nedregulering af MIR-143/145 under kolorektal carcinogenese kan fremme udviklingen af ​​kræft.

miRNA, der er placeret i nærheden i genomet (inden for 10 kb) anses for at tilhøre en enkelt klynge. miRNA klynger transskriberet sideordnet som polycistroniske enheder, der behandles til at producere de enkelte miRNA medlemmer, der resulterer i co-ekspression af de miRNA.