PLoS ONE: A Novel funktion CD82 /KAI1 i Sialyl Lewis Antigen-adhæsion af kræftceller: Beviser for en anti-Metastase Effect ved nedregulering af sialyl Lewis antigener

Abstrakt

Vi har for nylig belyst en roman funktion for CD82 i E-cadherin-medieret homocellular friktion; på grund af denne funktion, kan det hæmme kræft celle dissociation fra den primære cancer reden og begrænse metastaser. Men virkningen af ​​CD82 på selectin ligand-medieret heterocellular vedhæftning endnu ikke blevet belyst. I denne undersøgelse har vi fokuseret på virkningerne af metastaser suppressor CD82 /KAI1 om heterocellular vedhæftning af kræftceller til endotel af blodkar med henblik på yderligere at belyse funktionen af ​​tetraspanins. Over-ekspression af CD82 i cancerceller førte til inhibering af eksperimentelt inducerede lungemetastaser i mus og signifikant inhiberede adhæsion af disse celler til humane navlevene epithelceller (HUVEC’er)

in vitro

. Forbehandling af cellerne med funktions-forstyrrende antistoffer mod SLE

a /x hæmmede signifikant vedhæftningen af ​​CD82-negative celler til HUVEC’er. Desuden celler overudtrykker udviste CD82 reduceret ekspression af SLE

a /x sammenlignet med CD82-negative vildtypeceller. Signifikant nedregulering af ST3 β-galactosid α-2, 3-sialyltransferase 4 (ST3GAL4) blev detekteret ved cDNA microarray, real-time PCR og western blotting analyser. Knockdown af

ST3GAL4

på CD82-negative vildtypeceller inhiberede ekspression af SLE

x og reduceret celleadhæsion til HUVEC’er. Vi konkluderede, at CD82 falder SLE

a /x udtryk via nedregulering af

ST3GAL4

udtryk og reducerer derved vedhæftningen af ​​kræftceller til blodkar, hvilket resulterer i hæmning af metastaser.

Henvisning: Yoshihama N, Yamaguchi K, Chigita S, Mine M, Abe M, Ishii K, et al. (2015) A Novel funktion CD82 /KAI1 i Sialyl Lewis Antigen-adhæsion af kræftceller: Beviser for en anti-Metastase Effect ved nedregulering af sialyl Lewis antigener. PLoS ONE 10 (4): e0124743. doi: 10,1371 /journal.pone.0124743

Academic Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Republikken Korea

Modtaget: December 24, 2014 Accepteret: 3 marts 2015; Udgivet: 29 April, 2015

Copyright: © 2015 Yoshihama et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud-in-Støtte til videnskabelig forskning (Kaken nr 23.390.465) fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan (til T. Sugiura). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Metastase er en flertrins fænomen karakteriseret ved migration af tumorceller fra deres primære site, invasion af værten blod eller lymfekar, såning af fjerntliggende organer, og den efterfølgende udvikling af metastatiske tumorer. Ekstravasation af maligne celler involverer interaktionen af ​​P- og E-selectin, som er celleadhæsionsmolekyler findes på overfladen af ​​endothelceller, der beklæder blodkarrene, med de tilsvarende carbohydratligander forekommer på overfladen af ​​maligne celler [1]. Adskillige molekylære arter af kulhydrat ligander til selectiner udtrykkes på cancerceller, herunder sialyl Lewis X (SLE

x) og sialyl Lewis A (SLE

a). Talrige kliniske undersøgelser har rapporteret, at ekspressionen af ​​SLE

x og SLE

a på tumorcellelinier muciner er direkte korreleret med metastase, tumor progression, og dårlig prognose [2,3], og det er kendt, at ekspressionen af Sle

x /a er markant forbedret i solide tumorer. Men den molekylære mekanisme ligger til grund for reguleringen af ​​SLE

x /a i cancerceller er ikke godt forstået.

Tetraspanins eller TM4SF proteiner, omfatter en stor gruppe transmembrane proteiner, der forekommer på celleoverfladen, hvilket kan danner komplekser med membranreceptorer såsom integriner. Nogle tetraspanin-familie proteiner er blevet rapporteret til at spille en særlig vigtig rolle i tumorcellemetastase [4,5]. CD82 /KAI1, et medlem af tetraspanin superfamilien, blev først identificeret som et T-celle tilbehør molekyle [6] og efterfølgende identificeret i en genetisk screening for kræft metastase-gener [7]. I maligne faste tumorer, ekspressionen af ​​CD82 /KAI1 tæt korreleret til en bedre prognose for kræftpatienter, hvorimod dets nedregulering almindeligvis findes i klinisk fremskredne kræftformer. Disse data antyder, at CD82 /KAI1 er en undertrykker af invasion og metastase af forskellige typer af faste tumorer. [8,9]. I overensstemmelse med disse observationer er det ofte blevet observeret, at ekspression af CD82 er omvendt korreleret med den invasive og metastatiske potentiale kræft i bryst, blære, colon, cervix, mave-tarmkanalen, hud, lunge, prostata, bugspytkirtel, lever, og skjoldbruskkirtel [10-13]. CD82 regulerer celleaggregering, cellemotilitet, cancer metastase, og apoptose [14]. Vi har beskrevet at CD82 stabiliserer E-cadherin-β-catenin-komplekser ved at inhibere β-catenin tyrosinphosphorylering. Denne funktion styrker homocellular vedhæftning af kræftceller og forhindrer kræftceller i at undslippe fra primære reder [15]. Omvendt når tumorceller invaderer blodet eller lymfekarrene, er heterofil intercellulær adhæsion mellem tumorceller og endotelceller af fartøjerne kræves som det indledende trin af metastase til fjerne organer. Sialyl Lewis antigener på kræftceller er involveret i adhæsion til selectin på endotelceller af fartøjerne [16]. Men virkningen af ​​CD82 på selectin ligand-medieret celleadhæsion endnu ikke blevet belyst.

Vi her undersøgte virkningerne af metastase suppressor CD82 /KAI1 om processen med heterocellular adhæsion af tumorceller til endotelet af blodkar, for yderligere at belyse funktionen af ​​tetraspanins. Vi først vist, at sialyl Lewis antigensyntese reguleres af en CD82 /KAI1-medieret system og derefter undersøgt virkningerne af denne mekanisme på kræft celle metastase i en mus metastase model.

Materialer og Metoder

antistoffer og reagenser

Mus monoklonale antistoffer (G-2) og kanin-polyklonale antistoffer (C-16) mod KAI1 blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Følgende funktionsbaserede forstyrrende antistoffer blev anvendt: anti SLE

x (mus, monoklonalt) og anti-SLE

en (mus, monoklonale) antistoffer, som blev indhentet fra Santa Cruz Biotechnology og MILLIPORE (Temecula, Californien, USA) henholdsvis, samt et monoklonalt muse-antistof mod β1 integrin, som blev opnået fra Sigma (St. Louis, MO, USA).

Cellekultur

Den humane cellelinie H1299 (en ikke-småcellet carcinom cellelinje) og dens transfektant-cellelinjer, H1299 /zeo og H1299 /CD82, blev etableret i vores laboratorium ved hjælp af transfektion af en kontrol vektor eller CD82 cDNA henholdsvis og en celle sortering baseret klonselektion teknik, som tidligere beskrevet [14]. Cellerne blev dyrket ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO

2 i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Sigma) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; ICN Biomedicals, Aurora, OH, USA) og 2 mM L-glutamin.

De to cellelinier anvendt i denne undersøgelse, H1299 /zeo og H1299 /CD82, er blevet tidligere [10] beskrevne. H1299 /Zeo er en mock transficeret cellelinie, som udviser svag CD82-ekspression, hvorimod H1299 /CD82-celler over-express CD82 følgende cDNA transfektion. Immunoblotting-analyse viste, at niveauet af CD82-proteinet i H1299 /CD82-celler var 20 gange højere end i vildtype eller H1299 /Zeo celler, hvorimod flowcytometri afslørede, at cellen overfladeniveau CD82 i H1299 /CD82-celler var ca. 9- gange den for vildtype eller H1299 /Zeo celler.

Dyr og metastase assay

Otte uger gammel kvinde athymiske nøgne mus (Balbc- cAJcl-nu) blev indkøbt fra Kyudo (Fukuoka , Japan). Musene blev opstaldet i laminare flow kabinetter under specifikke patogenfrie betingelser og fodret autoklaveret vand og kost i anlæg, der er godkendt af Kyushu University. Hver skab indeholdt 1-4 mus for eksperimentel gruppering. De dyr eksperimentelle protokoller blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg Kyushu University (Permit Nummer: A23-13-1).

For de eksperimentelle lunge metastase undersøgelser, 1,0 x 10

6 celler eller køretøj (PBS) kun blev injiceret via halevenen. Mus blev tilfældigt opdelt i følgende 4 grupper: (A) ingen behandling (kontrol: injiceret med PBS kun), (B) H1299, (C) H1299 /Zeo, og (D) H1299 /CD82. Hver gruppe indeholdt mindst 3 mus (i alt 20 mus blev anvendt). Otte uger efter injektion blev musene aflivet ved administration af pentobarbiturate (100-120 mg /kg) for at minimere lidelser og lungerne blev høstet. Lung metastatiske foci blev talt om de kunne ses med det blotte øje som tidligere beskrevet [15].

Immunblotanalyse

Cellelysater til immunoblotting blev fremstillet i cellelyse-buffer (1% Triton X -100, 2 mM natriumorthovanadat, 500 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 10 ug /ml leupeptin, 10 ug /ml aprotinin, 1 mM PMSF, 50 mM Tris-HCl pH 7,2). Cellelysaterne blev opløst ved SDS-PAGE, overført til en nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og inkuberet med specifikke primære antistoffer. Proteinbånd blev visualiseret under anvendelse peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer og forøget kemiluminescens-reagens (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Båndene blev scannet af computer-assisteret densitometri (ChemiDoc XRS-J; Bio-Rad) og analyseret ved hjælp Mængde One-software (Bio-Rad), som tidligere beskrevet [14, 15]

Fluorescent mærkning af levende celler. og celleadhæsionsassayet

Levende H1299 celler blev mærket ved hjælp Vybrant DiO og gjorde celle-mærkning løsninger (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

for at kvantificere tumorceller adhæsion til humane navlevene epithelceller (HUVEC’er) blev en standard statisk vedhæftning assay udført som tidligere beskrevet [17]. HUVEC’er (1,5 × 10

4 celler) blev anbragt i 96-brønds mikrotiterplader for-coatet med 0,1% gelatine (Sigma) og dyrket i lav-glucose DMEM med 20% FBS og 0,1 ug /ml basisk FGF i 2 -3 dage for at etablere sammenflydende HUVEC monolag. Fluorescensmærket H1299 celler (4,0 x 10

4 celler /brønd) blev tilsat til endotel monolag og fik lov til at klæbe ved 37 ° C i 30 minutter.

For at undersøge virkningerne af funktions-forstyrrende antistoffer på adhæsion af cancerceller til HUVEC monolag, H1299-celler blev forbehandlet med 5 ug /ml funktions–forstyrrende antistoffer ved 37 ° C i 30 min, og blev derefter anvendt på HUVEC monolaget.

brøndene blev vasket 3 gange med phosphatbufret saltvand (PBS) og celler fikseret med methanol i 15 minutter ved stuetemperatur. De adhærente celler blev kvantificeret under et lysmikroskop med en høj effekt felt (× 200). For hver af de tredobbelte eksperimenter blev antallet af celler i 5 vilkårligt valgte områder bestemmes og tællingerne blev beregnet.

Transfektion af korte hårnål RNA (sh RNA)

Cultured H1299 /CD82 og H1299 /Zeo-celler blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Den H1299 /CD82-sh. kontrol- og H1299 /CD82-sh.CD82 cellelinier blev dannet ved transfektion af H1299 /CD82-celler med pLKO.1-puro kontrolvektor (Sigma) og pLKO.1-puro /sh.CD82: NM_002231 (Sigma), henholdsvis [ ,,,0],18]. Den H1299 /Zeo-sh.control og H1299 /zeo-sh.ST3GAL4 cellelinier blev dannet ved Lipofectamin-medieret transfektion af H1299 /Zeo celler med pLKO.1-puro kontrolvektor og pLKO.1-puro sh.ST3GAL4: NM_06081105 (Sigma), hhv. Kolonier, der udviser resistens over for puromycin (Sigma) fra de enkelte transfektionsforsøg blev samlet. Ekspressionsniveauet af CD82 og ST3GAL4 i shRNA transficerede H1299-celler blev overvåget ved RT-PCR og immunblotting. Disse celler blev opretholdt i DMEM indeholdende 10% FBS og 2 ug /ml puromycin.

mikromatrice

Totalt RNA blev ekstraheret fra H1299 /zeo og H1299 /CD82-celler under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Mikromatrice hybridisering og scanning blev udført ved Affymetrix (Santa Clara, CA, USA) ved anvendelse af Affymetrix genet chip HG-U133A plus2.0. GCRMA i BioConductor (https://www.bioconductor.org) blev anvendt til sonde analyse og normalisering af microarray data.

Statistisk analyse (Students

t

-test) og en fold ændringer filter ( 3,0) (H1299 /CD82 vs. H1299 /zeo) blev udført sekventielt at vælge de betydelige gener. Brug af funktionen gen definition blev alle transferaser der regulerer sialyl Lewis antigener identificeret og er opført i tabel 1 og 2.

Real-time revers transkriptase (RT) -polymerase (PCR )

Totalt RNA blev ekstraheret fra H1299 celler under anvendelse af TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og anvendt til første streng cDNA-syntese. MRNA-niveauer blev kvantificeret i tre eksemplarer ved anvendelse af en real-time PCR-system med Brilliant SYBR Green qPCR Kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) som tidligere beskrevet [18]. De specifikke primere til glycosyltransferase var som følger: (

ST3GAL1

: 5′-GCATAACGCCCATATAGAT-3 ‘og 5′-AAGGCTCTGACTGCTCTGT-3’;

ST3GAL2

: 5′-CTGGATGCTGGGACCTAC-3 ‘og 5’-GCTACTTGGAAGGCTGAGG-3 ‘;

ST3GAL3

: 5′-TCCTGGACGCACAATATC-3′ og 5′-GGTCTGAAGACTCCTGTGTA-3 ‘;

ST3GAL4

: 5′-AGTAGAAAACAACCCAGACAC-3′ og 5 ‘ -AGAGGTTGAGAATCCGAA-3 ‘; og

ST3GAL5

: 5′-TGCCTCAGTTCACCCTCA-3′ og 5′-TGGTGGTGTTTGTGTGCTG-3 ‘

PCR cyklusbetingelser var 10 minutter ved 95 ° C i 1. cyklus efterfulgt af 45 cykler hver på 95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 60 s. amplikoner bekræftes, at signalerne er unikke ved dissociation kurve analyser. Ekspressionsniveauer for hver prøve, opnået fra parallel assays, blev normaliseret til de af genet, der koder glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (

GAPDH

) og blev analyseret ved anvendelse af LightCycler2.0 System softwarepakke (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA).

Resultater Salg

Ektopisk ekspression af CD82 inhiberer lunge metastase i mus Salg

i det første forsøg, vi bekræftede metastase-inhiberende virkning af CD82, som tidligere er rapporteret ved anvendelse af et dyr metastase-model [17]. For lungemetastasen undersøgelser injicerede vi H1299 celler i halevenen af ​​8 uger gamle hun athymiske nøgne mus. Otte uger efter injektion blev alle metastatiske foci observeret og optalt visuelt. CD82 viste en kraftig inhiberende virkning på størrelsen og antallet af lunge metastase foci (figur 1). Specifikt mus transficeret med H1299 /Zeo-celler viste 100% lunge metastase (7/7), hvorimod de CD82-transfektanter, H1299 /CD82, udviste en signifikant inhibering af metastase, med en metastase på kun 28,5% (2/7). Eftersom lungemetastasen sats direkte afspejler omfanget af cellulær adhæsion til lungerne blodkar, dette resultat antydede, at CD82 spiller en vigtig rolle i cellulær adhæsion til blodkar.

halevener nøgne mus blev injiceret med 1,0 x 10

6 H1299 /zeo eller H1299 /CD82-celler. Otte uger efter injektion blev musene aflivet, og lungerne udvundet. Metastatiske foci blev talt på øjemål. Injektionen af ​​H1299 /Zeo celler resulterede i 100% lunge metastase (7/7), mens H1299 /CD82 celler viste en signifikant lavere metastaser (28,5%; 2/7).

uden for livmoderen ekspression af CD82 inhiberer tumor celleadhæsion til HUVEC’er via sialyl Lewis antigener

adhæsionen af ​​cancerceller til blodkar involverer interaktionen af ​​P- og E-selectin på epitelcellerne i blodkar med det tilsvarende SLE

x og SLE

et kulhydrat ligander på overfladen af ​​kræftceller [12]. Vi analyserede virkningen af ​​CD82 på celleadhæsion til blodkar under anvendelse af en tidligere beskrevet celleadhæsionsassay i HUVEC’er [11]. Det blev tidligere bekræftet, at HUVEC’er udtrykker både P- og E-selectin [11]. Vi observerede, at ca. 65% af de fyldte H1299 /Zeo celler adhæreret til HUVEC monolaget. Omvendt viste H1299 /CD82-celler signifikant mindre celleadhæsion, idet kun 6,6% tilslutning til HUVEC monolaget (figur 2A og 2B). Forbehandling med funktions-forstyrrende antistoffer mod SLE

x, SLE

a, eller Ø1 integriner hæmmede H1299 /Zeo vedhæftning til HUVEC’er med 9,4%, 8,4% og 30,2%, henholdsvis (figur 2C). I modsætning hertil funktion-forstyrrende antistoffer mod SLE

x /a viste ingen signifikant hæmning af H1299 /CD82 celleadhæsion til HUVEC’er. Disse resultater foreslog stærkt en hæmmende rolle for CD82 i sialyl Lewis-medieret celleadhæsion.

Fluorescerende mærket H1299 /zeo eller H1299 /CD82-celler (4,0 × 10

4 celler /brønd) blev anvendt til en HUVEC monolagskultur og fik lov til at klæbe ved 37 ° C. Klæbede celler blev kvantificeret efter 30 min. Klæbet H1299 /Zeo (A) og H1299 /CD82 (B) celler og effekten af ​​funktionsrelaterede forstyrrende antistoffer på celleadhæsion til HUVEC monolag blev analyseret (C). H1299-celler blev forbehandlet med 5 pg /ml af de angivne antistoffer og derefter anvendt på HUVEC monolaget. Eksperimenter blev udført tre gange, og antallet af adhærerede celler blev gennemsnit. Barer angiver standardafvigelsen.

Ektopisk udtryk for CD82 reducerer sialyl Lewis syntese

udtryk for sialyl Lewis-antigener på H1299 celler blev analyseret ved immunoblotting (Fig 3). SLE

a blev påvist som bånd svarende til ca. 97, 125 og 200 kDa, og dets ekspression niveau var 5-8 gange højere i H1299 /Zeo celler end i H1299 /CD82-celler (Fig 3A). Tilsvarende blev udtrykket af SLE

x proteiner detekteret ved ca. 90, 125, og 200 kDa, og var 5-8 gange højere i H1299 /Zeo celler end i H1299 /CD82-celler (Fig 3B). Disse fund var i overensstemmelse med resultaterne af HUVEC adhæsionsassayet Salg

Helcellelysater (200 ug) af H1299 celler (H1299 /Zeo, zeo;. H1299 /CD82, CD82, H1299 /CD82-sh.control , sh.cont; H1299 /CD82-sh.CD82, sh.CD82) blev opløst ved 7,5% SDS-PAGE og analyseret ved immunoblotting med anti-SLE

a (a) eller anti-SLE

x (B ) antistoffer. De samme blots blev strippet og re-probet for β-actin som et loading kontrol. Forsøgene blev gentaget i tre eksemplarer, og de mest repræsentative data vises.

Desuden har vi transficeret H1299 /CD82 celler med CD82 shRNA at bekræfte, om denne nedregulering af sialyl Lewis antigener er en direkte effekt af den ektopiske ekspression af CD82.

CD82

shRNA helt hæmmet CD82-ekspression (fig 3C) og samtidig produktion af SLE

a og SLE

x genvundet til udtrykket niveauet i H1299 /Zeo celler.

Ektopisk udtryk for CD82 reducerer mRNA niveauer af glycosyltransferase gener relateret til sialyl Lewis syntese

for at undersøge de mekanismer for nedregulering af sialyl Lewis antigener ved CD82, vi udførte en global mikromatrice analyse af den mulige regulatorer af sialyl Lewis antigener (alle transferaser). Som vist i tabel 1, CD82 markant nedreguleret (0,05-gange ændring) ekspressionen af ​​

ST3GAL4

(understreget i tabel 1). I modsætning hertil blev ekspressionen af ​​gener, der koder andre grupper af glycosyltransferaser og sukker transporter grupper ikke markant ændret.

Vi næste undersøgt virkningerne af CD82 på mRNA og protein niveauer af ST3GALs bruger real time PCR (Fig 4) og immunoblotting (figur 5), henholdsvis. Den ektopiske udtryk for CD82 havde ingen effekt på ekspressionen af ​​ST3GALs, bortset fra et markant fald i de

ST3GAL4

mRNA og protein niveauer.

Total RNA blev isoleret fra H1299 celler og analyseret af real -Time RT-PCR. mRNA-niveauer af glycosyltransferase gener

(ST3GALs)

blev korrigeret i forhold til niveauerne af

GAPDH

mRNA, med H1299 /zeo sat til 1. Data er vist som middelværdien ± SEM.

Hele cellelysater (300 mg) af H1299 celler (H1299 /Zeo, zeo, H1299 /CD82, CD82, H1299 /CD82-sh.control, sh.cont; H1299 /CD82-sh.CD82 , sh.CD82) blev opløst ved 10% SDS-PAGE og analyseret ved immunoblotting med anti-ST3Gal primære antistoffer. De samme blots blev strippet og re-probet for β-actin og CD82. Forsøgene blev gentaget i tre eksemplarer, og de mest repræsentative data vises.

Vi har også vurderet, om reduktionen af ​​

ST3GAL4

i H1299 /CD82-celler var en CD82-specifik begivenhed ved hjælp af CD82 knockdown. Efter knockdown af CD82, protein niveau ST3GAL4 helt genvundet til niveauet observeret i H1299 /Zeo celler.

ST3GAL4

shRNA reducerer sLex produktion

For at undersøge, om down- regulering af ST3GAL4 reducerer produktionen af ​​sLex, vi bankede ned

ST3GAL4

ved stabil transfektion af

ST3GAL4

shRNA. Udtrykket af

ST3GAL4

specifikt reduceret med shRNA både mRNA og protein niveauer (Fig 6A og 6B). Proteinet niveau af SLE

x blev reduceret betydeligt i H1299 /Zeo shST3GAL4 celler (0,3-fold af H1299 /zeo sh.cont). I modsætning hertil proteinniveauet af SLE

a viste ingen signifikant forskel mellem H1299 /Zeo-sh.cont celler og H1299 /zeo-sh.ST3GAL4 celler. Konstateringen af, at ST3GAL4 konkret forringer SLE

x protein produktionen foreslog, at SLE

x produktion blev nedreguleret af CD82-ekspression via

ST3GAL4

nedregulering (fig 7A og 7B).

A. Totalt RNA blev isoleret fra H1299-celler og analyseres ved real-time RT-PCR. mRNA-niveauer af

ST3GALs

blev korrigeret i forhold til niveauerne af β-actin mRNA, med dem af H1299 /zeo fastsat til 1. Data er vist som middelværdi ± SEM. B. Helcellelysater (300 mg) af H1299 celler (H1299 /Zeo, zeo, H1299 /CD82, CD82, H1299 /Zeo-sh.ST3GAL4, sh.ST3GAL4; H1299 /Zeo-sh.control, sh.cont) var opløst ved 10% SDS-PAGE og analyseret ved immunoblotting med anti-ST3GAL4 primære antistoffer. De samme blots blev strippet og re-probet for β-actin. Forsøgene blev gentaget i tre eksemplarer, og de mest repræsentative data er vist

(A) Helcellelysater (300 mg) af H1299 celler (H1299 /Zeo, zeo,. H1299 /CD82, CD82; H1299 /zeo-sh.ST3GAL4, sh.ST3GAL4; H1299 /Zeo-sh.control, sh.cont) blev løst ved 10% SDS-PAGE og analyseret ved immunoblotting med anti-SLE

a eller anti-SLE

x antistoffer. De samme blots blev strippet og re-probet for β-actin som et loading kontrol. Forsøg blev gentaget 3 gange, og de mest repræsentative data er vist. (B) Densitometrisk analyse blev udført på (A), efterfulgt af normalisering til densitometrisk værdien af ​​β-actin og angivet som “Relativ ekspression værdi (β-catenin /β-actin)”. Relative ekspression værdier fra 3 individuelle eksperimenter blev midlet. Barer angiver standardafvigelsen.

ST3GAL4

shRNA hæmmer celleadhæsion til HUVEC’er

Endelig har vi undersøgt effekten af ​​shRNA-medieret nedregulering af

ST3GAL4

på celle adhæsion til HUVEC’er. Den celleadhæsion til HUVEC’er viste ca. 50% inhibering af vildtype-H1299 /Zeo celler efter

ST3GAL4

knockdown. Men hæmning niveau af H1299 /Zeo shST3GAL4 celler ikke nå den, H1299 /CD82 (90% hæmning af H1299 /zeo, fig 8).

Fluorescerende mærket H1299 /Zeo, H1299 /CD82, H1299 /zeotype-sh.ST3GAL4 og H1299 /Zeo-sh.control celler (4,0 x 10

4 celler /brønd) blev påført en HUVEC monolagskultur og fik lov til at klæbe ved 37 ° C. Klæbede celler blev kvantificeret efter 30 min. H1299 celler adhæreret til HUVEC monolag blev analyseret. Eksperimenter blev udført tre gange, og antallet af adhærerede celler blev gennemsnit. Barer angiver standardafvigelsen.

Diskussion

CD82 /KAI1 er blevet rapporteret at have anti-metastatiske egenskaber og har tidligere bekræftet at være en suppressor af metastaser. Vi har tidligere demonstreret en hidtil ukendt funktion af CD82 i E-cadherin-medieret homofil intercellulær adhæsion [15]. I denne undersøgelse har vi undersøgt virkningerne af CD82 på heterofil cellulær adhæsion til blod eller lymfekar, hvilket er det indledende trin af metastase til fjerne organer; og demonstrerede romanen regulerende rolle CD82 i sialyl Lewis-afhængig cellulær vedhæftning. I vores

in vivo

metastase assay viste CD82 en kraftig inhiberende virkning på størrelsen og antallet af lunge metastase foci (figur 1) efter den direkte injektion af cancerceller i musen halevene. Således er vores resultater antyder kraftigt en inhiberende rolle for CD82 i adhæsionen af ​​cancerceller til vaskulære endotelceller. Salg

Sialyl Lewis antigener involveret i den indledende trin af cancer celleadhæsion til blodkar [16]. Talrige kliniske undersøgelser har rapporteret, at ekspressionen af ​​SLE

x og SLE

a på tumorcellelinier muciner korrelerer direkte med metastase, tumor progression, og dårlig prognose [2,3]. Når den første adhæsion via sialyl Lewis-antigener er etableret, integrin-medieret adhæsion ensues [19]. Vi viste, at tilsætning af et anti-integrin-antistof kun delvist inhiberede adhæsionen af ​​cancerceller til HUVEC’er, hvilket antyder, at den oprindelige sialyl Lewis antigen-medieret adhæsion er væsentlig for kræft celleadhæsion til blodkar (figur 2). Den ektopiske ekspression af CD82 nedregulerede syntesen af ​​SLE

a /x (Fig 3), støtter resultaterne af HUVEC adhæsionsanalysen.

biosyntesevejen af ​​SLE

a og SLE

x afhænger af en række enzymer, som katalyserer overførslen af ​​sialinsyre og fucose til oligosaccharid sidekæder af glycokonjugater. Kort fortalt

N

-acetyllactosamine (GlcNac) β1 oligosaccharid syntetiseres af GlcNAc transferaser. Baseret på GlcNAc β1 oligosaccharid substrater, β1, 3-galactosyltransferases (β3Gal-Ts) syntetisere a1 → 3 disaccharider (type 1-kæder) og β1, 4-galactosyltransferases (β4Gal-T) syntetisere a1 → 4 disaccharider (type 2 kæder). Sialyltransferase (ST), der tilhører

ST3Gal

familie indeholder 6 underfamilier af enzymer. Blandt disse, til ST3Gal3 sialylates type 1 kæder producere SLE

a, mens ST3Gal4 og -6 er forpligtet til at sialylere type 2 kæder for SLE

x produktion.

Sekventiel tilsætning af α1, 4-forbundne fucose til type 1 kæder og α1, 3-bundet fucose til type 2 kæder af fucosyltransferase (FUTs) afslutter biosyntesen af ​​SLE

a og SLE

x, hhv. Ekspressionen af ​​SLE

a og SLE

x er forbundet med carcinogenese og tumorprogression. Ekspressionen af ​​

ST

FUT

gener, som koder for enzymerne, der er nødvendige for biosyntesen af ​​disse antigener er også korreleret med disse maligne tegn. Øget mRNA niveauer af

ST

FUT

findes i flere typer af maligne tumorer.

ST3GAL3

udtryk i patienter med brystkræft var stærkt associeret med dårlig prognose og reduceret samlet overlevelse [20]. Tilsvarende forøget ekspression af

ST3GAL4

FUT4

blev rapporteret i kolorektale karcinomer [21]. Omvendt er den nedregulering af

ST3GAL4

er blevet observeret i kolorektal cancer væv og menneskelige renalcellecarcinom [22,23]. I mavekræft, ekspressionsniveauerne af

ST3GAL3

FUT4

mRNA var signifikant forøget i carcinom væv [24]. Endvidere ekspressionen af ​​

FUT4

FUT7

mRNA var relateret til dårlig prognose hos patienter med lungecancer [25], og den øgede aktivitet af a1,3 /4-FUTs blev observeret i æggestokkene carcinoma i forhold til sundt væv [26] Chandrasekaran et al., 1992 EV Chandrasekaran, R.K. Jain og K.L. Matta, Ovariecancer alpha 1,3-L-fucosyltransferase. Differentiering af distinkte katalytiske arter med den unikke substrat, 3′-sulfo-N-acetyllactosamin sammen med andre syntetiske acceptorer,

J Biol Chem

267 (1992), pp. 23.806-23.814. Se Record i Scopus Citeret af i Scopus (26). Disse rapporter tyder på, at rollerne som

ST

FUT

forskellige i forskellige cancertyper

in vivo

.

I vores model, CD82 ned-signifikant reguleret (0,05-gange ændring) udtryk for

ST3GAL4

. I modsætning hertil blev ekspressionen af ​​andre grupper af glycosyltransferaser og sukker transporter grupper ikke markant ændret. Knockdown af

CD82

mRNA ved shRNA i H1299 /CD82-celler resulterede i inddrivelse af

ST3GAL4

udtryk og syntesen af ​​SLE

a /x, hvilket tyder på, at CD82 har særlige virkninger for

ST3GAL4

udtryk.

Som nævnt ovenfor,

ST3GAL4

normalt syntetiserer kun SLE

x og vores

ST3GAL4

knockdown undersøgelse viste resultater indikerer en specifik ned -forordning på SLE

xi H1299 /Zeo shST3GAL4 celler. I modsætning hertil ektopisk ekspression af CD82 reducerede syntesen af ​​SLE

a og SLE

x, samtidigt. Denne type uoverensstemmelse er tidligere blevet rapporteret. Den enzymatiske aktivitet af ST3GAL4 rekombinant protein var effektiv for både type 1 og type 2 disaccharider

in vitro

, mens

in vivo

, var det eneste effektive for type 2 substrater [27] Sasaki et al ., 1993 K. Sasaki, E. Watanabe, K. Kawashima, S. Sekine, T. Dohi og M. Oshima

et al

., Expression kloning af en roman Gal beta (1-3 /1- 4) GlcNAc alpha 2,3-sialyltransferase under anvendelse lectin resistens udvælgelse,

J Biol Chem

268 (1993), pp. 22.782-22.787. Se Record i Scopus