PLoS ONE: terapeutiske virkning af menneskelige iPS-celleafledt myeloide celler udtrykker IFN-β mod peritonealt dissemineret kræft i xenograftmodeller

Abstrakt

Vi har for nylig udviklet en metode til at generere myeloide celler med spredning kapacitet fra humane iPS celler. iPS-ML (IPS-celle-afledt myeloid /makrofag linje), der genereres ved at indføre spredning og anti-senescens faktorer iPS-celle-afledte myeloide celler, voksede kontinuerligt i en M-CSF-afhængig måde. Et stort antal celler, der udviser makrofaglignende egenskaber kan let opnås ved anvendelse af denne teknologi. I den aktuelle undersøgelse, vi vurderet den mulige anvendelse af iPS-ML anti-cancer terapi. Vi har etableret en model af peritonealt formidles gastrisk kræft ved intraperitonealt at injicere NUGC-4 humane gastriske kræftceller i SCID-mus. Når iPS-ML blev injiceret intraperitonealt i musene med på forhånd fastsatte peritoneale NUGC-4 tumorer, iPS-ML massivt akkumuleret og infiltreret ind i tumorvæv. iPS-ML udtrykker IFN-β (IPS-ML /IFN-β) inhiberede signifikant intraperitoneal vækst af NUGC-4 cancer. Endvidere iPS-ML /IFN-β hæmmede også væksten af ​​humane pancreascancer MiaPaCa-2 i en lignende model. iPS-ML er derfor en lovende behandling agent for peritonealt formidles kræftformer, hvor der ingen standard behandling er i øjeblikket tilgængelig

Henvisning:. Koba C, Haruta M, Matsunaga Y, Matsumura K, Haga E, Sasaki Y, et al. (2013) terapeutiske effekt af human iPS-celleafledt myeloide celler udtrykker IFN-β mod peritonealt dissemineret kræft i xenograftmodeller. PLoS ONE 8 (6): e67567. doi: 10,1371 /journal.pone.0067567

Redaktør: Joseph Najbauer, University of Pécs Medical School, Ungarn

Modtaget: September 30, 2012; Accepteret: 21. maj 2013; Udgivet: 24 juni 2013

Copyright: © 2013 Koba et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af Grants-i-Aid nr. 23650609 og 24300334 til YN og 23659158 til S.S. fra MEXT, Japan; et tilskud til Y. N. fra Prinsesse Takamatsu Cancer Research Fund; Forskning Grant til S. S. for Vanskelige sygdomme fra Ministeriet for Sundhed og Velfærd, Japan; og et tilskud til S. S. fra Japan Science and Technology Agency (JST). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Makrofager spiller væsentlige roller for at opretholde homeostase i kroppen. De bor i alle væv i kroppen og er engageret i forskellige funktioner, såsom at fjerne invaderende patogener, remodeling væv, og rydde døde celler. Derudover er makrofaginfiltration hyppigt observeret i forskellige kræftformer [1]. Nylige undersøgelser indikerer, at disse tumorassocierede makrofager (TAM) hovedsagelig fremmer progression af cancer ved at fremskynde lokal invasion og metastase af cancere [2]. I modsætning hertil er andre undersøgelser viser tumoricidal virkning af makrofager [3], [4]. Baseret på de anti-cancer effekter af makrofager observeret i prækliniske studier, har anvendelse af makrofager til kræftbehandling blevet forsøgt; for eksempel overførsel af makrofager præaktiveret med IFN-γ blev afprøvet som en potentiel behandling agent for kræftpatienter [5] – [9]. Imidlertid er der observeret nogen klar terapeutisk fordel mod kræft hidtil i makrofag terapi.

At etablere makrofag terapi som en mere effektiv anti-cancer terapi, forbedring af metoden for at levere makrofager er nødvendig. I de rapporterede kliniske forsøg blev makrofager, der anvendes til terapeutiske formål genereret fra donor perifere blodmonocytter, der blev isoleret ved leukaferese. Imidlertid perifere blodmonocytter isoleres fra ikke let formeres. Antallet af makrofager genereret af sådanne metoder er derfor begrænset (højst 10

9 til 10

10), og kan være utilstrækkelige til at opnå klinisk effekt. Hvis et tilstrækkeligt antal (fx mere end 10

10) af makrofager med det potente anti-cancer ejendom kan administreres gentagne gange, kunne vi indse effektiv anti-cancer behandling med makrofager.

pluripotente stamceller, såsom embryoniske stamceller (ES) celler eller induceret pluripotente stamceller (iPS) celler, kan udbrede det uendelige og besidder evnen til at differentiere til forskellige typer af somatiske celler, herunder blodlegemer. Ødelæggelse af et menneskeligt embryon er nødvendig for at generere humane ES-celler. iPS celler, på den anden side, kan genereres ved at indføre flere definerede faktorer i somatiske celler afledt fra enhver donor [10] – [13]. Således kan iPS celle teknologi overvinde etiske spørgsmål samt histoincompatibility spørgsmål mellem de terapeutiske donor celler og modtageren, og den fremtidige anvendelse af iPS celler til klinisk medicin forventes [14], [15].

Flere grupper, herunder vores, har hidtil etablerede metoder til at generere makrofager fra mus eller humane pluripotente stamceller [16] – [24]. Men menneskelige pluripotente stemα celler giver lavere antal makrofager end mus pluripotente stamceller. Hidtil etablerede metoder genererer menneskelige makrofag tal, der er mindre end 100 gange antallet af de udifferentierede iPS celler, der anvendes som udgangsmaterialer; Desuden genererer makrofager ved traditionelle fremgangsmåder kræver mere end en måned. Således konventionelle fremgangsmåder er for omstændelig og dyr, der skal anvendes til praktisk medicin.

For nylig har vi etableret en metode til at inducere proliferation af IPS-celle-afledte myeloide celler (IPS-MC) ved lentivirus-medieret transduktion af gener, der kan fremme celleproliferation eller inhiberer celleældning, såsom cMYC plus BMI1, EZH2 eller MDM2, for at generere et IPS-celle-afledt myeloid /makrofag-cellelinie (IPS-mL) [25]. iPS-ML kan proliferere i en M-CSF-afhængig måde i mindst flere måneder samtidig bevare potentialet til at differentiere til dendritiske celler (IPS-ML-DC) med en potent T-celle-stimulerende kapacitet.

den aktuelle undersøgelse, vi vurderet potentialet i at bruge iPS-ML som anti-cancer effektorceller. Vi undersøgte, om genetisk modificerede iPS-ML udtrykker anti-HER2-antistof eller interferon (IFN) kunne udøve terapeutisk virkning mod peritonealt formidles gastriske og pancreascancer i xenograftmodeller.

Materialer og metoder

Celler og reagenser

Denne undersøgelse blev godkendt af etisk gennemgang bestyrelse Kumamoto University Graduate School of Medical Sciences. Et menneske gastrisk cancer cellelinje, NUGC-4, og et menneske bugspytkirtelkræft cellelinje, MiaPaCa-2, blev leveret af den japanske Indsamling af Research Bioressourcer (JCRB, Osaka, Japan). Metoder til generation, vedligeholdelse og genetisk modificering af humane iPS celler er blevet beskrevet tidligere [21].

Flowcytometrisk analyse

Følgende mAbs konjugeret med FITC eller PE blev indkøbt fra BD Pharmingen (San Diego, CA), Beckman Coulter (Brea, CA), Miltenyi Biotec (Bergish-Gladbach, Tyskland), Sigma (St. Louis, MO), eller eBioscience (San Diego, CA): anti-CD45 (klon HI30, muse IgG1), anti-CD33 (WM53, muse lgG1), anti-CD36 (FA6.152, muse lgG1), anti-CD11b (ICRF44, muse lgG1), anti-CD14 (61D3, muse lgG1), anti-CD4 ( 11830, mus IgG2a), anti-CD97 (VIM3b, mus IgG1), anti-CD13 (WM15, mus IgG1), anti-CD87 (62022, mus IgG1), anti-CD115 (2-3A3-1B10, rotte IgG2a), anti-CD116 (4H1, muse lgG1), anti-TLR2 (T2.5, muse lgG1), anti-TLR4 (HTA125, muse IgG2a), anti-HER2 /neu (Neu 24,7, muse lgG1), og anti-cMYC ( 9E10, muse lgG1). Isotype-matchede kontroller, muse-IgG2a (G155-178) og muse IgG1 (MOPC-21), blev anvendt. Celleprøverne blev behandlet med FcR-blokerende reagens (Miltenyi Biotec) i 10 minutter, farvet med de fluorokromkonjugerede mAb’er i 30 minutter, og vasket 3 gange med PBS /FCS (2%). Farvede celleprøver blev analyseret under anvendelse af en FACScan (Becton Dickinson) flowcytometer.

Zymosan fagocytose assay

Cellesuspensioner i DMEM /10% FCS blev tilsat til 48-brønds dyrkningsplader (2 × 10

5 celler /brønd i 200 pi) og inkuberet ved 37 ° C i 2 timer for at tillade cellerne at adhærere til pladerne. FITC-mærkede zymosan A partikler (Molecular Probes) blev tilsat til brøndene (2 × 10

6 partikler /brønd i 200 pi). Efter inkubation i den angivne periode blev celler mikroskopisk observeret (Axio Observer Z1, Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland) og høstet ved trypsin /EDTA-behandling for flowcytometrisk analyse ved anvendelse af et FACScan flowcytometer.

Konstruktion af ekspressionsvektorer

et plasmid klon indeholdende cDNA for en enkelt kæde variabel region fragment (scFv) specifik mod human HER2 /neu var en gave fra Lieberman (Addgene plasmid # 10794) [26]. ScFv-sekvensen er oprettet af PCR til nukleotid sekvenser for en cMYC tag (EQKLISEEDL) og et C-terminalt fragment af muse FcyRI. Protein-kodende DNA-fragment blev først klonet ind i pENTR-D-Topo (Life Technologies) og efterfølgende overført til en pattedyrekspressionsvektor pCAG-IRES-Puro, som drives af CAG-promotoren og indeholder et internt ribosomalt indgangssted (IRES) -puromycin

N

acetyl-transferase genet kassette. cDNA’er til human IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, TRAIL, og FAS-ligand blev leveret af NITE Biological Resource Center (Kazusa, Japan), Kazusa DNA Research Center (Kazusa, Japan), eller RIKEN BRC (Tsukuba, Japan). En lentivirus vektor, CSII-EF, og emballage konstruktioner blev genereret af H. Miyoshi (Riken BRC) og kolleger [27]. CDNA-fragmenterne blev indsat i CSII-EF-plasmid sammen med IRES-hygromycinphosphotransferase at generere lentivirale ekspressionskonstruktioner. Rekombinant lentivirus blev fremstillet og oprenset ved en tidligere beskrevet metode [21].

Generation of iPS-ML udtrykker scFv

En plasmidvektor (pCAG-IRES-Puro), der koder anti-HER2 scFv var indføres i humane iPS-celler ved elektroporering og selekteret under anvendelse af puromycin (5 ug /ml). Stabilt transficerede kloner blev isoleret ved en tidligere beskrevet metode [21]. Efterfølgende blev iPS celle kloner, der bærer anti-HER2 scFv-konstruktionen placeres i differentiering kultur at generere iPS-MC /anti-HER2. IPS-MC udtrykker scFv specifikke for HER2 blev transduceret med lentivirus vektorer for cMYC plus BMI1 eller cMYC plus EZH2, at generere iPS-ML. Metoden til skabe og opretholde iPS-ML er tidligere blevet rapporteret [25].

Genetisk modifikation af iPS-ML /scFv at udtrykke yderligere faktorer

iPS-ML blev transduceret med lentivirus vektor kodning IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, FAS-ligand, eller TRAIL. At vælge celler der stabilt udtrykker transgenerne, blev cellerne dyrket i et medium indeholdende hygromycin (0.5~2 mg /ml). At kvantificere fremstillingen af ​​transgene-afledte cytokiner og FAS-ligand, blev de transficerede iPS-ML dyrket (1 x 10

5 celler /brønd i 200 pi) i 96-brønds fladbundede dyrkningsplader i 24 timer, og koncentrationen af ​​cytokiner og FAS-ligand i kultursupernatanten blev målt ved anvendelse af ELISA-kits, der er købt fra Endogen eller R W Isoplate, Wallac) i nærvær af 10 ng /ml rekombinant IFN-α, IFN -β, IFN-γ, eller TNF-α. Tre dage senere blev luciferase substratopløsning (SteadyLite Plus, Perkin-Elmer) tilsat (50 pl /brønd), og luminescens blev målt på en mikropladelæser (TriStar, BertholdTech, Bad Wildbad, Tyskland).

Analyse af anti-tumor aktivitet af iPS-ML

in vitro

NUGC-4-celler (5 x 10

3 celler /brønd), der udtrykker luciferase blev dyrket med eller uden iPS- ML (2,5 x 10

4 celler /brønd) i 96-brønds fladbundede dyrkningsplader (B W Isoplate, Perkin-Elmer). Efter en 3-dages kultur, 50 pi /brønd af luciferasesubstrat opløsning blev tilsat, og luminescens blev målt på en mikropladelæser.

Analyse af iPS-ML infiltration i cancervæv i SCID-mus

Mus eksperimenter blev godkendt af forskningsudvalg af Kumamoto University dyr. Grøn fluorescensprotein (GFP) udtrykkende NUGC-4-celler (5 x 10

6 celler /mus) blev injiceret i peritonealhulen af ​​SCID-mus. Efter 15 dage blev iPS-ML mærket med PKH26 (Sigma) efter producentens anvisninger, og var intraperitonealt (i.p.) injiceret i mus (3 × 10

6 celler /mus). Mus blev aflivet den følgende dag og underkastet fluorescensmåling analyse til makroskopisk detektere placeringen af ​​NUGC-4 tumorer og iPS-ML på en nightowl II (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland). NUGC-4 /GFP blev påvist med 475 nm excitation og 520 nm emission filtre, og PKH26-mærkede iPS-ML blev påvist med 550 nm excitation og 600 nm emission filtre. Til mikroskopisk undersøgelse, blev cancer væv i større omentum fjernet, fikseret i 4% paraformaldehyd /PBS og indlejret i Tissue-TEK OCT-forbindelse (Sakura Finetechnical, Tokyo, Japan). Vævssnit af 20-um tykkelse blev foretaget på en kryostat og analyseret på et fluorescensmikroskop (Axio Observer Z1, Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).

Analyse af anti-tumor aktivitet af iPS-ML

in vivo

SCID mus ip injiceret med cancercellerne (5 × 10

6 celler /mus). På dag 3 eller 4, blev musene udsat for luminescens billedanalyse at undersøge tumoretablering. Efterfølgende mus med etablerede tumorer blev tilfældigt inddelt i behandlingsgrupper og kontrolgrupper. Mus i den behandlede gruppe blev injiceret med IPS-ML overensstemmelse med den angivne tidsplan, og cancercellevækst blev overvåget i mus ved luminescens billeddannelse analyse. Størrelsen af ​​cancervækst blev bestemt ved ændringen af ​​totale luminescens tællinger for hver mus.

Resultater

Karakterisering af humane iPS-celle-afledte prolifererende myeloide celler

Vi har tidligere indført en procedure til at generere myelomonocytiske celler med prolifererende kapacitet (iPS-ML) ved lentivirus-medieret transduktion af cMYC plus BMI-1 i humane iPS celle-afledte myeloide celler (iPS-MC) [25]. iPS-ML voksede mest i suspension i en M-CSF-afhængig måde. De udtrykte adskillige makrofag beslutningstagere, og var heterogen morfologi og i ekspressionen af ​​nogle af celleoverflademolekyler (fig. 1A, B).

A. Et fase-kontrast billede af levende iPS-ML i en kultur plade (øvre) og et billede af iPS-ML farvet med May-Giemsa på et dias glas (lavere) er vist. B. celleoverfladeekspression af makrofag markørmolekyler CD11b, CD14, CD4, CD13, CD33, CD36, CD87, CD97, CD115, CD116, TLR2, og TLR4 på iPS-ML blev analyseret ved flowcytometri. De farvningsprofiler i den specifikke mAb (tykke linjer) og en isotype-matchet kontrol-mAb (gråt område) er vist. C. iPS-ML i dyrkningsplader blev tilsat med FITC-mærkede zymosan partikler. Fase-kontrast (øvre) og fluorescens (lavere) billeder, efter en 90-minutters inkubation er vist. D. Efter en 40-minutters inkubation i nærvær eller fravær af zymosans blev cellerne høstet under anvendelse af trypsin /EDTA og derefter analyseret på et flowcytometer. Procentdele af celler med høj fluorescens intensitet indikerer intracellulær zymosan er vist. E. Tidsforløb for fagocytose er vist. De viste data er gennemsnit ± SD af dobbelte analyser.

For at analysere den fagocytiske evne iPS-ML, vi mikroskopisk observeret IPS-ML kultur efter tilsætning af FITC-mærkede zymosan partikler. Efter en 90-min inkubation blev fluorescenssignaler påvist i de fleste celler, hvilket indikerer, at de fleste af IPS-ML indtaget zymosan partikler (fig. 1C). Ca. 60% af IPS-ML indeholdt zymosan partikler efter 40 minutters inkubation med FITC-mærkede zymosan partikler, som vurderet ved flowcytometrisk analyse (fig. 1D). En tid kursus for fagocytose er vist i figur 1E.

Anti-cancer aktivitet af iPS-ML udtrykker anti-HER2-scFv

in vitro

En kræft-relateret antigen, HER2 /neu, udtrykkes ved forskellige former for humane cancere, herunder bryst- og gastriske cancere [28]. Vi besluttede at undersøge anti-cancer virkning iPS-ML udtrykkende anti-HER2 scFv mod en HER2-udtrykkende gastrisk cancercellelinie, NUGC-4 (fig. 2A). Til dette formål frembringes vi iPS-ML stabilt udtrykker anti-HER2 scFv (IPS-ML /anti-HER2) (fig. 2B). iPS-ML /anti-HER2 blev genereret Ips-MC afledt fra et IPS celleklon indført med en ekspressionsvektor for anti-HER2 scFv ved en tidligere beskrevet metode [21]. Vi sporadisk undersøgt og bekræftet udtryk for scFv IPS-ML /anti-HER2.

A. HER2 /neu-ekspression på NUGC-4 humane gastriske kræftceller blev analyseret. De farvningsprofiler af anti-HER2 mAb (tyk linie) og en isotype-matchet kontrol antistof (gråt område) er vist. B. celleoverfladeekspression af anti-HER2 scFv på iPS-ML (IPS-ML /anti-HER2) blev påvist ved farvning med et anti-cMYC-tag-antistof. C. Luciferase-udtrykkende NUGC-4-celler (5 x 10

3 celler /brønd) blev dyrket alene eller co-dyrket i en 96-brønds kulturplade med IPS-ml (1 × 10

4 celler /brønd ) med eller uden anti-HER2 scFv-ekspression. Antallet af levende NUGC-4-celler blev målt ved luciferaseaktivitet efter 3 dages kultur. Data er angivet som middelværdi + SD af dobbelte analyser.

Ved første vi evaluerede effekten af ​​iPS-ML /anti-HER2 mod NUGC-4-celler

in vitro

. Ildflueluciferase-indført NUGC-4-celler blev co-dyrket med IPS-ML med eller uden anti-HER2 scFv-ekspression. Vi observerede, at IPS-ML reducerede levende NUGC-4-celler, og at ekspression af anti-HER2 scFv i iPS-ML forøgede inhiberende virkning mod væksten af ​​NUGC-4-celler (fig. 2C).

Akkumulering og infiltration af ip injicerede iPS-ML i tumorvæv

Vi ønskede at vurdere, om iPS-ML havde en terapeutisk virkning på peritonealt dissemineret kræft. Makrofaginfiltration ofte observeret i kliniske prøver af kræft væv [1]. Vi undersøgte, om intraperitoneal administrerede iPS-ML infiltreret i kræft væv på forhånd har fastlagt i bughulen af ​​mus.

I dette øjemed GFP-udtrykkende NUGC-4 humane gastriske kræftceller, der er etableret ud fra en peritoneal metastatisk læsion af en diffus-typen gastrisk cancer patient, blev injiceret ip i SCID-mus. Efter 15 dage blev iPS-ML mærket med rødt fluorescerende farvestof PKH26 injiceres. Vi samtidigt injicerede rekombinant vævsplasminogenaktivator (tPA) i musen bughulen, forventer, at tPA fremmet infiltration af iPS-ML i tumorvæv. Mus blev aflivet den følgende dag, og dissekeret for at bestemme placeringen af ​​det injicerede iPS-ML ved fluorescens-analyse

Makroskopisk fluorescensanalyse detektering GFP (excitation /emission: 475/520 nm). Indikerede, at NUGC-4 tumorer primært lokaliseret i den større omentum (fig. 3A). Injicerede iPS-ML opdaget af PKH26 fluorescens (excitation /emission: 550/600 nm) blev også oftest lokaliseret i den større omentum, viser, at iPS-ML effektivt akkumuleret i tumorvæv. En sådan klar akkumulering af iPS-ML i større omentum blev ikke observeret, når iPS-ML blev inokuleret i musene uden etablerede tumorer (data ikke vist).

A. GFP-udtrykkende NUGC-4-celler (5 x 10

6 celler /mus) blev injiceret i peritonealhulen af ​​SCID-mus. Efter 15 dage blev iPS-ML mærket med fluorescerende PKH26 injiceret i.p. i musene (3 × 10

6 celler /mus). Musene blev aflivet den følgende dag og underkastet fluorescensafbildning analyse for at bestemme placeringen af ​​de NUGC-4-GFP tumorer (excitation /emission: 475/520 nm) og PKH26-IPS-ML (excitation /emission: 550/600 nm ). B. Tumor væv i større omentum af musene blev isoleret, og 20-um tyk frosne snit blev foretaget. Snittene blev analyseret på et fluorescensmikroskop, og en flettet billede med grøn fluorescens indikerer NUGC-4 /GFP-celler og rød fluorescens indikerer PKH26-farvede iPS-ML er vist. C, D Vævssnit blev fremstillet ved en lignende fremgangsmåde som for B, bortset fra at tPA ikke blev anvendt. En højere forstørrelse af området omgivet af en stiplet firkant i C er vist i D.

Vi derefter isoleret og undersøgt mikroskopisk tumor væv. I afsnit vævet vist i figur 3B, PKH26-mærket iPS-ML infiltreret i reden af ​​GFP-udtrykkende NUGC-4-celler. Lignende forsøg blev udført uden tPA injektion og større forstørrelse analyse af vævssnit tydeligt viser infiltration af iPS-ML til cancervæv (fig. 3C, D). Disse resultater indikerer, at IPS-ML effektivt infiltreret i kræft væv, når i.p. injiceret i mus, der bærer kræftformer, der er etableret i bughulen.

Ingen anti-cancer aktivitet af iPS-ML udtrykker anti-HER2-scFv

in vivo

Vi næste undersøgte effekten af iPS-ML /anti-HER2 mod NUGC-4

in vivo

. Luciferase-udtrykkende NUGC-4-celler blev inokuleret i den peritoneale kavitet i SCID-mus (5 x 10

6 celler /mus). Efter 3 dage blev cancercelle indpodning i mus undersøgt ved bioluminescens analyse, og mus med cancerceller blev tilfældigt inddelt i behandlingsgrupper eller kontrolgrupper. Fra dag 4 til 8, blev gruppen musene behandling injiceres dagligt med IPS-ML /anti-HER2 (2 × 10

7 celler /mus). På dag 10 blev musene udsat for bioluminescens analyse igen at undersøge progression af canceren.

Som vist i fig S1, NUGC-4 tumorer i IPS-ML-behandlede mus voksede endnu hurtigere end i kontrolmus. De snarere styrket NUGC-4 cancer cellevækst i dette

in vivo

model, selv om statistisk ikke-signifikant. Dette kan være fordi iPS-ML /anti-HER2 blev ramt af kræft mikromiljø at erhverve en pro-cancer fænotype.

følsomhed NUGC-4 celler til cytokiner og celledræbende molekyler

for at gøre iPS-ML stand til at overvinde kræft mikromiljø og at udøve anti-cancer effekter

in vivo

, vi fast besluttet på at yderligere at modificere iPS-ML /anti-HER2 at udtrykke yderligere molekyler. Cytokiner, såsom IFN’er, er kendt for at inducere død eller inhibere væksten af ​​cancerceller [29], [30]. Desuden er disse cytokiner kendt for at forstærke anti-cancer aktivitet af makrofager [31] – [33].

Vi analyserede følsomheden af ​​NUGC-4-celler til rekombinant IFN-α, IFN-β, IFN -γ, eller TNF-α. Efter en 24 timers inkubation i nærvær enten af ​​disse faktorer (10 ng /ml), analyserede vi apoptose ved farvning af cellerne med FITC-mærket annexin-V. Vi observerede, at alle testede cytokiner induceret visse niveauer af NUGC-4 celle apoptose (fig. S2A). At undersøge effekten for at reducere antallet af levende NUGC-4-celler, blev luciferase-udtrykkende NUGC-4-celler dyrket i 3 dage i nærvær af disse faktorer. I overensstemmelse med annexin-V-farvende data samtlige testede cytokiner faldt betydeligt antallet af levende NUGC-4-celler (fig. S2B). I begge analyser, IFN-β og IFN-γ udstillet den mest dybtgående virkning.

Generation of iPS-ML /anti-HER2 udtrykker yderligere molekyler

Vi genererede lentivirus ekspressionsvektorer for IFN og TNF-α, og introducerede dem i iPS-ML /anti-HER2. Desuden har vi indført lentivirus ekspressionsvektorer for “apoptose-inducerende faktorer”, FAS-ligand eller TRAIL. Vi var i stand til at generere transficerede iPS-ML, der producerede cytokiner på mere end 3 ng /24 time /10

6 celler, bortset fra IFN-γ (fig. S3A). Vi kunne generere transfektantkolonier iPS-ML kun producerer et lavt niveau af IFN-γ, sandsynligvis på grund af toksicitet af IFN-γ IPS-ML. Celleoverfladeekspression af TRAIL i de transfekterede iPS-ML blev bekræftet ved flowcytometrisk analyse (fig. S3B).

Vi samarbejder dyrkes IPS-ML /anti-HER2 udtrykker yderligere anti-cancer molekyler med luciferase- udtrykker NUGC-4-celler og analyseret antallet af levende NUGC-4 celler baseret på luciferaseaktivitet efter 3 dage (Fig. 4). iPS-ML /anti-HER2 udtrykker IFN-α, IFN-β, eller TRAIL viste en mere dybtgående virkning at reducere NUGC-4-celler end iPS-ML /anti-HER2, og dem, der udtrykker IFN-β var den mest potente. iPS-ML /anti-HER2 udtrykker IFN-γ eller TNF-α udviste en effekt svarende til iPS-ML /anti-HER2. Manglen på betydelig forøgelse af anti-NUGC-4 virkning af IFN-γ-transduktion kan skyldes, at mængden af ​​IFN-γ produceres af iPS-ML /anti-HER2 /IFN-γ var lavere end niveauet for at udøve anti -cancer virkning. I dette forsøg tvungen ekspression af FAS-ligand uventet svækket anti-NUGC-4 effekt af iPS-ML /anti-HER2.

Luciferase-udtrykkende NUGC-4-celler blev dyrket i en 96-brønds kulturplade (5 × 10

3 celler /brønd) med iPS-ML /anti-HER2 udtrykker IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, FAS-ligand, eller TRAIL (2,5 x 10

4-celler /brønd). Antallet af levende NUGC-4-celler blev målt ved luminescens analyse efter 3 dages kultur. Data er angivet som middelværdi + SD for tredobbelte analyser.

Terapeutisk effekt af iPS-ML /IFN-β på peritonealt formidlet NUGC-4 gastriske kræftceller i SCID mus

baseret på resultaterne af

in vitro

eksperimenter undersøgte vi

in vivo

anti-NUGC-4 effekt af iPS-ML /anti-HER2 udtrykker enten IFN-α, IFN-β, eller TRAIL. Behandling med hverken iPS-ML /anti-HER2 /IFN-α eller iPS-ML /anti-HER2 /TRAIL viste klar inhiberende virkning på væksten af ​​cancerceller

in vivo

(data ikke vist). På den anden side, iPS-ML udtrykker IFN-β udviste signifikant virkning at inhibere væksten af ​​canceren som beskrevet nedenfor.

I forsøgene vist i figur 5, vækst af NUGC-4 tumorer blev overvåget ved bioluminescens analyse på dag 4, 10 og 17 efter cancercellen inokulering. Mus med NUGC-4 tumorer på dag 4 blev inddelt i terapi eller ingen behandling (kontrol) gruppe. Mus af terapi grupper blev injiceret i.p. med IPS-ML /IFN-β eller iPS-ML /anti-HER2 /IFN-βfrom dag 4 (2 × 10

7 celler /injektion /mus, 3 injektioner om ugen). Figur 5A viser de billeddata om luminescens analyse af musene. Figur 5B viser fold-change af luminescens aktivitet fra dag 4 af kontrol- og behandlingsgrupperne, hvilket viser, at tumorvækst blev inhiberet ved behandling med IPS-ML /IFN-β eller iPS-ML /anti-HER2 /IFN-β. iPS-ML /IFN-β og iPS -ML /anti-HER2 /IFN-β var tilsvarende effektiv, hvilket indikerer, at ekspression af anti-HER2 er undværlig for anti-cancer virkning iPS-ML producerende IFN-β.

Luciferase-udtrykkende NUGC-4-celler blev injiceret ip i SCID-mus (5 x 10

6 celler /mus). På dag 4 blev musene udsat for luminescens billeddannelse analyse. Mus blev injiceret på dag 4, 6, 8, 11, 13 og 15 med IPS-ML /IFN-β eller iPS-ML /IFN-β /anti-HER2 (2 × 10

7 celler /mus for hver injektion, n = 5 for hver gruppe). Som kontrol blev 8 mus efterladt ubehandlet. Alle mus blev udsat for bioluminescens analyse på dag 10 og 17. A. luminescensen billeder vises. B. For hver mus blev luminescens signal beregnet som en relativ værdi, hvor fotonen regne på dag 4 blev defineret som 1. gennemsnit ± SD af fold-ændring fra dag 4 i kontrol- og behandlingsgrupper vises.

Figur S4 viser resultaterne af lignende forsøg til forholdsvis undersøge virkningerne af iPS-ML, iPS-ML /IFN-β, iPS-ML /anti-HER2, og rekombinant IFN-β mod NUGC-4 kræft

in vivo

. I overensstemmelse med de data, der er vist i figur 5, behandling med IPS-ML /IFN-p undertrykte signifikant udviklingen af ​​kræft. På den anden side, begge iPS-ML og iPS-ML /anti-HER2 snarere fremmet væksten af ​​cancer, selv om statistisk ikke er væsentlige. Injektion af 400 ng men ikke 200 ng /mus /injektion af rekombinant IFN-β efter det samme skema som iPS-ML injektion udviste nogle hæmmende virkning på tumorvækst, selv om virkningen ikke var statistisk signifikant.

Kollektivt , har enkle iPS-ML ikke udviser anti-cancer effekt

in vivo

. Genetisk modifikation til frembringelse af IFN-β tilvejebragte signifikant anticanceraktivitet IPS-ML. På den anden side, havde ekspression af anti-HER2-scFv ikke har en sådan virkning.

terapeutiske virkning af iPS-ML /IFN-β mod kræft i bugspytkirtlen i et xenograft model

Vi næste undersøgte effekt af iPS-ML /IFN-β behandling mod bugspytkirtelkræftceller. Tilsætning af rekombinant IFN-β til MiaPaCa-2 humane bugspytkirtelkræftceller induceret apoptose og reduceret antallet af levende celler i

in vitro

eksperimenter (fig. S5).

Vi undersøgte effekten af iPS-ML /IFN-β mod MiaPaCa-2 celler

in vivo

. Vi kunne etablere en peritoneal cancer model ved i.p. injektion af MiaPaCa-2-celler, der udtrykker luciferase i SCID-mus. I forsøgene vist i figur 6, blev 6 mus behandlet med IPS-ML /IFN-β injektion 3 gange om ugen i 2 uger fra dag 4; resultaterne af de 8 kontrolmus uden behandling er også vist. Vi observerede, at IPS-ML /IFN-β behandling signifikant hæmmet MiaPaCa-2 tumorvækst i sammenligning med kontrolmus. Faldet i den gennemsnitlige luminescens tælle fra dag 10 til dag 17 i kontrolgruppen (ingen behandling) gruppe skulle have været på grund af stigningen af ​​ascites forårsaget af cancer, fordi vi observeret en gradvis udvidelse af maven i musene i denne gruppe. De i figur 6 resultater antyder, at terapi med IPS-ML /IFN-β er effektiv mod kræft i bugspytkirtlen.

Luciferase-udtrykkende MiaPaCa-2-celler blev podet i.p. i SCID-mus (5 x 10

6 celler /mus), og musene blev udsat for luminescens billeddannelse analyse på dag 3. Mus indpodede med cancerceller blev tilfældigt opdelt i behandling (n = 6) og kontrol (n = 8 ) grupper. Mus i den behandlede gruppe blev injiceret med IPS-ML /IFN-β (2 × 10

7 celler /mus til hver injektion) på dag 4, 6, 8, 11, 13 og 15. Alle musene blev udsat for bioluminescens analyse på dag 10 og 17. luminescensen billeder vises i A. for hver mus, blev ændringen af ​​luminescens signal per mus beregnet som en relativ værdi, hvor fotontælling på dag 3 blev defineret som 1. middelværdien ± SD af folden ændring i kontrol- og behandlingsgrupper er vist i B.

diskussion

makrofaginfiltration ofte observeret i kliniske prøver af solide cancerformer, og disse makrofager kaldes TAM. I den foreliggende undersøgelse, observerede vi, at i.p. injicerede iPS-ML effektivt akkumuleret og infiltreret i forud etablerede cancervæv i det peritoneale hulrum i SCID-mus (fig. 3).