PLoS ONE: Aktivering Transskription Factor 4 giver en multiresistens Fænotype til Gastric Cancer Cells gennem Transaktivering af SIRT1 Expression

Abstrakt

Baggrund

multiresistens (MDR) i gastrisk kræft stadig en stor udfordring for den kliniske behandling. Aktivering transkriptionsfaktor 4 (ATF4) er en stressreaktion gen involveret i homeostase og cellulær beskyttelse. Imidlertid er ekspressionen og funktionen af ​​ATF4 i gastrisk cancer MDR fortsat ukendt. I denne undersøgelse, vi undersøger, om ATF4 spille en rolle i mavekræft MDR og dens potentielle mekanismer.

Metode /vigtigste resultater

Vi viste, at ATF4 overekspression confered MDR fænotypen til gastrisk kræftceller, mens knockdown af ATF4 i MDR-varianter induceret re-overfølsomhed. I denne undersøgelse viste vi også, at NAD

+ – afhængig histon deacetylase SIRT1 var nødvendig for ATF4-induceret MDR virkning i gastriske cancerceller. Vi viste, at ATF4 lettet MDR i gastric kræftceller gennem direkte binding til SIRT1 promotor, hvilket resulterer i SIRT1 opregulering. Betydeligt, hæmning af

SIRT1

af små interfererende RNA (siRNA) eller en specifik inhibitor (EX-527) genindført terapeutisk følsomhed. Også, blev øget Bcl-2 /Bax-forholdet og MDR1 ekspressionsniveauet findes i ATF4-overekspression celler.

Konklusioner /Betydning

Vi viste, at ATF4 havde en central rolle i reguleringen af ​​MDR i gastriske kræftceller i respons på kemoterapi og disse resultater tyder på, at målrette ATF4 kunne aflaste terapeutisk modstand i mavekræft

Henvisning:. Zhu H, Xia L, Zhang Y, Wang H, Xu W, Hu H, et al. (2012) Aktivering transkriptionsfaktor 4 medfører en multiresistens Fænotype til gastrisk cancer celler gennem transaktivering af SIRT1 Expression. PLoS ONE 7 (2): e31431. doi: 10,1371 /journal.pone.0031431

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: September 5, 2011; Accepteret: 8. januar 2012; Publiceret: 17 feb 2012

Copyright: © 2012 Zhu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af kombineret tilskud fra National Natural Science Foundation of China (NO.81090270, NO.81090273, og NO.81000864), den kinesiske Postdoc Science Foundation (NO.20100471776), National Key og Basic Research Development Program Kina ( NO. 2010CB529302), og National Municipal Videnskab og Teknologi Projekt (2009ZX09103-667 og 2009ZX09301-009-RC06). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

multilægemiddelresistens er normalt den vigtigste årsag til svigt af kemoterapi mod maligne tumorer, herunder gastrisk cancer [1] .Den udtrykket multilægemiddelresistens er klassisk anvendes til at definere en modstand fænotype, hvor cellerne bliver resistente samtidigt til forskellige lægemidler uden indlysende strukturel lighed og med forskellige cellulære mål [2]. MDR forekommer hyppigere med nye lægemidler, der har mere væsentlig virkning efter deres første ansøgning i kræftbehandling. Den kliniske anvendelighed af multiple lægemidler er begrænset af både naturlig og erhvervet tumorcelle resistens, som næsten altid er multifaktoriel karakter [3]. De faktorer, der kan påvirke narkotika følsomhed omfatter: accelereret drug efflux, narkotika aktivering og inaktivering, ændringer i målet narkotika, DNA methylering, forarbejdning af narkotika-induceret skade, og unddragelse af apoptose [4]

mavekræft. er relativt ufølsom over for kemoterapeutika. MDR mekanismer i gastriske cancerceller er blevet bredt undersøgt i vores laboratorium og andetsteds [1], [4], [5], men de er ikke blevet fuldt belyst, hvilket indikerer, at andre ukendte molekyler eller veje kan være involveret i udviklingen af MDR.

i pattedyrceller, eukaryote translationsinitiering faktor 2 α subunit (eIF2α) phosphoryleres af forskellige eIF2α kinaser som svar på forskellige stress-signaler, herunder iltmangel /hypoxi, endoplasmatisk reticulum stress, aminosyre afsavn, og oxidativ stress. Denne phosphorylering begivenhed fører til et hurtigt fald i den globale protein biosyntese samtidig med induktion af translationel ekspression af gener, herunder

ATF4 Hoteller, som fungerer til at lindre cellulære skader fra stress [6], [7]. Selv ATF4 kan spille en pro-apoptotisk rolle under forhold af alvorlig eller langvarig stress,

ATF4

er en potent stress-responderende gen menes at spille en beskyttende rolle ved at regulere cellulære tilpasning til ugunstige omstændigheder i den integrerede stressrespons ( ISR) [8], [9], [10]. For nylig, overekspression af ATF4 blev rapporteret at være fremtrædende i en lang række tumorer og beskytte tumorceller mod mange forskellige stressfaktorer, samt en række cancer terapeutiske midler [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. De potentielle mekanismer der er ansvarlige for denne beskyttelse omfatter autophagy induktion, fremme af DNA-skader reparation og opregulering af intracellulært glutathion [12], [13], [14], [17]. Men udtryk og funktion ATF4 i mavekræft MDR fortsat ukendt.

I denne undersøgelse vi rapporterede, at ATF4 var signifikant opreguleret i MDR respons af gastriske cancerceller sammenlignet med forældrekontrol celler. Knockdown af

ATF4

af siRNA markant sensibiliserede celler med MDR til en bred vifte af kemoterapeutiske midler, hvorimod opregulering af ATF4 i SGC7901 og AGS celler gjort dem multiresistent. Vi viste også, at ATF4 fremmet mavekræft MDR dels gennem opregulering ekspressionen af ​​SIRT1. Og SIRT1 hæmning kunne dels vende den mavekræft MDR fænotype medieret af ATF4. Disse data tyder på, at ATF4 målretning kan tilvejebringe en ny terapeutisk mulighed for at vende den kliniske mavekræft MDR.

Resultater

ATF4 modulerer MDR fænotypen af ​​gastriske kræftceller

For at afgøre, om ATF4 er involveret i udviklingen af ​​MDR i gastric cancerceller, blev ATF4 niveauer påvist ved Western blot og qPCR i SGC7901 cellelinje og dens MDR-varianter, SGC7901 /VCR og SGC7901 /ADR. Både protein og mRNA-niveauer af ATF4 var meget højere i de resistente cellelinier end i parentale celler (fig. 1A).

(A) protein og mRNA-niveauer af ATF4 i MDR gastrisk cancerceller (SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR) og forældreorlov SGC7901 celler blev undersøgt ved Western blotting og qPCR. β-actin og GAPDH blev anvendt som intern kontrol, hhv. Data repræsenterer middelværdier ± S.D. af tre uafhængige forsøg. (B) reaktion LV-vektoren og LV-ATF4 stabilt transficeret SGC7901 og AGS til cisplatin blev testet ved kolonidannelse assayet. Cellelinier blev behandlet kontinuerligt med enten 0 eller 0,25 pg /ml cisplatin i 14 d; medium blev ændret hver 3 dage. Celler blev udpladet i tre eksemplarer, og eksperimentet blev gentaget tre gange. Repræsentative brønde er vist. Grafer giver gennemsnitlig kvantificering som en procentdel af de ikke-behandlede celler. (C) LV-SCR og LV-siATF4 stabilt transficeret SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR celler blev behandlet kontinuerligt med enten 0 eller 0,5 ug /ml cisplatin for 14 d; medium blev ændret hver 3 dage. (D) og (E) LV-vektoren og LV-ATF4 stabilt transficerede SGC7901 cellelinjer og LV-SCR og LV-siATF4 stabilt transficeret SGC7901 /ADR-celler blev behandlet med angivne doser af forskellige lægemidler i 72 timer.

In vitro

narkotika følsomhed blev testet af MTT-analysen. Data repræsenterer middelværdier ± S.D. af tre uafhængige forsøg. (F) og (G) LV-vektoren og LV-ATF4 stabilt transficerede SGC7901 cellelinjer, LV-SCR og LV-siATF4 stabilt transficeret SGC7901 /ADR-celler og deres respektive ikke-behandlede modstykker (NC) blev dyrket i frisk medium i nærvær af cisplatin i de angivne koncentrationer (for SGC7901-NC, SGC7901-Vector, og SGC7901-ATF4, 5 ug /ml; for SGC7901 /ADR-NC, SGC7901 /ADR-SCR, og SGC7901 /ADR-siATF4, 10 ug /ml) i 36 timer. Derefter Hoechst 33258 nuklear farvning og DNA-fragmentering analyse udførtes. (H) SGC7901 og SGC7901 /ADR stabile transficerede cellelinjer som ovenfor blev inkuberet i yderligere 6-24 timer i frisk medium med angivne koncentrationer af cisplatin (for SGC7901-Vector og SGC7901-ATF4, 10 ug /ml; for SGC7901 /ADR- SCR og SGC7901 /ADR-siATF4, 20 ug /ml). På det tidspunkt, blev proteinekstrakter opsamlet og underkastet immunoblotanalyse for caspase-3 (uspaltede og spaltede former). β-actin blev anvendt som en intern kontrol.

For at undersøge om ATF4 overekspression er tilstrækkelig til at fremkalde en MDR fænotype i gastriske kræftceller,

ATF4

udtryk cDNA blev stabilt transficeret i SGC7901 og AGS celler. Først blev CDDP følsomhed testet under anvendelse af en kolonidannelse assay. Som vist ved kvantificeringen af ​​kolonidannelse assayet, ATF4 overekspression resulterede i en næsten 3 gange stigning i koloni numre sammenlignet med tom vektor-udtrykkende celler (fig. 1B). MTT-assays også tilkendegivet, at IC

50 værdier af SGC7901-ATF4 for ADR, VCR, CDDP, og 5-FU blev væsentligt forøget i forhold til tomme vektor transficerede celler (fig. 1D).

Som ATF4 niveauer er forhøjede i MDR gastrisk kræftceller, vi yderligere ønskede at afgøre, om at målrette ATF4 kunne re-sensibiliserer MDR-cellelinjer. Knockdown af

ATF4

af siRNA i SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR celler førte til en 2 til 3 gange reduktion i celle nummer, når de anvendes i kombination med CDDP (Fig. 1C). Data i fig. 1E antyder også, at nedregulering af

ATF4

væsentligt vender modstand SGC7901 /ADR celler som respons på kemoterapi.

Som inhibering af apoptose er en af ​​vigtige mekanismer af MDR, vi også undersøgt kapaciteten af ​​SGC7901 /ADR celler transficeret med specifikke

ATF4

siRNA at undergå CDDP-induceret apoptose ved Hoechst farvning og DNA-fragmentering assays. Behandling af SGC7901-ATF4 og SGC7901 /ADR-SCR-celler med de angivne koncentrationer af CDDP i 36 timer inducerede ikke nogen apoptose, som vurderet af Hoechst nuklear farvning (fig. 1F) og DNA-fragmentering assays (fig. 1G). I modsætning hertil SGC7901-Vector og SGC7901 /ADR-siATF4 celler viste signifikant apoptose, med hyppigere forekomst af kondenseret og fragmenterede kerner og DNA stigen formation. Desuden blev mere indlysende spaltning af procaspase-3 observeret efter behandling med CDDP i SGC7901-Vector og SGC7901 /ADR-siATF4 celler i forhold til SGC7901-ATF4 og SGC7901 /ADR-SCR celler, henholdsvis (fig. 1 H).

taget sammen indikerer disse resultater, at ATF4 bibringer en MDR-fænotype til gastriske cancerceller og at målrette ATF4 tilvejebringer en fremgangsmåde til at sensibilisere resistente celler til kemiske behandlinger.

ATF4 opregulerer ekspressionen af ​​SIRT1, MDR1 , Bd-2, og Bax i gastriske kræftceller

Tidligere undersøgelser har rapporteret, at celler, der overudtrykker SIRT1 vises nedsat følsomhed for kemoterapi ved flere mekanismer [18], [19], [20], [21]. Vi var nysgerrige efter at afgøre, om

SIRT1

, hvilket er en stress-relateret gen afgørende for MDR udvikling, kunne være den nedstrøms mål for ATF4 forestår formidlingsarbejdet ATF4-induceret MDR i gastric kræftceller.

SIRT1 niveauer i LV-Vector og LV-ATF4 stabilt transfekterede SGC7901 celler blev analyseret af qPCR og Western blot. Overekspressionen af ​​ATF4 var forbundet med øget SIRT1 ekspression på både det transkriptionelle (fig. 2A, til venstre) og translationelle niveauer (fig. 2B, venstre). I modsætning hertil siRNA knockdown af

ATF4

i SGC7901 /ADR celler resulterede i en betydelig reduktion af endogene

SIRT1

udtryk (fig. 2A og 2B, højre). Disse resultater tyder på, at ATF4 opregulerer

SIRT1

udtryk i gastriske kræftceller.

(A) mRNA-niveauer af SIRT1 i LV-Vector og LV-ATF4 stabilt transfekterede SGC7901 cellelinier (til venstre) og LV-SCR og LV-siATF4 stabilt transficeret SGC7901 /ADR-celler (til højre) blev udsat for qPCR. GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. Data repræsenterer middelværdier ± S.D. af tre uafhængige forsøg. (B) Cellelysater fra celler i afsnit A, og deres respektive ikke-behandlede modstykker (NC) blev blottet med de angivne antistoffer. β-actin blev anvendt som en intern kontrol.

For yderligere at undersøge de molekylære mekanismer involveret i ATF4-relaterede MDR af mavekræft, vi også undersøgt MDR1, MRP, bcl-2, og Bax ekspressionsniveauerne i mavens cancerceller ovenfor anvendte. Som vist i fig. 2B, ATF4-dygtige celler udtrykte mere MDR1 sammenlignet med kontrolceller. I mellemtiden var ingen tydelig forskel i MRP-ekspression fundet i nogle af disse cellelinjer. Interessant begge Bcl-2 og Bax ekspressionsniveauer var opreguleret i ATF4-dygtige celler, sammenlignet med kontrolgruppen cellelinjer, mens ekspressionen af ​​Bax viste kun små ændringer, hvilket indikerer, at en opregulering af Bcl-2 til Bax forholdet kan undertrykke den lægemiddel-induceret apoptose i ATF4-overekspression gastriske cancerceller.

Disse resultater indikerer, at ATF4 fremmer MDR evne gastriske cancerceller via flere mekanismer.

ATF4 transaktiverer SIRT1 promotoraktivitet og direkte binder sig til SIRT1 promotor

for at bestemme om ATF4 medierer

SIRT1

gentranskription, 293T-celler blev cotransficeret med 1,2 kb

SIRT1

promoter reporter plasmid og

ATF4

ekspressionsplasmid. Luciferase reporter assay viste, at

SIRT1

promotoraktivitet blev markant aktiveret ved ATF4 på en dosis-afhængig måde (Fig. 3A).

(A) 293T-celler blev co-transficeret med 1.2 kb

SIRT1

promoter reporter plasmid og

ATF4

ekspressionsplasmid. Efter 48 timer blev luciferase reporter assay anvendes til at detektere

SIRT1

promotoraktivitet. Data repræsenterer middelværdier ± S.D. af tre uafhængige forsøg. (B) En skematisk fremstilling af det humane SIRT1 genpromotor viser RT-PCR-primere holdninger til chipanalyse. (C) chips assay blev anvendt til at detektere den direkte binding af ATF4 til

SIRT1

promotor. SGC7901-ATF4 celler blev behandlet til chip bruger anti-ATF4 antistof. A1 repræsenterer den formodede distale bindingssted og A2 repræsenterer den formodede proximale bindingssted. NMU promotor- primere blev anvendt som en positiv kontrol, og GAPDH primere blev anvendt som en negativ kontrol.

I et forsøg på at få specifik indsigt i mekanismerne i

SIRT1

induktion, vi undersøgte de mulige induktion veje fra ATF4. Ved at analysere 5′-flankerende sekvens af

SIRT1

gen med bioinformatik software (Tfsitescan tjeneste, TESS, og Genomatix), to ATF4 formodede bindingssteder blev identificeret i -950 til -600 bp region af

SIRT1

promotor (fig. 3B).

for at afgøre, om

SIRT1

er et direkte mål for ATF4, chip med den ATF4 antistof ved hjælp SGC7901-ATF4 celler viste berigelse af både bindingssteder i

SIRT1

promoter region, hvilket indikerer, at RNA og efterfølgende protein niveau stiger fra

SIRT1

i ATF4-udtrykkende cellelinjer er sandsynligvis på grund af en direkte interaktion af ATF4 med

SIRT1

genpromotor (fig. 3C).

for at undersøge rollen af ​​de to ATF4 bindingssites i regulering SIRT1 transaktivering, blev steddirigeret mutagenese anvendes til at mutere disse steder. Luciferase reporter assay viste, at enten mutere bindingsstedet 1 eller bindingssted 2 reducerede SIRT1 promotoraktiviteten induceret af ATF4. Endvidere mutation af begge bindingssteder afskaffet SIRT1 promotoraktivitet. Disse resultater tydede på, at både ATF4 bindingssteder er involveret i transaktivering af SIRT1 promotoren (fig. S1).

Taget sammen indikerer disse resultater, at SIRT1 er en direkte transkriptionel mål for ATF4.

SIRT1

hæmning af siRNA dels vender MDR fænotypen af ​​ATF4-overekspression gastriske cancerceller

identifikation af ATF4-medieret

SIRT1

udtryk niveau stiger i gastrisk kræftceller, bedt os til at analysere den rolle, denne vej i gastrisk cancer MDR. For at løse dette, vi sammenlignede

in vitro

narkotika følsomhed i ATF4 stabilt transficeret gastriske kræftceller efter transfektion af

SIRT1

siRNA eller krypteret siRNA ved kolonidannelse og MTT-assays. Knockdown af

SIRT1

af siRNA i SGC7901-ATF4 celler førte til en reduktion i koloni nummer 40%, når de anvendes i kombination med CDDP (. ​​Figur 4A, øvre). Denne virkning blev også observeret i AGS-ATF4 celler (fig. 4A, lavere). Desuden data fra MTT-analysen viste også, at knockdown af

SIRT1

kunne re-sensibilisere SGC7901-ATF4 celler til kemiske stoffer, men det skete ikke i scrambled siRNA transficerede celler (fig. 4B).

(A) SGC7901-ATF4 og AGS-ATF4 celler blev transficeret med scrambled siRNA (SCR) eller SIRT1 siRNA (siSIRT1). Tooghalvfjerds timer senere blev Cellelinier behandlet kontinuerligt med enten 0 eller 0,25 pg /ml cisplatin i 14 d; medium blev ændret hver 3 dage. Celler blev udpladet i tre eksemplarer, og eksperimentet blev gentaget tre gange. Repræsentative brønde er vist. Grafer giver gennemsnitlig kvantificering som en procentdel af de ikke-behandlede celler. Indpresningsdybde, relativ SIRT1 proteinekspression ved Western blot. (B) SGC7901-ATF4 celler blev transficeret med scrambled siRNA (SCR) eller SIRT1 siRNA (siSIRT1). Tooghalvfjerds timer senere blev begge cellelinier behandlet med de angivne doser af forskellige lægemidler til yderligere 72 timer.

In vitro

narkotika følsomhed blev testet af MTT-analysen. Data repræsenterer middelværdier ± S.D. af tre uafhængige forsøg.

For at afgøre, om SIRT1 beskytter cellerne fra CDDP-induceret apoptose, SGC7901-ATF4 celler transficeret med

SIRT1

siRNA eller krypteret siRNA blev behandlet med CDDP og mærket med Annexin V og PI. De apoptotiske celler blev identificeret ved Annexin V mærkning. Den apoptotiske procentdel af SIRT1 siRNA transficeret SGC7901-ATF4 celler var signifikant højere end for kontrolcellerne (fig. 5A, 72,8% vs. 25,9%). Udseendet af kondenseret og fragmenterede kerner blev også øget i SIRT1 siRNA transficerede celler sammenlignet med kontrol-celler (fig. 5B). Endvidere blev observeret, spaltning af procaspase-3 så tidligt som 12 timer efter behandling med 10 ug /ml CDDP i SIRT1 siRNA transficerede SGC7901-ATF4 celler, men ikke i scrambled siRNA behandlede celler, selv efter 24 timer af CDDP-behandling (fig. 5C ). Disse resultater antyder, at SIRT1 overekspression undertrykker CDDP-induceret apoptose.

(A) SGC7901-ATF4 celler blev transficeret med scrambled siRNA (SCR) eller SIRT1 siRNA (siSIRT1). Tooghalvfjerds timer senere blev cellerne inkuberet i yderligere 36 timer i frisk medium i fravær eller nærvær af cisplatin ved 5 ug /ml. Efter lægemiddelbehandling blev cellerne mærket med Annexin V og PI. Fordelingen mønster af levende og apoptotiske celler blev bestemt ved FACS-analyse. (B) SGC7901-ATF4 celler blev transficeret ved den samme måde i afsnit A og derefter behandlet med 5 ug /ml cisplatin i 36 timer. Derefter Hoechst 33258 nuklear farvning blev udført for at detektere apoptotiske celler. (C) SGC7901-ATF4 celler blev transficeret ved den samme måde i afsnit A og blev inkuberet i yderligere 6-24 timer i frisk medium med 10 ug /ml cisplatin. På det tidspunkt, blev proteinekstrakter opsamlet og underkastet immunoblotanalyse for caspase-3 (uspaltede og spaltede former). β-actin blev anvendt som en intern kontrol. (D) SGC7901-ATF4 celler blev transficeret ved den samme måde i afsnit A. Tooghalvfjerds timer senere blev cellelysater blottet med de angivne antistoffer. β-actin blev anvendt som en intern kontrol.

For at undersøge effekten af ​​nedregulering af SIRT1 af siRNA på MDR forbundet molekyler, vi undersøgte MDR1, MRP, bcl-2, og Bax ekspressionsniveauerne i SGC7901-ATF4 celler efter transfektion med SIRT1 siRNA eller krypteret siRNA. Nedregulering af MDR1 blev observeret i SIRT1 siRNA-behandlede celler (fig. 5D) sammenlignet med kontrolceller. I modsætning hertil fandtes ingen indlysende forskel på MRP, Bcl-2, og Bax ekspressionsniveauer mellem prøverne.

Disse observationer indikerer, at SIRT1 medierer ATF4-inducerede MDR virkning i gastriske cancerceller.

Hæmning af SIRT1 aktivitet re-sensibiliserer ATF4 transfekterede celler til DNA-skadelige stoffer

for at bevise, at SIRT1 katalytiske aktivitet er også ansvarlig for de ATF4-induceret MDR, SGC7901-ATF4 celler blev forbehandlet med EX-527 en hidtil ukendt, kraftig og specifik små-molekyle hæmmer af SIRT1, og efterfulgt af behandling med forskellige kemiske stoffer. Først, vi bestemt den basale cytotoksicitet EX-527 i LV-Vector og LV-ATF4 stabilt transfekterede SGC7901 celler. MTT-assayet viste, at EX-527 ved koncentrationer op til 10 uM inhiberede ikke, men snarere lidt forøget, levedygtighed begge cellelinier (fig. 6A). Dernæst undersøgte vi SIRT1, ATF4, MDR1, MRP, Bcl-2, og Bax ekspressionsniveauer efter 24 timers inkubation med eller uden de angivne doser af EX-527 i det gastriske cancerceller ovenfor anvendte. Kun ekspressionen af ​​MDR1 blev nedreguleret af EX-527 i en koncentrationsafhængig måde (fig. 6B). Derefter præinkuberes vi SGC7901-ATF4 celler med vehikel eller EX-527 (0,5, 1, 2, 4, og 10 uM) i 24 timer, og derefter CDDP- og 5-FU-medieret celledød blev overvåget. Som vist i fig. 6C, EX-527 forbedret betydeligt cytotoksiciteten af ​​begge lægemidler på en dosis-afhængig måde. Vi bestemt også den mulige synergistiske virkning af EX-527 på forskellige doser af CDDP- og 5-FU-medieret hæmning af celleproliferation i SGC7901-ATF4 celler. Som forventet, 10 uM EX-527 er tilstrækkelig til at potensere cytotoksiciteten af ​​begge lægemidler (fig. 6D).

(A) LV-vektoren og LV-ATF4 stabilt transficeret SGC7901 cellelinier blev inkuberet med eller uden angivne doser af EX-527. Seksoghalvfems timer senere blev celle-levedygtighed bestemt ved MTT-assayet. (B) Stabilt transficerede SGC7901 cellelinier i afsnit A blev inkuberet med eller uden EX-527 (1-10 uM) i 24 timer, og totale cellelysater blev underkastet immunoblotting med de angivne antistoffer. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. (C) SGC7901-ATF4 celler blev præinkuberet med de angivne doser af EX-527 i 24 timer. Derefter SGC7901-vektor og SGC7901-ATF4 celler blev udsat for cisplatin (1 ug /ml) eller 5-fluorouracil (1,25 ug /ml) i yderligere 72 timer. Cell levedygtighed blev bestemt ved MTT-assayet. (D) SGC7901-ATF4 celler blev præinkuberet med eller uden EX-527 (10 uM) i 24 timer. Derefter blev cellerne eksponeret for de angivne doser af cisplatin eller 5-fluoruracil til yderligere 72 timer. Cell levedygtighed blev bestemt ved MTT-assayet. Alle data repræsenterer middel ± S.D. af tre uafhængige forsøg. Grafer giver gennemsnitlig kvantificering som en procentdel af de ikke-behandlede celler.

Disse resultater tyder på, at SIRT1 aktivitet spiller også en afgørende rolle i ATF4-inducerede mavekræft MDR og denne rolle kan være medieret dels gennem MDR1 udtryk .

diskussion

MDR udgør væsentlige kliniske udfordringer for effektiv kemoterapi af mange menneskelige maligniteter. De mekanismer, hvorved celler erhverver modstand er mange og komplekse, så mere omfattende forståelse af dem, samt identifikation af nye mekanismer for kemoresistens, vil være særlig nyttigt at give bedre behandlingsmuligheder. Denne undersøgelse er den første rapport, at høje niveauer af ATF4, almindeligvis ses i tumorceller under stressende omstændigheder giver gastriske cancerceller med en MDR-fænotype, og den identificerer, at denne virkning medieres dels ved transaktivering af SIRT1 ekspression.

ATF4

SIRT1

er evolutionært bevarede stress respons gener involveret i et bredt spektrum af biologiske processer, hvoraf mange er gavnlig for homeostase og cellulære beskyttelse [22], [23], [ ,,,0],24]. Begge disse gener induceres som reaktion på en række spændinger, herunder iltmangel (hypoxi /anoxi), oxidativt stress, DNA-skader, ernæringsmæssige afsavn, og chemotoxic stress. Levenson VV

et al.

Først rapporteret, at ændringer i ekspression af ATF4 kunne spille en rolle i den pleiotropiske modstand mod forskellige klasser af DNA-målretning narkotika [16]. I de seneste år, havde adskillige undersøgelser vist, at ATF4 var involveret direkte eller indirekte i udviklingen af ​​lægemiddelresistens gennem autophagy, glutathion-afhængige redoxsystem, og DNA-beskadigelse reparation [11], [12], [13], [14] , [15], [16], [17], [25], [26]. Her viser vi, at den beskyttende evne ATF4 faktisk medierer en MDR-fænotype i ATF4-overudtrykkende gastriske cancercellelinier som respons på kemoterapi. Vores resultater viser tydeligt, at overekspression af ATF4 i gastriske kræftceller var forbundet med mere modstand, mens knockdown af ATF4 induceret re-overfølsomhed. Disse data antyder, at ATF4 er sandsynligvis en vigtig nedstrøms mediator af resistens skyldes flere forskellige mekanismer, og er derfor en værdifuld terapeutisk mål. Men som en af ​​de vigtigste transkriptionelle mediatorer af ISR som aktiverer en række af målgener, der fremmer genopretning af homeostase, ATF4 kan også mediere resistens ved andre mekanismer. I vores undersøgelse, blev SIRT1 fundet at være opreguleret i ATF4-overudtrykkende celler sammenlignet med vektor transficerede celler. I modsætning hertil knockdown af

ATF4

med ATF4 specifikke siRNA førte til en nedregulering af SIRT1 i MDR gastrisk kræftceller. Vores resultater tyder på, at SIRT1 kunne være en downstream formidler af ATF4-induceret mavekræft MDR.

Som medlem af ATF underfamilien af ​​den grundlæggende-regionen leucin lynlås (bzip) transkriptionsfaktorer [22], ATF4 har potentiale til at fungere som enten en transskriptionel aktivator eller en transkriptionel repressor via ATF eller cAMP responsive element (CRE) bindingssteder [22]. Den konsensus bindingssted for ATF blev defineret som TGACGT (C /A) (G /A) [27], som er en sekvens identisk med CRE konsensus element (TGACGTCA) [28]. Også den stærkt konserverede kerne motiv – ACGT – kan i de fleste Cres [29] binde til forskellige bzip faktorer, afhængigt af de flankerende baser af kernen motiv [22], [30], [31]. I vores undersøgelse blev der fundet to formodede ATF-CRE bindingssteder i 1,2 kb

SIRT1

promoter region, og ATF4 direkte aktiveret

SIRT1

transskription via binding til både bindende elementer. Men hvordan de to bindingssteder spiller deres roller efter nærmere stress omstændigheder forbliver ukendt og kræver yderligere undersøgelse.

pattedyr

SIRT1

er det tætteste homolog af gær

SIR2

den mest omfattende undersøgt SIRT familiemedlem. Det er stærkt impliceret i reguleringen af ​​cellulære processer, der bestemmer levetiden, herunder anti-apoptose, neuronal beskyttelse, og cellulær aldring eller aldring [32]. For nylig har et stigende antal undersøgelser Involveret forøget ekspression af SIRT1 med resistens over for kemoterapi og ioniserende stråling [18], [19], [20], [33], [34], [35], [36]. For eksempel har SIRT1 overekspression blevet fundet i lægemiddelresistent neuroblastom, osteosarkom, brystkirtler, ovarie-, prostata-, colon og lunge cancercellelinier sammenlignet med deres stof-følsomme modparter. Alle disse lægemiddelresistente virkninger af SIRT1 kunne muligvis være på grund af dets anti-apoptotiske virkning [37], [38] og dæmpning af tumorsuppressorgener [39]. Endelig kan vi forudsige, at hvis SIRT1 er involveret i ATF4-inducerede MDR, bør inhibering af SIRT1 påvirke følsomheden af ​​ATF4-overudtrykkende celler som respons på kemoterapi. Som forventet, både siRNA og farmakologisk hæmning af SIRT1 kunne re-sensibilisere ATF4-overekspression celler til kemiske stoffer. Desuden er vores undersøgelse viser, at SIRT1 beskytter celler fra døden dels gennem en anti-apoptotisk virkning.

Det er blevet rapporteret, at MDR1 var opreguleret i celler med forøget SIRT1 ekspression [18], [36]. I denne undersøgelse har vi også vist, at MDR1 er opreguleret i ATF4-overudtrykkende celler, og knockdown af SIRT1 med SIRT1 specifikke siRNA eller hæmme dets aktivitet med EX-527 kunne føre til nedregulering af MDR1, som er konsistent med et lægemiddel resistent rolle SIRT1. Imidlertid Bcl-2 /Bax-forhold, som var opreguleret i ATF4-overudtrykkende celler, blev SIRT1-uafhængig, hvilket antyder, at SIRT1-uafhængige mekanismer også spille en rolle i ATF4-inducerede MDR i gastriske cancerceller.

sammenfattende vi vise, at ATF4 giver en MDR fænotype til gastrisk kræftceller, og denne effekt er delvist medieret af transaktivering af SIRT1 overekspression. Desuden ATF4 er en gyldig target i lægemiddelresistente gastriske tumorer, og bør tages i betragtning udviklingslande effektive inhibitorer af ATF4 i fremtiden. Disse resultater giver nye indsigter i rollen som ATF4 kontrollere SIRT1 udtryk og i sine stress-modstand funktioner i tumorigenese og kemoterapi. Dette er især vigtigt for klinisk overvejelse, da ATF4 kan være op-reguleret af ilt afsavn, oxidativt stress, ernæringsmæssige afsavn og næsten alle de negative stressfaktorer i en tumor mikromiljø, som kunne kapret af kræftceller at unddrage spredning hæmning og celledød i respons på kemoterapi. Derfor kan interventioner forjættede på forstyrre stress-induceret ATF4 udtryk i kræftceller være effektiv til at omgå eller vende lægemiddelresistens i mavekræft.

Materialer og metoder

For detaljerede metoder, se tekst S1 .

Cell kultur og reagenser

de humane gastrisk adenocarcinom cellelinjer SGC7901 (fås fra Academy of Military Medical Science, Beijing, Kina) og MDR varianter, SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR (etableret og opretholdt i vores laboratorium), og AGS (opnået fra cellen bank kinesiske videnskabsakademi, Shanghai, Kina) blev dyrket i RPMI-1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone) og penicillin /streptomycin. 293T-celler (også opnået fra cellen bank af kinesiske Academy of Sciences) blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum. For at opretholde den MDR-fænotype, adriamycin (med en slutkoncentration på 0,5 ug /ml) og vincristin (med en slutkoncentration på 1 ug /ml) tilsat til dyrkningsmediet for SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR-celler, hhv. EX-527 (Sigma) blev opløst i DMSO ved de angivne koncentrationer. Adriamycin (ADR), vincristin (VCR), cisplatin (CDDP) og 5-fluorouracil (5-FU) blev opløst i normalt saltvand ved angivne koncentrationer.

Cell transfektion og stabil cellelinier

Den menneskelige

ATF4

ekspressionsplasmid (pCMV5-ATF4) blev venligst stillet til rådighed af professor Amy S. Lee [25]. Lentiviral vektor, der koder siRNA specifikt til

ATF4

og kontrol siRNA blev dannet med anvendelse af PLKO.1-TRC (Addgene) og blev betegnet som LV-siATF4 og LV-SCR kontrol hhv.