PLoS ONE: Karakterisering det genetiske grundlag for nikotin induceret Cancer Development: En Transkriptomet Sequencing Undersøgelse

abstrakt

Nikotin er et kendt risikofaktor for udvikling af cancer og er blevet vist at ændre genekspression i celler og væv efter udsættelse. Vi brugte Illumina® Next Generation Sequencing (NGS) teknologi til at få uvildig biologisk indsigt i transkriptomet af normale epitelceller (MCF-10A) til nikotin eksponering. Vi genererede udtryk data fra 54,699 udskrifter ved hjælp af tre eksemplarer af kontrol og nikotin stressede celler. Som et resultat, vi identificeret 138 differentielt udtrykte transkripter, herunder 39 ukarakteriserede gener. Derudover 173 transkripter, der primært er forbundet med DNA-replikation, rekombination, og reparation viste tegn på alternativ splejsning. Vi opdagede den største nikotin stress respons ved HPCAL4 (opreguleret med 4,71 gange) og NPAS3 (ned-reguleret af -2,73 gange); begge er gener, som ikke tidligere er blevet impliceret i nikotin eksponering, men er forbundet med cancer. Vi opdagede også signifikant nedregulering (-2,3 gange) og alternativ splejsning af NEAT1 (lncRNA), som kan have en vigtig, men uopdaget regulerende rolle. Gene ontologi analyse afslørede nikotin eksponering påvirket gener involveret i cellulære og metaboliske processer. Denne undersøgelse afslører hidtil ukendte konsekvenser af nikotin stress på transkriptomet af normale bryst epitelceller og giver indsigt i den underliggende biologiske indflydelse af nikotin på normale celler, der markerer grundlaget for fremtidige undersøgelser

Henvisning:. Bavarva JH, Tae H, Settlage RE, Garner HR (2013) karakterisering det genetiske grundlag for nikotin induceret Cancer Development: En Transkriptomet Sequencing Study. PLoS ONE 8 (6): e67252. doi: 10,1371 /journal.pone.0067252

Redaktør: Emmanuel Dias-Neto, AC Camargo Cancer Hospital, Brasilien

Modtaget: Februar 5, 2013; Accepteret: 15. maj 2013; Udgivet: 18 juni 2013

Copyright: © 2013 Bavarva et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Medicinsk Informatik og Systems Division instruktørens fond på Virginia Bioinformatics Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på verdensplan er mere end 1 million kvinder diagnosticeret med brystkræft hvert år, og mere end 410.000 dør af sygdommen [1]. Store kohortestudier udført i USA og Japan indikerer, at risikoen for brystcancer er associeret med aktiv og passiv rygning [2], [3]. Undersøgelser har vist, at 80-90% af inhaleret nicotin absorberes systemisk under rygning, 1 mg fra en enkelt cigaret, hvilket resulterer i plasmakoncentrationer på ca. 15 ng /ml umiddelbart efter rygning [4]. In vivo studier viser nikotin fremmer væksten af ​​faste tumorer, hvilket antyder, at nikotin kan bidrage til celleproliferation, invasion, og angiogenese [5] – [7]. Yderligere er nikotin vist at tilsidesætte DNA beskadigelse-induceret celle-cyklus G1 /S begrænsning og fremmer således genetisk ustabilitet [8]. Tidligere undersøgelser har vist, at nikotin stimulering kunne ændre genekspression i endotelceller og neuroblastomceller [9], [10]. En microarray studie knyttet nikotin stimulation med transskription faktor NF-kB, men konkluderede, at der ville blive krævet fremtidig analyse, da de evaluerede kun 4132 gener, og der var en stærk mulighed vigtige gener var forpasset [9]. En anden microarray studie af neuroblastomceller foreslog, at fysiologiske og psykologiske virkninger af nikotin eksponering kan skyldes virkningerne på genekspression, men de havde også lignende tekniske begrænsninger [10]. Derudover undersøgelser af nikotin mangler konsensus om nikotin dosering.

Vi hypotesen det manglende led mellem nikotin stress og kræft vil blive fundet ved hjælp af en uvildig sekventering tilgang frem for en målrettet vifte tilgang. Næste generations sekventering (NGS) teknikker, i modsætning til cDNA microarrays tidligere anvendte, muliggør systematisk undersøgelse af kendte, karakteriseret udskrift udtryk over et bredt dynamisk område, og alternative og nye splejsningsbegivenheder uden teknologiske og /eller biologisk bias. Dette all inclusive-tilgang kan give bedre spor til komplekse veje, forståelse af karakteriserede udskrifter og giver manglende oplysninger om genregulering under nikotin stress, der tidligere ikke var muligt med mikroarrays. Desuden valgte vi en LD

50 dosis, fordi det er standardiseret og er etableret som et nøjagtigt middel til at måle effekterne [11]. Her beskriver vi resultaterne fra denne systematisk analyse og opdagede hidtil ukendte sammenslutninger af karakteriserede udskrifter.

Materialer og metoder

Reagenser, kemikalier og cellekultur

Nikotin blev købt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). MCF-10A, normalt bryst epitelcelle-line, blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). MCF-10A-celler blev dyrket i DMEM /F12-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA), suppleret med hesteserum (5% endelig, Invitrogen), antibiotika-Pen /Strep (1% endelig, Invitrogen), vækstfaktor- EGF (20 ng /mL endelig, Peprotech, Rocky Hill, NJ), hydrocortison (0,5 mg /ml endelig, Sigma), choleratoksin (100 ng /mL endelig, Sigma), og insulin (10 pg /mL endelig, Sigma) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% carbondioxid.

eksperimenter

Fireogtyve timer før eksperimenterne blev MCF-10A-celler podet med en tæthed på ca. 3 × 10

5 celler /brønd i seks-brønds plader eller 5 × 10

7/500 cm

2 firkantede celle dyrkningsskåle (Corning). Nikotin blev fortyndet i komplet dyrkningsmedium på de påkrævede endelige serielle koncentrationer. Nikotin dosering blev udført i seks-brønds plader i 72 timer og ved afslutningen; antallet af levende celler blev beregnet ved hjælp af TC10 BioRad® celletæller. Disse doseringsformer eksperimenter blev yderligere analyseret og sammenlignet for nikotin LD

50 dosis (5 mM /811 ng /ml) i 500 cm

2 plader i 72 timer. Efter eksponeringsperioden blev vedhæftede celler høstet til RNA-ekstraktion under anvendelse af et Qiagen s RNeasy® kit efter fabrikantens protokol. RNA blev ordentligt testet for kvalitet på Nano-drop® og Bioanalyzer® før transkriptom sekventering blev udført ved hjælp af Illumina HiSeq®.

Transkriptomet sekventering

RNA biblioteker blev fremstillet ifølge TruSeq® RNA prøveforberedelse guide som pr producentens anbefalede protokol (Illumina, San Diego, CA). Total RNA for de tre biologiske replikater fra kontrol- og nikotin stresset cellepopulationer transkriberet til cDNA. Gratis DNA-prøver blev derefter klippet ved forstøvning (35 psi, 6 min). Duplexer blev stumpendebehandlet (store Klenow-fragment, T4-polynukleotidkinase og T4-polymerase) blev og en enkelt 3’adenosine del tilsat anvendelse af Klenow exo- og dATP. Illumina adaptere, indeholder primer sites for flowcellen overflade annealing, amplifikation og sekventering, blev ligeret på de reparerede ender af cDNA’et. Gelelektroforese blev anvendt til at selektere for DNA-konstruktioner 200-250 basepar i størrelse, som efterfølgende blev amplificeret med 18 PCR-cykler med Phusion polymerase (NEB). Disse biblioteker blev derefter denatureret med natriumhydroxid og fortyndet til 3:05 i en hybridiseringsbuffer til lastning på en enkelt bane af et Illumina HiSeq® flowcelle. Klyngedannelse, primerhybridisering og sekventeringsreaktioner var ifølge producentens protokol. High throughput sekventering blev udført under anvendelse parret-end, 100 basepar læser. Et flow lane blev brugt til cDNA sekventering, hvilket giver et gennemsnit på 45.260.000 læser per prøve med gennemsnitlig kvalitet score på . 36,3

RNASeq dataanalyse

RNASeq data blev analyseret efter metoden beskrevet af Trapnell et al., [12]. Kort fortalt blev TopHat v2.0.3 brugt til at tilpasse RNAseq læser til Ensemble GRCh37 genom som leveres af Illumina iGenome med anmærkninger. Genekspression blev målt for hvert gen fra Ensembl database ved Kortlagte Fragmenter pr kb af exon model pr Million kortlagt læser (FPKM) beregnet ved hjælp Manchetknapper v2.0.1. Vi brugte programmet CuffDiff v2.0.1 at teste for differentiel udskrift udtryk og alternative splejsning begivenheder i hver gruppe af cellelinier. Standardparametre blev anvendt til alle analyser. Gener blev anset differentielt udtrykte efter justering for multiple test; p ≤ 0,05. Cummerbund pakke til R blev anvendt til at generere scatter plots vist i supplerende data. Gener med tegn på alternativ splejsning (dem med en Q-værdi 0,05 tyder på en ændring i den relative forekomst af forskellige transkripter stammer fra et enkelt transkriptionsstartstedet), blev identificeret ved CuffDiff. Manchetknapper udfører udskrift inferens og overflod estimering efterfulgt af differential test af relativ overflod hjælp Jensen-Shannon Afvigelse (JSD) til at påvise for alternativ splejsning [13]. I denne sammenhæng JSD er et mål for ændringen i den relative forekomst af multiple transkripter fra hver locus på tværs af to eksperimentelle betingelser [14]. Genfunktioner og biologiske processer blev undersøgt ved anvendelse PANTHER klassificeringssystem [15] og transskriptionsfaktor berigelse blev udført ved anvendelse opfindsomhed Pathway Analysis (IPA) software (https://www.ingenuity.com). Sekvens læser er tilgængelige i NIH Short Læs Arkiv under forsøget accession nummer SRX254950.

Kvantitativ RT-PCR

For hver prøve 1 ug totalt RNA revers transkriberet under anvendelse af Qiagen QuantiTect revers transkription kit (Valencia, CA) ifølge producentens standardprotokol. For Taqman real-time PCR, blev 1,0 pi fortyndet cDNA anvendes til 20 pi realtids-PCR under anvendelse af Taqman Gene Expression Master Mix ifølge producentens standardprotokol. Applied Biosystem s Taqman anvendte assays var som følger: HPCAL4 (Hs04188853_g1), NEAT1 (Hs01008264_s1), Actin (Hs01060665_g1) og 18S rRNA (Hs03928985_g1). Kvantitativ RT-PCR blev udført i en StepOnePlus real-time PCR-system (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Resultater og Diskussion

Kvalitetskontrol og differential ekspressionsanalyse

Dette er den første transkriptom sekventering undersøgelse af nikotin understregede normale bryst epitelceller. Expression analyse via direkte transkriptom sekventering (RNAseq) sonder de sjældneste og mest celle- og kontekst-specifikke udskrifter. Desuden er RNAseq metoder ikke påvirket af forudgående kendskab til splejsning og tillade analyse for at bestemme den fulde repertoire af alternativt splejsede isoformer. Endelig RNAseq som metode har vist sig at være mere kvantitativ som antallet af læser produceret fra en RNA-transskript er en funktion af denne transkriptet og genekspression i stedet for en kemisk egenskab ved probehybridisering at ændringer med sammensætningen af ​​prøven [16 ] – [18]

for at identificere differentielt udtrykte gener og udskrifter, vi først bekræftede RNAseq data var fri for sekventering bias og viste en ensartet dækning på tværs prøver (Figur S1).. Vi derefter normaliseret prøverne (FPKM), beregnet en teststørrelse (p-værdi) og justeres p-værdi (q-værdi). Fra denne, var der i alt 2015 differentielt udtrykte udskrifter (q-værdi 0,05), 1680 opreguleret og 335 nedreguleret (tabel S1). I alt 138 transkripter blev differentielt udtrykt med ± 2 gange ændring (107 opreguleres og 31 nedreguleres) efter eksponering for nikotin og 39 af disse var karakteriseret (tabel 1). Vi brugte Taqman realtids-PCR til at validere de to øverste gener (HPCAL4 og NEAT1) og bekræftede deres op- og nedregulering (figur S2).

Kræft er en multifaktoriel sygdom, der er knyttet til antallet af underliggende biologiske begivenheder såsom inflammatorisk respons, tumorsuppressorgener, onkogener og transkriptionsfaktorer. En fordomsfri, altomfattende tilgang med næste generation sekventering kan derfor give mere fuldstændige oplysninger, og hjælpe os til bedre at forstå de manglende forbindelser. Vores resultater viste, at HPCAL4, TREM1, EFNA2, SPATA22 og KRT85 er de fem opreguleret gener og NPAS3, DEFB129, NEAT1, WDR96 og VRK2 er de fem nedreguleret gener upon nikotin eksponering. Hippocalcin like 4 (HPCAL4) og udløser receptor udtrykt på myeloide celler 1 (TREM1) blev stærkt opreguleret gener med mere end fire gange ændring på nikotin stress. HPCAL4 er en relativt under-studeret gen og har ukendt funktion, men det er rapporteret at være overudtrykt i lungecarcinom [19]. Den kromosomområde 1p34.2, hvor HPCAL4 ligger, er også forbundet med mange typer cancer, herunder bryst-, lunge-, neuroblastom, og kolorektal [19]. Det er muligt, at HPCAL4 gen kunne være årsagen til sådanne foreninger i disse kræftformer. TREM1 er vist at være involveret i inflammatorisk respons og er en positiv regulator af TNF-α og IL-8 [20]. TREM1 er også et mål for matrixmetalloproteinaser (MMP’er), der kan spalte ekstracellulære proteiner. Denne transmembrane glycoprotein besidder en Ig-lignende ektodomæne let spredes fra MMP’er at generere sTREM-1. Mens membran-forankret TREM-1 forstærker inflammatoriske responser, sTREM1 udviser anti-inflammatoriske egenskaber [21]. I denne undersøgelse har vi også observeret opregulering af MMP2 der kan indikere en mulig stigning i sTREM1 og derfor anti-inflammatoriske virkninger. Det styrker tidligere nikotin fund, hvor det blev rapporteret at udstille immunosuppressive og anti-inflammatoriske virkninger [22]. EFNA2 aktivering fremmer endotelcelle inflammatoriske respons [23], SPATA22 har en rolle i meiotisk DNA-reparation eller rekombination og er nødvendig til meiotisk fremskridt i muse kimceller [24] og KRT85 er et hår keratin gen, som er blevet rapporteret at være transskriptionelt aktiveret af NF-KB effektor p65 /RelA [25]. Den mest nedreguleret gen, NPAS3, har vist tumor undertrykkende aktivitet [26] og derfor sin nedregulering i nikotin stressede celler antyder NPAS3 mulige ukendt rolle i øget cancer modtagelighed. Interessant nok blev påvist nogen af ​​de bedste regulerede gener som udtrykkes forskelligt i tidligere microarray undersøgelser [9]. Dette er sandsynligvis på grund af flere årsager, herunder forskellige celletyper anvendt, forskellige dosis og eksponeringstider og teknologiske begrænsninger. Mere påfaldende er, at bortset fra TREM1, alle andre top regulerede gener er rimelig ny og dublerede. Dette berettiger yderligere grund til at sekventere transcriptomes for nikotin stressede celler som det sandsynligvis afslører hidtil ukendte forbindelser.

En distinkt nedreguleret gen er NEAT1, som er en lang ikke-kodende RNA (lncRNA) kendt for at være en væsentlig strukturel faktor for paraspeckles [27]. Den funktionelle rolle af ikke-kodende RNA’er ikke er veldefinerede; dog Chen et. al., har for nylig foreslået en funktionel rolle NEAT1 i reguleringen af ​​mRNA eksport [28]. Vi er, for første gang, rapporterer den differentielle respons lncRNA nikotin. Dette skaber muligheder for at vove sig ind nye uudforskede veje i kræftforskning og eksemplificerer en større rolle for lncRNAs i transskription regler og kræft udvikling.

Alternativ splejsning analyse

Fejl i mRNA splejsning er en vigtig årsag til sygdom og flere undersøgelser har rapporteret kræftspecifikke alternativ splejsning selv i fravær af genomiske mutationer [29]. Vi identificerede 173 gener, som viste tegn på alternativ splejsning (tabel S2). Tyve tre af disse også er differentielt udtrykt (tabel S3). Det er også vigtigt at bemærke, at NEAT1 er en af ​​de mest nedregulerede lncRNAs der også fremlagt bevis for alternativ splejsning ved nikotin stress. De øverste atten gener med kvadratroden af ​​

Jensen-Shannon divergens

0,8 er vist i tabel 2. Disher et. al., foreslog, at mis-splejsning efter oxidativ stress repræsenterer en ny og væsentlig genotoksisk resultat og at det ikke blot er DNA-læsioner induceret af oxidativ stress, som fører til mis-splejsning men ændringer i alternativ splejsning maskinen, [30]. Nikotin er rapporteret at inducere oxidativt stress i dyrkede celler [31], og derfor, at kunne være en grund til påvisning af afvigende splejsningsvarianter i nikotin stressede celler. Multiple splejsede former af et enkelt gen kunne have kontrasterende biologiske egenskaber. For eksempel splejsningsvarianter af MDM2 viser både onkogene og væksthæmmende egenskaber [32]. Derfor, for at afdække biologiske betydning af alternativt splejsede gener på nikotin stress fortjener yderligere undersøgelser.

Gene ontologi

For at få indsigt i karakteren af ​​de gener, der reguleres og alternativt splejset på nikotin stress udførte vi gen ontologi analyse ved hjælp PANTHER klassifikationssystem analyseret ved hjælp binomialtest statistik og Bonferroni korrektion. Betydeligt beriget biologiske processer og genfunktioner er vist i figur 1. Under nikotin stress, størstedelen af ​​generne differentielt reguleret og alternativt splejset var involveret i metaboliske, cellulære og udviklingsmæssige processer og har katalytiske og bindende funktioner. Interessant, differentielt udtrykte (DE) gener havde højere forening med strukturel molekylær aktivitet vers den transkriptionelle regulerende funktion alternativt splejsede gener. DE gener blev yderligere analyseret ved Ingenuity Pathway Analysis (IPA) for at identificere biokemiske veje, der kan blive berørt. Figur S3 viser netværket af gener, der er associeret med cancer, det endokrine og nervesystem, som er påvirket af nikotin. NF-KB-kompleks og østrogenreceptor findes også i netværket af differentielt udtrykte gener tyder deres sammenkædning med nikotin stress induceret DE gener. Det fremgår af denne analyse, at nikotin påvirker immunrespons gener, der angiver den mulige påvirkning af nikotin på graduering af normale immunsystem aktivitet. Epiteliale cancer og dermatologiske lidelser var de øverste to biologiske funktioner forbundet med nikotin-understregede regulerede gener som afsløret af IPA. Interessant er østrogenreceptor indirekte forbundet til netværket tyder et fjernt forhold og mulig indflydelse af nikotin stress. Også, blev disse gener forbundet med celle bevægelse, signalering, spredning, død og overlevelse funktioner. Canonical ovariecancer signalveje var signifikant associeret til disse resultater. Tre af molekyler fra kanonisk ovariecancer vej, MMP2, CGA og WNT7B var op reguleret på nikotin eksponering. Funktionel betydning af alternativt splejsede gener evalueret gennem IPA afslørede den øverste netværk af gener, der er forbundet med DNA-replikation, rekombination, og reparation (figur S4).

Pie illustrerer ligheder og forskelle mellem GO vilkår i henhold til de følgende kategorier. (1A) Biologisk fremgangsmåde til differentielt udtrykte gener. (1B) Biologisk fremgangsmåde til alternativt splejsede gener. (1C) Molekylær funktion for differentielt udtrykte gener. (1D) Molekylær funktion for alternativt splejset gener.

Transskription regulator analyse

For at identificere, hvilken transskription regulatorer regulerer den differentielle ekspression af de gener, der er beskrevet i disse eksperimenter, op- og ned regulerede gener blev genindført i IPA og analyseret for berigelse af transskription regulatorer er forbundet til initiativtagere til differentielt udtrykte gener. Der var fem op regulator gener (S100A14, HEY1, CGA, IGFBP2 og LGALS1) fra listen. Deres målmolekyler, herunder MMP2 og PROX1, blev også opreguleret i undersøgelsen indikerer en stram korrelation (tabel 3). Alle de mulige transskription regulatorer, hvis mål gener udtrykkes forskelligt er beskrevet i tabel S4. Opregulering af S100A14 er forbundet med basal-type brystkræft sammenlignet med ikke-basale typer [33]. S100A14 foreslås også at være en nyttig markør til påvisning metastatisk colorektal og brystcancer [34]. CGA identificeres som ny ER-α responsive gen i humane brystcancerceller og eventuelt en stærk markør til at forudsige tamoxifen reaktionsevne i brystcancer [35]. Markant højere udtryk for IGFBP2 er rapporteret i brystkræft væv sammenlignet med godartet brystvæv [36]. LGALS1 undertrykker T-celle-medierede cytotoksiske immunreaktioner og fremmer tumorangiogenese [37]. Derfor overekspression af S100A14, CGA, IGFBP2 og LGALS1 i nikotin stressede celler antyder deres samlede rolle i øget cancer modtagelighed hos rygere. I vores undersøgelse, nikotin stress opregulerer HEY1 og MMP2. Det omvendte scenarie blev observeret ved evaluering anti-cancer effekter af curcumin, der resulterede i nedregulering af HEY1 og MMP2, på grund af inaktivering af Notch-1 som curcumin hæmmede spredning og invasion [38]. Disse tyder rolle nikotin i støtte af kræft udvikling og muligheden for curcumin til at reducere risikoen for og udviklingen af ​​kræft hos rygere. MMP-2 overekspression er blevet rapporteret i mange neoplasmer [39], herunder æggestokkene [40] og bryst [41] kræftformer. Det er blevet foreslået, at MMP-2 ikke kun kan være en selvstændig indikator for øget tumor aggressivitet, men også vigtige i aktivering af andre proteaser, der er direkte involveret i tumor angiogenese [42]. Det forlyder, at nikotin forøger MMP2 ekspression og stimulerer esophageal pladecarcinom celle (TE-13) migration og invasion [43]. Derfor opregulering af MMP2 på nikotin stress i vores undersøgelse yderligere styrker tidligere resultater og fremhæver muligheden for, at MMP2 er en væsentlig biomarkør for at vurdere risikoen for kræft hos rygere. PROX1 er en transkriptionel regulator involveret i neurogenese samt en række forskellige cancertyper. Ændringer i PROX1 er rapporteret i flere kræftformer, selvom det ikke altid er klart, om PROX1 udøver tumor undertrykkende eller onkogene egenskaber. Colon og kræft i hjernen viser PROX1 overekspression, hvorimod brystkræft afslører reduceret udtryk grundet hypermethylering [44]. Derfor, i vores undersøgelse, virkningerne af forhøjet PROX1 udtryk upon nikotin stress er ukendte.

Interessant, transskription regulator HEY1 er placeret på cytogenetisk band 8q21. Amplifikation af 8q21 er forbundet med dårlig patient prognose i brystkræft og er uafhængig af MYC [45]. Andre nærliggende interessante gener, der blev ramt af nikotin stress omfatter alternativt splejset NAPRT1 og CPSF1 ved cytogenetisk band 8q24. Selvom vi ikke studere kromosomet amplifikation i dette studie, er effekten af ​​nikotin stress på transkription regulator HEY1, NAPRT1 og CPSF1 ved eller nær 8q21 er tankevækkende. For at undersøge de samlede virkninger af nikotin på gener pr kromosom, analyserede vi alle differentielt udtrykt og alternativt splejsede gener (falsk opdagelse korrektion q≤0.05) (Figur S5). Tolv procent af generne placeret på kromosom 19 blev differentielt udtrykt og 14 transkripter på kromosom 12 udviste evidens for alternativ splejsning ved nikotin stress. Imidlertid kromosom 17 havde både et højt differentielt udtrykte og alternativt splejsede transkripter og det er interessant at bemærke, at brystkræft markør BRCA1 er også placeret på kromosom 17. Mens årsagen til kromosomale bias er ukendt, udtryk ubalance er tidligere dokumenteret i hepatocellulært carcinom [46]. Kromosomal bias differentielt udtrykte udskrifter upon nikotin stress derfor garanterer fremtidige dybdegående undersøgelser.

Mens denne pilotundersøgelse forsøger at udnytte standardiseret koncentration af nikotin at dokumentere fysiologiske og genotoksisk effekt, lavere koncentration af nikotin identiske med dem, der findes i plasmaet efter rygning kan anvendes i fremtiden for yderligere at vurdere virkningerne.

som konklusion denne undersøgelse viser, at nikotin stress udløser reaktioner fra en række dublerede og ukarakteriserede gener og forårsager uregelmæssig splejsning begivenheder, der kumulativt kan bidrage mod udviklingen af ​​kræft og ændret immunsystem aktivitet hos rygere. Derudover gener placeret på kromosom 12, 17, og 19 viser forspændt følsomhed over for nikotin stress indikerer ukendt biologisk betydning. Dette indebærer, at nikotin vil være et additiv i cancer formering ved at modulere immun- aktivitet og æggestokkræft signalveje. Denne undersøgelse har brede implikationer, som vi præsenterer nye mulige forbindelser mellem gener såsom HPCAL4 (opreguleret), NPAS3 (nedreguleret) og NEAT1 (alternativt splejset såvel som højt nedreguleret lncRNA), der kan målrettes eller overvåges for at reducere eller vurdere risikoen for udvikling af kræft hos rygere (især) og kræftpatienter. Observationer fra denne transkriptom undersøgelse giver således frisk biologisk indsigt i nikotin stress på normale bryst epitelceller, der kan udnyttes i kliniske omgivelser til at vurdere de skadelige virkninger af nikotin hos rygere.

Støtte oplysninger

figur S1.

Density graf og scatter plot. (1A) cummerbund blev anvendt til at generere en densitet graf af tætheder af de FPKM værdier på tværs af alle gener. Kontrol og Nikotin prøverne var meget ens, hvilket indikerer ingen bias i sekventering dækning mellem prøverne. (1B) De FPKM værdier for alle gener blev plottet for kontrol og Nikotin prøver, efter gennemsnitsberegning tværs gentagelser og normalisering. Hver prik repræsenterer et gen

doi:. 10,1371 /journal.pone.0067252.s001

(JPG)

Figur S2.

Validering af top to gener ved Taqman real-time RT-PCR. Taqman real-time RT-PCR validering vurdering af HPCAL4 (op reguleret) og NEAT1 (ned reguleret) angiver den generelle aftale af RNASeq fund og kvantitativ PCR. Fold ændringer var i forhold til kontrollen og normaliseret til de multipleksede husholdningsgener (Actin og 18S rRNA). Fejl søjler repræsenterer standardafvigelser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0067252.s002

(JPG)

Figur S3.

Ingenuity pathway analyse af differentielt udtrykte gener. Top netværk fra Ingenuity pathway analyse viser, at DE gener har vigtig rolle i kræft. De, der er vist i rødt er opreguleret, grøn er nedreguleret, og dem i hvid tjene til at gøre den indirekte forbindelse mellem DE generne

doi:. 10,1371 /journal.pone.0067252.s003

(JPG)

Figur S4.

Ingenuity pathway analyse af alternativt splejsede gener. Top netværk fra Ingenuity pathway analyse viser, at alternativt splejsede gener har tilknytning til DNA-replikation, rekombination, og reparation

doi:. 10,1371 /journal.pone.0067252.s004

(JPG)

Figur S5.

differentielt udtrykte og alternativt splejsede udskrifter pr kromosom og deres relative procenter. (4A) Radar graf viser relative procentdele af DE udskrifter pr kromosom. (4B) Radar graf viser relative procentdele af alternativt splejsede udskrifter pr kromosom. . (4C) Tabel illustrerer det samlede antal differentielt udtrykte og alternativt splejsede udskrifter pr kromosom

doi: 10,1371 /journal.pone.0067252.s005

(JPG)

tabel S1.

Liste over alle differentielt udtrykte gener og ukarakteriserede udskrifter (q 0,05)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0067252.s006

(XLS)

tabel S2.

Udskrifter som viste tegn på alternativ splejsning

doi:. 10,1371 /journal.pone.0067252.s007

(XLS)

tabel S3.

Overlappende gener, der viste forskellen udtryk og tegn på alternativ splejsning

doi:. 10,1371 /journal.pone.0067252.s008

(XLS)

Tabel S4.

IPA transskription faktor berigelse analyse præsenterer alle transkriptionsfaktorer, der kan have påvirket forskelligt regulerede gener

Doi:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s009

(XLS)

Tak

Dette arbejde blev støttet af Medical Informatics og Systems Division instruktørens fond på Virginia Bioinformatics Institute.