PLoS ONE: topoisomerase 1 Inhibitor Austrobailignan-1 Isoleret fra Koelreuteria henryi inducerer en G2 /M-Phase Anholdelse og celledød Uafhængigt af p53 i ikke-småcellet lungekræft celler

abstrakt

Koelreuteria henryi

Dummer, et endemisk plante af Taiwan, har været brugt som en folkemedicin til behandling af hepatitis, enteritis, hoste, pharyngitis, allergi, hypertension, hyperlipidæmi og cancer. Austrobailignan-1, en naturlig lignan derivat isoleret fra

Koelreuteria henryi

Dummer, har antioxidative og anti-cancer egenskaber. Imidlertid har effekten af ​​austrobailignan-1 på humane cancerceller ikke blevet undersøgt endnu. Her viste vi, at austrobailignan-1 inhiberede cellevækst af human ikke-småcellet lungekræft A549 og H1299 cellelinier i både dosis- og tidsafhængige opførsel, IC

50 værdi (48 h), i austrobailignan-1 var 41 og 22 nm. Data fra flowcytometrisk analyse viste, at behandling med austrobailignan-1 i 24 timer forsinket cellecyklussen ved G2 /M-fasen. Den molekylære tilfælde af austrobailignan-1-medieret G2 /M-fasen anholdelse var forbundet med stigningen i p21

WAF1 /Cip1 og p27

Kip1 udtryk, og fald i Cdc25C udtryk. Desuden behandling med 100 nM austrobailignan-1 i 48 timer resulterede i en udtalt frigivelse af cytochrom c, efterfulgt af aktivering af caspase-2, -3, og -9, og følgelig induceret apoptose. Disse begivenheder var ledsaget af stigningen i PUMA og Bax, og faldet i Mcl-1 og Bcl-2. Endvidere vores undersøgelse viste også, at austrobailignan-1 var en topoisomerase 1-inhibitor, som det fremgår af en lempelse assay og induktion af en DNA-skader reaktion signalvejen, herunder ATM, og Chk1, Chk2, γH2AX phosphoryleret aktivering. Samlet tyder vore resultater, at austrobailignan-1 er en hidtil ukendt DNA-ødelæggende middel og viser en topoisomerase I inhiberende aktivitet, forårsager DNA-strengbrud, og følgelig inducerer DNA-skader reaktion signalering for cellecyklus G2 /M og apoptose i en p53 uafhængig måde.

Henvisning: Wu CC, Huang KF, Yang TY, Li YL, Wen CL, Hsu SL, et al. (2015) topoisomerase 1 Inhibitor Austrobailignan-1 Isoleret fra

Koelreuteria henryi

inducerer en G2 /M-Phase Anholdelse og celledød Uafhængigt af p53 i ikke-småcellet lungekræft Cells. PLoS ONE 10 (7): e0132052. doi: 10,1371 /journal.pone.0132052

Redaktør: Peiwen Fei, University of Hawaii Cancer Center, UNITED STATES

Modtaget: 9. januar 2015; Accepteret: 9. juni 2015; Udgivet: Juli 6, 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra Taichung Veterans General Hospital (TCVGH1033209C) til Tsung-Ying Yang, MD, ph.d., samt fra Taichung Veterans General Hospital (TCVGH -1027305D), og TCVGH-1027319D til Dr. Shih-Lan Hsu

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste dødsårsag for både mænd og kvinder i mange lande, herunder Taiwan, der udviste den højeste stigning i dødeligheden lungekræft i en nylig årti [1, 2]. De fem-års overlevelse på patienter med lungecancer ud stadie II er kun 13-25% [3]. Lungekræfttilfælde histologisk klassificeres i to hovedtyper: småcellet lungecancer (SCLC) og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). The NSCLC, udgør 85% af lungekræft incidens, og kan underinddeles i tre grupper: adenocarcinom, pladecellecarcinom og storcellet carcinoma. Kliniske strategier til behandling af lungekræft patienter omfatter kirurgi, kemoterapi, strålebehandling og målrettet terapi. Selv lovende terapi har vist sig til behandling af patienter med lungecancer i de sidste ti år, en stor del af patienterne stadig ikke helbredt [4]. Derfor, for at søge efter nye lægemidler med større effekt og sikkerhed er et presserende behov for patienter med lungecancer.

Apoptose er en tæt reguleret proces styres af enten ydre (Død receptor) og /eller iboende (mitokondrie) veje [5 ]. Bcl-2-familien proteiner har en central rolle i at kontrollere mitokondrie apoptotiske vej. Bcl-2 og Mcl-1 er anti-apoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien og deres forhøjede ekspression findes i mange typer af tumorceller [6]. Bax og Bak tilhører pro-apoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien, deres aktivering fører til oligomerisering forårsager dannelse af porer, som igen resulterer i en forøgelse af mitokondrisk ydre membranpermeabilitet og frigive cytochrom c for at aktivere caspase kaskade. Bcl-2 og Mcl-1 kan direkte binde med Bax og forhindre apoptotisk aktivering af Bax [7]. PUMA er en generel sensor af apoptotiske stimuli og en lovende lægemiddelmål til cancerterapi [8, 9], som inducerer apoptose ved aktivering af pro-apoptotisk protein Bax gennem dets interaktion med anti-apoptotiske Bcl-2-familiemedlemmer, herunder Bcl-2 og Mcl-1. Interaktionerne mellem PUMA med anti-apoptotiske proteiner bevirker en forskydning af Bax, hvilket resulterer i aktivering af pro-apoptotiske aktivitet af Bax [10]. Akkumulerende beviser peger på, at induktion af apoptose ved at målrette Bcl-2 familie proteiner betragtes som en potentielt lovende terapeutisk tilgang i humane kræftformer [7].

akkumulere data viser, at naturmedicin har anti-cancer egenskaber og vise evnen til at inhibere væksten eller inducere apoptose af forskellige typer af tumorceller. De aktive komponenter af plantelægemidler, der er ansvarlige for de anti-cancer effekter og deres underliggende mekanismer, dog, stort set uklar. Identifikation og karakterisering af disse komponenter, således kan bidrage til at fremskynde udviklingen af ​​potentielle anti-cancer medicin.

Koelreuteria henryi

Dummer (

K

.

henryi

), en endemisk plante i Taiwan, har været brugt som en folkemedicin til behandling af enteritis, hepatitis, allergi, hypertension, pharyngitis, hoste, hyperlipidæmi, og kræft i Taiwan [11-13]. Lignan en phytoøstrogen derivat forbindelse, som i vid udstrækning findes i urter, udviser forskellige fysiologiske virkninger, herunder forbedring af leveren og kardiovaskulær funktion og forebyggelse af osteoporose og cancere [14]. Lignaner har også vist sig at være kraftigt virkende inhibitorer af human DNA-topoisomerase-I og II [15-17]. Austrobailignan-1, en naturlig lignin, isoleret fra blad af

K

.

henryi

, har anti-proliferative virkninger i forskellige typer af tumorceller [13, 18, 19] virkningerne og underliggende mekanismer austrobailignan-1 i cancerceller, dog fortsat ukendt. I denne undersøgelse, vi isoleret austrobailignan-1 fra bladet af

K

.

henryi

, og undersøgte DNA topoisomerase I hæmmende virkning in vitro og cytotoksiske virkninger af austrobailignan-1 i humane ikke-småcellet lungekræft celler. Vi fandt, at austrobailignan-1 inhiberede topoisomerase 1-aktivitet og forårsagede DNA beskadigelse respons signalering følgelig retarderede cellecyklussen ved G2 /M-fasen og udløste apoptotisk celledød i både lunge adenocarcinom A549 og H1299 cellelinier. Desuden viste vi også, at flere molekyler relateret til cellecyklusstop og apoptose blev moduleret af austrobailignan-1.

Materialer og metoder

Kemi og reagenser

4 ‘, 6’-diamindino-2-phenylindol (DAPI), propidiumiodid (PI), ribonuclease (RNase), dimethylsulfoxid (DMSO), og Triton X-100 blev indkøbt fra Sigma-Aldrich Inc. (St. Louis, MO., USA ). Kalvefosterserum og RPMI1640 medium blev købt fra GIBCO BRL (Gaithersburg, MD, USA). Antistofferne mod p21

WAF1 /Cip1 (sc-397), p27

Kip1 (sc-667), p53 (sc-126), Cdc25C (sc-327), Cdk1 (sc-53.219), cyclin A1 (sc-751), cyclin B1 (sc-245), Bcl-2 (sc-509), cytochrom c (sc-13156) og β-actin (sc-47.778) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Californien , USA). COX IV (4844), Mcl-1 (4572), Bax (2772), Bak (3814), PUMA (12450), phospho-ATM (4526), ​​phospho-H2AX (9718), phospho-Chk1 (2341), phospho -Chk2 (2661) og phospho-p53 (9284) antistof blev købt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA), som beskrevet i tidligere rapport [20]. Inhibitoren af ​​caspase-2 (Z-VDDADFMK, # FMK003) blev indkøbt fra R 0,05, ** p 0,01, *** p . 0.001

Resultater

Austrobailignan-1 inducerede cellecyklus G2 /M fase anholdelse og celledød i både A549 og H1299 celler

tab af normal funktion af p53 havde været at finde i over halvdelen af ​​alle humane tumorer [29]. Litteraturen viser, at p53 er et af de mest vigtige regulatorer i mediering vækststandsning og apoptose induceret af forskellige indre eller ydre påvirkninger, herunder kemoterapeutiske midler [30]. Desuden er p53 er også en vigtig stik og switcher mellem cellecyklusstandsning og apoptotisk proces. Når skaderne ikke er i stand til at blive repareret, p53 aktiverer transskription af forskellige pro-apoptotiske gener, herunder Bax, Noxa, PUMA, Fas, og DR5 [31, 32] for at udføre apoptotiske proces. Alternativt p53 udløser apoptose ved undertrykkelse af anti-apoptotiske gener, såsom Bcl-2, således at inducere frigivelse af cytochrom c, efterfulgt af caspase-3 og -9 aktivering [31]. Det er veldokumenteret, at status af p53 kan påvirke respons af cancerceller til nogle kemoterapeutiske lægemidler [33]. Vi først undersøgt antiproliferative virkninger af austrobailignan-1 oprenset fra bladene af

K

.

henryi

(figur 1 og [12]) i human NSCLC A549 (+ p53, som høster en vildtype-p53) og H1299 (p53, som er p53-nul) cellelinier. Som vist i figur 2A, behandling med austrobailignan-1 inhiberede væksten af ​​A549 og H1299-celler i både koncentrations- og tidsafhængig opførsel med IC signifikant

50 værdier af 41 og 22 nm efter 48-h administration. Resultaterne viste også, at behandling af lungekræft celler med lave koncentrationer (mindre end 10 nM) på austrobailignan-1 forårsagede en cytostatisk virkning, kun inhiberede celleproliferation men ingen cytotoksisk effekt observeret ved mikroskopisk undersøgelse. Men behandling med høj koncentration (30 og 100 nM) på austrobailignan-1 udviste morfologiske træk ved apoptotisk celledød, flydende og blæredannelse celler blev observeret (data ikke vist). For at løse den præcise handling ansvarlig for austrobailignan-1-medieret antiproliferativ virkning blev cellecyklusfordeling profil undersøgt. Som angivet i fig 2B, eksponering af A549 og H1299-celler til 30 og 100 nM austrobailignan-1 i 24 timer førte til en akkumulering af celler i G2 /M-fasen i forhold til kontrolceller, kombineret med et samtidigt fald i andelen af celler i G1 og S faser. Derudover en hypodiploid DNA-indhold peak (sub-G1 population), som indikerer nedbrudt DNA og et kendetegn for apoptose, blev observeret efter 24 timer af højdosis behandling og øget kontinuerligt efter 48-h austrobailignan-1 inkubation (Fig 2B ). For yderligere at bekræfte induktion af apoptose ved austrobailignan-1 i A549-celler, blev TUNEL-assayet og DAPI-farvning udføres. Som angivet i fig 2C, behandling med 100 nM austrobailignan-1 i 48 timer signifikant inducerede den apoptotiske celledød med kondenserede kerner og forøgelse af TUNEL-positive celler (grøn fluorescerende farvede celler), hvilket antyder, at DNA-fragmentering blev der forekommer i disse celler.

(A) A549 og H1299-celler blev behandlet med forskellige doser (0, 1, 3, 10, 30 og 100 nM) på austrobailignan-1 til 24 og 48 timer. Celleantal blev målt ved en Trypan-blå eksklusion farvestof metode. Data er udtrykt som middelværdi ± S.D. fra 3 uafhængige eksperimenter. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 V.S. kontrol). (B) Celler blev behandlet med forskellige doser (0, 3, 10, 30 og 100 nM) på austrobailignan-1 i 24 og 48 timer, og derefter farvet med propidiumiodid, og flowcytometri blev udført for at undersøge fordelingen cellecyklus. (C) Celler blev behandlet med eller uden 100 nM austrobailignan-1 i 48 timer blev en TUNEL-assay derefter udført til påvisning af apoptotiske celler (grøn) og kerne-DNA’et blev farvet med DAPI (blå). De farvede celler blev undersøgt ved fluorescensmikroskopi. Forstørrelse x 400; Målestokken, 50 um.

Austrobailignan-1 inhiberede topoisomerase 1-aktivitet og inducerede DNA beskadigelse signalvejen

Lignan familie forbindelser har vist sig at være kraftigt virkende inhibitorer af human DNA-topoisomerase 1 [16, 17]. Dernæst anvendtes en kommerciel DNA afslapning assay kit til in vitro måling af topoisomerase 1-aktivitet i nærvær af austrobailignan-1. Dette kit er majorly at analysere muligheden af ​​topoisomerase-1 til at slappe af et supersnoet DNA. Fig 3A viser, at austrobailignan-1 inhiberede DNA afslapning aktivitet af topoisomerase 1 dosisafhængigt. Camptothecin, et kendt Topoisomerase 1-inhibitor, blev anvendt som positiv kontrol. Ved 100 nM, austrobailignan-1 udviste potent inhibitorisk aktivitet til camptothecin (100 uM), hvilket indikerer, at austrobailignan-1 kan være mere effektiv end camptothecin.

(A) Inhibering af DNA-topoisomerase 1-aktivitet. Phot-1-DNA plasmid blev inkuberet med forskellige koncentrationer af austrobailignan-1 (0, 10, 30, og 100 nM) og topoisomerase 1 ved 37 ° C i 30 minutter. Reaktionsprodukterne blev separeret ved 1% agarosegel og farvet med ethidiumbromid. Den fluorescens billede blev registreret af Mikrofotografi. Camptothecin (CPT) blev anvendt som en positiv kontrol. S. C. DNA: super sammenrullet DNA, Slap DNA: slappe lukket cirkulært DNA. (B) DNA-skade respons. A549 og H1299-celler blev behandlet uden eller med 30, 100 nM austrobailignan-1 i 24 timer, og DNA-skader på per celle basis blev undersøgt ved en komet assay. Repræsentative kometbilleder fra celler udsat for austrobailignan-1 ved forskellige koncentrationer er vist (øvre panel). Graden af ​​DNA-skader blev scoret af hale øjeblik (% DNA i halen x hale længde) fra mindst 100 celler i hver behandlingsgruppe (nederste panel). Data er gennemsnit ± SD for tre uafhængige forsøg. **

s

0,01, ***

s

0,001. (C) Aktivering af ATM-signalvejen ved austrobailignan-1. A549 og H1299-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af austrobailignan-1 i 24 timer, de udtrykte niveauer af phosphoryleret ATM, Chk1, Chk2, H2AX, og p53 proteinerne blev undersøgt ved Western blot analyse. β-actin blev anvendt som en intern ladningskontrol

litteraturen viser, topoisomerase 1 inhibitor kan inducere dobbeltstrengede pauser (DSBs) og så føre til DNA-skade respons [34, 35].; Derfor blev en komet assay udført for at undersøge, om austrobailignan-1 forårsagede DNA-skader i A549 og H1299 celler. Som afbildet i fig 3B, austrobailignan-1 forøgede komet hale bevægelse i begge testede celler i en koncentrationsafhængig måde. ATM er en velkendt DNA-skader sensor og regulator. Efter eksponering på DNA-skade belastninger såsom oxidativt stress eller inhibitorer af topoisomerase 1 og 2, er ATM /ATR kinaser aktiveret af phosphoryleret i ser1981 [36], som igen phosphorylerer talrige nedstrøms substrater, herunder Chk1-ser345, Chk2-thr68, γH2AX -ser139, og p53-ser15, etc., og i sidste ende fører til cellecyklusstandsningen og apoptose [37, 38]. Dernæst blev de potentielle virkninger af austrobailignan-1 på ATM signalvejen undersøgt. Data fra Western blot analyse viste klart en koncentrationsafhængig fosforylering af ATM-ser1981, Chk1-ser345, Chk2-thr68, γH2AX-Ser139 og p53-ser15 i austrobailignan-1-behandlede celler (fig 3C). Men niveauet af total ATM, Chk1, og Chk2 forblev uændret som reaktion på austrobailignan-1 eksponering (data ikke vist).

Austrobailignan-1 reguleret cellecyklus relaterede proteiner

Vi har vist at p53 kan phosphoryleres af ATM /ATR kinaser i nærvær af austrabailignan-1 i A549-celler. Den aktive p53 kan transkriptionelt øge ekspressionsniveauerne af p21

WAF1 /Cip1, p27

Kip 1 [39], som begge er breakers af cellecyklusprogression. Desuden er Cdc25 dobbelt specificitet fosfatase familie (Cdc25A, Cdc25B og Cdc25C) er en anden almindelig signal transducer nedstrøms substrat af ATR /ATR /CHKS. Phosphoryleret inaktivering af Cdc25C medieret af ATM /ATR /CHKS spiller en central rolle i G2 /M fase anholdelse og efterfølgende apoptose induceret af flere antitumormidler [40-43]. For at løse den efterfølgende molekylære begivenhed af austrobailignan-1-medieret cellecyklus retardering, ekspressionsniveauerne af G2 /M-relaterede molekyler såsom p53, p27

Kip 1, p21

WAF-1 /Cip1, Cdk1, Cdk2, cyclin A, cyclin B1 og Cdc25C blev undersøgt efter forskellige doser af austrobailignan-1 (0, 10, 30, og 100 nM) behandling af A549-celler i 24 timer. Som forventet udtrykkene for p53, p21

WAF1 /Cip1, p27

Kip1 og cyclin B1 blev forøget mens cyclin A og Cdc25C blev reduceret (figur 4A) i austrobailignan-1-behandlede celler sammenlignet med ubehandlede kontrolceller. Niveauerne af Cdk1 og Cdk2 blev ikke påvirket af austrobailignan-1. Begrænset af stoffet tilgængelighed, blev kun p21

WAF1 /CIP1, p27

Kip 1 og Cdc25C niveauer undersøgt i p53-nul H1299 cellelinje. Tilsvarende opregulering af p21

WAF1 /Cip1 og p27

KIP 1 og nedregulering af Cdc25C blev observeret i austrobailignan-1-behandlede H1299 celler (Fig 4B). Disse resultater indikerede, at austrobailignan-1-medierede cellulære og molekylære begivenheder i de testede cellelinier var p53 uafhængigt.

(A) A549-celler blev behandlet med 0, 3, 10, 30 og 100 nM austrobailignan-1 til 24. efter behandling blev celleekstrakt opsamlet og analyseret ved Western-blot. (B) H1299-celler blev behandlet med 0, 10, 30, 100 nM austrobailignan-1 i 24 timer, niveauerne af p21Waf1 /Cip1, p27KIP1, og Cdc25C blev påvist ved Western blot. β-Actin blev anvendt som en loading kontrol.

Austrobailignan-1-induceret iboende mitokondrier-medieret apoptose

Fordi caspase-aktivering spiller en central rolle under executional fase af apoptose [44] at undersøge, om austrobailignan-1-induceret apoptose gennem aktivering af caspase-vejen, aktiviteten af ​​caspase-2 og -3, -8, -9, og -12 blev anslået under anvendelse af en caspase fluorogent peptidsubstrat kit. Som vist i fig 5A og 5B, behandling af A549 og H1299-celler med 100 nM austrobailignan-1 resulterede i aktivering af mitokondrier-relateret caspase-2, -9, og -3, men ikke dødsreceptor-relateret caspase-8 og endoplasmatiske reticulum-associeret caspase-12. Til karakterisering rolle caspaseaktivering i austrobailignan-1-induceret apoptose, A549 og H1299-celler blev forbehandlet med inhibitorer af caspase-2 (Z-VDDADFMK), caspase-3 (Z-DEVD-FMK), og caspase-9 (Z -LEHD-FMK) i 1 time og derefter behandlet med 100 nM austrobailignan-1 for en anden 48 timer. Inhibitorerne af caspase-2, -3 og -9 signifikant beskyttet A549 og H1299 celler mod austrobailignan-1-medieret celledød (figur 5C). Disse resultater antydede, at de aktiverede caspaser kan bidrage til austrobailignan-1-udløst apoptose i disse celler.

(A) A549-celler blev behandlet med 100 nM af austrobailignan-1 for angivne tidsperioder (0, 12, 24 , og 48 h). (B) H1299 celler blev udsat for austrobailignan-1 i 48 timer. Cellelysaterne blev høstet, og de caspase aktiviteter blev bestemt ved anvendelse fluorogen substrater. Data er udtrykt som middelværdi ± S.D. fra tre uafhængige forsøg. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 V.S. vehikelbehandlede kontrolgruppe). (C) caspaseinhibitorer blokere austrobailignan-1-induceret celledød. A549 og H1299-celler blev forbehandlet med 50 pM indiceret caspaseinhibitorer i 1 time, og derefter behandlet med 100 nM austrobailignan-1 for en anden 48 timer. Cellelevedygtigheden blev målt ved en trypanblåt ekskluderingsmetode. (D) Regulering af Bcl-2-familien proteiner. A549 og H1299-celler blev behandlet med 0, 30, 100 nM austrobailignan-1 i 48 timer. Niveauerne af de angivet Bcl-2 familie-proteiner blev undersøgt ved Western blot. (E) Frigivelse af cytochrom

c

fra mitokondrier til cytosol. A549 og H1299-celler blev behandlet uden eller med 100 nM austrobailignan-1 i 24 og 48 timer. Efter behandling, partikler og cytosoliske fraktioner blev isoleret, niveauet af cytochrom

c

protein blev analyseret ved Western-blot. α-tubulin og cytochrom oxidase IV blev anvendt som indlæsning kontrol.

På grundlag af de ovenstående resultater, aktivering af caspase-2, -3, og -9 involveret i austrobailignan-1-induceret apoptose , hvilket indikerer, at mitokondrielle apoptotiske vej blev aktiveret. Det er kendt, at Bcl-2-familien proteiner er involveret i den indre mitochondria-medieret apoptose [45]. For at få yderligere indsigt i de molekylære begivenheder, der er involveret i austrobailignan-1-induceret apoptose, blev de udtrykte niveauer af Bcl-2, Mcl-1, Bax, Bak, og PUMA undersøgt. Ekspressionen af ​​pro-apoptotiske molekyler Bax, Bak, og PUMA blev drastisk forøget, mens niveauerne af anti-apoptotiske proteiner Bcl-2 og Mcl-1 blev formindsket efter austrobailignan-1 behandling (Fig 5D). Cytochrom c spiller en central rolle i Bcl-2-familien protein-medieret apoptotisk død. Det befinder normalt i mitokondrierne men translokerer i cytosolen, kørsel caspaseaktivering ved begyndelsen af ​​apoptotiske spændinger. Således blev den cellulære fordeling af cytochrom c undersøgt. Som afbildet i fig 5E, administration af austrobailignan-1 resulterede i frigivelse mitokondrie cytochrom c til cytosol. Disse resultater antyder, at austrobailignan-1-induceret apoptose var hovedsageligt via den iboende mitokondrie-udløste pathway.

p53 var ikke nødvendigvis påkrævet for austrobailignan-1-induceret cellecyklus G2 /M standsning og celledød

Vores resultater har vist, at autrobailignan-1-induceret celledød i både A549 og H1299 cellelinjer (fig 2A og 2B). Phosphorylering af p53 på ser

15 websted udgør sædvanligvis apoptotisk aktivering [46]. Figurerne 4A og 5E viste, at austrobailignan-1-behandling forøgede niveauerne af total p53 og phosphoryleret p53-ser15 i A549-celler, hvilket indebærer en rolle af p53 i austrobailigan-1-induceret celledød. For at karakterisere hvorvidt p53 faktisk spiller en rolle i austrobailignan-1-medieret cellecyklusstop og apoptose, vi næste undersøgte virkningen af ​​austrobailignan-1 i p53-knockdown A549 (A549-p53-shRNA) celler, der var stabilt transficeret med en p53 -specifik shRNA [47]. Der var ingen signifikant forskel mellem A549, vektor kontrolceller (A549 (-shRNA) og A549-p53-shRNA celler i cellecyklusstandsning (Fig 6A) og i cellelevedygtighed efter 48 timers austrobailignan-1 behandling (Fig 6B). Vi har derfor konkludere, at austrobailignan-1-medieret G2 /M anholdelse og celledød kræver ikke nødvendigvis p53.

(A) De A549-shRNA eller A549-p53shRNA celler blev behandlet med austrobailignan-1 (0, 10, 30 og 100 nm) i 48 h. fordelingen cellecyklus blev bestemt ved flow cyotmetry. (B) A549-shRNA og A549-p53shRNA celler blev behandlet uden eller med 100 nM austrobailignan-1 i 48 timer. niveauerne af p53-protein blev påvises ved Western blot (øverste panel). cellen levedygtighed blev bestemt ved en trypanblåteksklusion metode (nederste panel).

diskussion

i denne undersøgelse, giver vi den beviser at austrobailignan-1, en lignan familie sammensatte isoleret fra

Koelreuteria henryi

Dummer, hæmmede topoisomerase-1-aktivitet, og derefter udløste en DNA-skader signalvejen dermed førte til celle-cyklus anholdelse og apoptose i human ikke- småcellet lungekræft A549 og H1299 celler. De stigende niveauer af p21

WAF1 /Cip1 og p27

Kip1, og faldende Cdc25C niveau, viste, at disse molekyler var aktivt involveret i respons på austrobailignan-1-induceret G2 /M anholdelse. Endvidere er de mitochondriale apoptose relaterede molekyler, såsom Bcl-2-familien proteiner, cytochrom c, caspase-2, 3 og 9, bidrog til austrobailignan-1-udløst apoptotisk celledød.

DNA topoisomerase 1 regulerer topologiske tilstand af DNA i mange cellulære processer, herunder DNA- replikation og transkription [48, 49]. Forbindelser, der inhiberer topoisomerase 1-aktivitet er ofte blevet brugt som anticancerlægemidler fordi blokering topoisomerase 1-aktivitet kan forårsage DNA-skader og initiere DNA-checkpoints, der udløser cellecyklusstandsning og efterfølgende inducere celledød [34, 50].