PLoS ONE: phospholipase C isozymerne er liberaliseret i kolorektal cancer – erfaringer fra Gene Set Berigelse Analyse af Transcriptome

Abstrakt

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindelige kræftformer i de udviklede lande. At identificere molekylære netværk og biologiske processer, der allerede er liberaliseret i CRC forhold til normal colon mucosa, vi anvendte Gene Set Berigelse Analyse til to uafhængige transkriptom datasæt, herunder i alt 137 CRC og ti normale colon mucosa prøver. Firs-to gen-sæt, som beskrevet i Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer database havde væsentligt ændret genekspression i begge datasæt. Disse omfattede netværk forbundet med celledeling, DNA vedligeholdelse og metabolisme. Blandt signalveje med kendte ændringer i vigtige gener, den “Phosphatidylinositol signalering netværk”, som omfatter en del af PI3K pathway, blev fundet dereguleret. De nedreguleret gener i denne vej omfattede flere medlemmer af Phospholipase C-proteinet familie, og reduceret ekspression af to af disse,

PLCD1

og

PLCE1

, lykkedes valideret i CRC biopsier (n = 70) og cellelinier (n = 19) ved kvantitative analyser. Undertrykkelsen af ​​begge gener blev fundet i forbindelse med

KRAS

mutationer (

P

= 0,005 og 0,006 henholdsvis), og vi observerede, at mikrosatellit stabile carcinomer med reduceret

PLCD1

udtryk oftere havde

TP53

mutationer (

P

= 0,002). Promotor methylering analyser af

PLCD1

og

PLCE1

udført i cellelinjer og tumor biopsier viste, at methylering af

PLCD1

kan bidrage til reduceret ekspression i 40% af de mikrosatellitmarkørerne ustabile carcinomer . Afslutningsvis har vi identificeret markant deregulerede veje i CRC, og valideret undertrykkelse af

PLCD1

og

PLCE1

udtryk. Dette illustrerer, at GSEA fremgangsmåde kan vejlede opdagelsen af ​​nye biomarkører i kræft

Henvisning:. Danielsen SA, Cekaite L, Agesen TH, Sveen A, Nesbakken A, Thiis-Evensen E, et al. (2011) phospholipase C isozymerne er liberaliseret i kolorektal cancer – erfaringer fra Gene Set Berigelse Analyse af Transkriptomet. PLoS ONE 6 (9): e24419. doi: 10,1371 /journal.pone.0024419

Redaktør: Baochuan Lin, Naval Research Laboratory, USA

Modtaget: Maj 20, 2011; Accepteret: August 10, 2011; Udgivet 1. september, 2011

Copyright: © 2011 Danielsen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af tilskud fra det norske Cancer Society (https://www.kreftforeningen.no/english) (RAL: nej PR-2006-0442, herunder ph.d.-stipendier til SAD og Tha, GEL:. PR-2008-0163; RIS : PR-2007-0166), af en bevilling fra forskningsrådet på Rikshospitalet-Radiumhospitalet Health Enterprise (RAL: herunder en ph.d.-stipendium til AS), af en bevilling fra det sydøstlige Norge Regional Health Authority (http: //www .helse-sorost.no /omoss /english /Sider /page.aspx) (RAL: PR-2009-093, herunder postdoc tilskud til LC), og tilskud fra det norske Foundation for Sundhed og Rehabilitering (http: //www. extrastiftelsen.no/) gennem de ekstra midler (ETE: HF-52015/002). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC, MIM # 114500) på tredjepladsen i kræfttilfælde verden med en anslået 1,2 millioner nye tilfælde om året [1]. Ifølge den amerikanske Blandede Cancer (AJCC) de 5-årige overlevelsesrater for patienter diagnosticeret med stadium I og trin IV CRC, er 93% og 8%, hvilket patient prognose er meget afhængig af den tumor scenen på diagnose [2 ]. CRC udvikler gennem distinkte histopatologiske stadier fra godartede forstadielæsioner til maligne tumorer, kendt som adenom-carcinom sekvens. Udviklingen er drevet af progressiv akkumulering af genetiske og epigenetiske ændringer af specifikke gener, og bevares signalering netværk, der udøver pleiotrope virkninger på cancerceller ofte målrettet. Typisk er maligne tumorer kendetegnet ved molekylære fænotyper mikrosatellit instabilitet (MSI), kromosomale ustabilitet (CIN), og CpG øen methylator fænotype (CIMP) [3]. De mest almindeligt ændrede gener under CRC udvikling udgør grundlaget for disse fænotyper og involvere flere signalveje og netværk (Figur 1A).

A) Vigtige gener målrettet i de forskellige CRC fænotyper under udviklingen fra prækursor læsioner til carcinomer . Gener i fed repræsenterer MAPK, PI3K, og TP53 signalering netværk og deres mutation status er tidligere blevet bestemt [38]. B) Figuren viser, hvordan en del af phosphatidylinositol netværk interagerer med den kanoniske PI3K pathway. Gener af som anvendes mutation status data for association analyser i den aktuelle papir er farvet i blå, pink og brun. Forkortelser: GPCR, G-protein-koblet receptor; RTK, receptortyrosinkinase.

Messenger RNA (mRNA) udtryk profilering undersøgelser har givet en bedre forståelse af de roller adskillige gener vigtige i initiering og progression af kræft, herunder CRC [4]. Trods stigende kendskab til ekspressionsmønstre af enkelte gener, samt lovende gen underskrifter, har mindre indsigt er opnået på ændringer af molekylære netværk og signalveje fra den store mængde af data genereret i sådanne undersøgelser. Ved anvendelse af den statistiske tilgang af Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) til genekspression data, interagerende gener, hvis ekspression niveauer er koordineret ændret kan udforskes [5]. Den GSEA metoden tager hensyn til ekspressionen af ​​alle gener i en kommenteret gen sæt /sti. Der er flere databaser og gen-sæt definitioner forbinder gener ved deres funktionelle anmærkninger. De mest udbredte er databasen Gene Ontology (GO), som er baseret på en kombination af beregningsmæssige og manuel tildeling af gener til GO vilkår [6]. Men disse vilkår ikke svarer direkte til kendte veje. Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer (Kegg) er en molekylær pathway database over manuelt kurateret og hyppigt opdaterede metaboliske, regulatoriske og signalveje [7]. Ved hjælp af denne konservativt kommenteret database, kan undgås redundans i indlejrede struktur af gen, der er repræsenteret af GO vilkår. I forhold til individuel genekspression analyser, GSEA giver indblik i de koordinerede udtryk ændringer i gener i veje, dermed ændret signalveje og gener heri ikke kendt for at være involveret i carcinogenese kunne identificeres.

Betydningen af ​​den kanoniske Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) vej i kræft er blevet etableret i talrige publikationer i det sidste årti [8]. Denne signalering netværk har virkninger på flere cancer-kritiske fænotyper, såsom celleproliferation, overlevelse, metabolisme og tumorvækst [8]. En gren af ​​netværket overlapper med Phosphatidylinositol signaleringsnetværket som medierende signaler gennem phospholipase C (PLC) proteiner (figur 1b). Dette netværk sandsynligvis crosstalks med MAPK og TP53 veje, vigtige veje i CRC udvikling. PLC protein familien omfatter tretten isozymer opdelt i seks forskellige undertyper, β, γ, δ, ε, ζ, og η, baseret på struktur og regulatoriske aktivering mekanismer. PLC isozymer indeholde flere almindelige domæner samt undertype specifikke domæner, der kan gøre dem i stand til at regulere lipase-uafhængige reaktioner [9]. Yderligere, de er opløselige og hovedsagelig lokaliseret i cytosolen, men bliver omplantes til plasmamembranen som respons på receptoraktivering [10]. På membranen de hydrolyserer phosphatidylinositol (4,5) -phosphat (PIP

2) og generere den vigtige second messenger diacylglycerol (DAG) og inositol 1,4,5-triphospate (IP

3). Ubalance af phosphoinositid niveauer (PIP

2 og PIP

3) har vist sig at fremkalde fejl i kanal aktivitet, menneskehandel, og normal cellepolaritet [9]. Således korrekt regulering af phosphoinositider ved f.eks PLC-enzymer er afgørende, og aberrerende regulering bidrager til forskellige humane lidelser, herunder cancer [9].

Ved at udforske genekspression af foruddefinerede biologiske processer og molekylære kredsløb i to CRC og normale kolonmucosa datasæt opnået ved anvendelse af forskellige microarray platforme, en liste over veje signifikant ændret ved differentiel genekspression i CRC blev identificeret. Vi valgte “Phosphatidylinositol signalering netværk” og to af de deregulerede komponenter deri,

PLCD1 Hotel (HGNC: 9060) og

PLCE1 Hotel (HGNC: 17175), for detaljerede undersøgelser og sammenlignet resultaterne med klinisk-patologiske data og mutation status af flere gener er kendt for at blive ændret i CRC.

Resultater

dereguleret Kegg veje i CRC’er

i alt 152 Kegg gen sæt var til stede i både genekspression datasæt. Fra disse, GSEA afslørede 33 signifikant opreguleret og 49 nedregulerede væsentligt biologiske processer og veje i CRC forhold til normal colon mucosa (

P

≤0.05, figur 2). Elleve væsentligt ændrede netværk havde modsatte berigelse scores mellem datasæt, mens 44 blev fundet ændret betydeligt i kun én af de datasæt. Kegg net betydeligt dereguleret i CRC forhold til normal slimhinde i begge datasæt er anført i tabel S1 (n = 82). Det faktum, at disse veje blev fundet ændret væsentligt (

P

≤0.05) i to uafhængigt analyserede datasæt, opnået fra forskellige microarray platforme, giver en risiko for kun 1/400 for hver vej, der skal indgå som ændret signifikant blot tilfældigt. Derfor er ingen yderligere korrektion for multiple test udført (dette også udgør den øvre del af tabel 1). De 82 netværk omfatter gen-apparater, der er ansvarlige for generelle kræft celle træk, forskellige metaboliske kredsløb samt mere kendte signalleringskaskader såsom TP53 og MAPK veje. Plots af genekspressionsniveauer i CRC prøver

versus

normale colon-mucosa prøver til alle gener i de tre mest opreguleret og de tre mest nedreguleret netværk i CRC er vist i fig S1, og deres statistisk differentielt udtrykte gener, er anført i tabel S2.

diagrammet viser, at resultaterne af den GSEA var meget reproducerbar med 33 og 49 veje i fællesskab op- og nedreguleres på tværs af de to datasæt henholdsvis.

Den “Phosphatidylinositol signalsystem”

“Phosphatidylinositol signalsystem” var en af ​​de molekylære veje viser sig at være nedreguleret i CRC i forhold til normal slimhinde,

dvs.

have mere nedreguleres end opreguleres gener. I alt 22/59 og 27/76 gener passerer de kvalitetskriterier var signifikant dereguleret i CRC i AB og HuEx datasæt, henholdsvis (Figur 3, tabel 1). Af de 11 gener fundet dereguleret i begge serier, bestående inositol kinaser, diacylglycerol kinaser, og phospholipaser blev to markant opreguleres, mens ni blev nedreguleret. Interessant, fandt vi fire nedreguleret lipaser (

PLCD1

,

PLCD3

,

PLCE1

, og

PLCG2) Hoteller, som blev tæt knyttet isozymer tilhører den Phospholipase C (PLC) familien af ​​proteiner.

PLCD1

og

PLCE1

, de to PLC gener i “Phosphatidylinositol signalsystemet” mest markant nedreguleret i forhold til de normale slimhinde prøver i HuEx og AB datasæt henholdsvis blev valgt til yderligere validering .

i alt 38 gener i “Phosphatidylinositol signalsystemet” blev ændret i en eller begge datasæt, blev elleve gener fundet dereguleret på tværs af begge datasæt.

Validering af

PLCD1

og

PLCE1

mRNA-ekspression

Fra kvantitativ revers transkription-PCR,

PLCD1

og

PLCE1

var klart undertrykt i kræft vævsprøver forhold til den normale mucosa (

P

= 3 × 10

-16 og

P

= 4 × 10

-15), hvilket bekræfter nedreguleringen fundet i microarray udtryk data (figur 4) . Alle de nitten analyserede tyktarmskræft cellelinjer også viste signifikant undertrykkelse af de to gener i forhold til normal slimhinde (

P

= 2 × 10

-10 og

P

= 1 × 10

-8).

De ekspressionsniveauerne af

PLCD1

og

PLCE1

i CRC og tyktarmskræft cellelinjer vurderet ved RT-PCR var signifikant nedreguleret forhold til normal colon slimhinde.

PLC

udtryk værdier forbundet til genetiske og klinisk-patologiske variabler

Interessant, var der stærke sammenhænge mellem lav udtryk for både

PLCD1

og

PLCE1

KRAS

mutationer i CRC prøver (Tabel 2). Desuden reducerede ekspressionsniveauer af

PLCD1

var signifikant associeret med

TP53

mutationer og MSS fænotype. For begge PLC-gener, blev ekspressionsniveauerne reduceret i mere fremskreden sygdom stadier. Expression værdier af

PLCE1

blev nedsat i fase II (

P

= 0,06) og faldt betydeligt i fase III tumorer (

P

= 0,005) sammenlignet med iscenesætte jeg tumorer . Dette var imidlertid ikke tilfældet for fjernt metastatisk sygdom (stadie IV). Samme tendens blev også set for

PLCD1

, hvor ekspressionsniveauerne blev reduceret betydeligt i fase III i forhold til trin I (

P

= 0,03). Ingen foreninger blev fundet mellem

PLCD1

og

PLCE1

udtryk og mutationer i

BRAF

,

PIK3CA

, eller

PTEN

. For tabel 2 skal det bemærkes, at på grund af gentagen afprøvning (n = 16), er der en risiko for falsk signifikante sammenhænge.

Promoter methylering analyse af

PLCD1

og

PLCE1

PLCD1

og

PLCE1

kunne være mål for promotor methylering da deres udtryk var lavt i CRC sammenlignet med normale colon mucosa prøver. Begge gener besidder CpG øer i deres initiativtagere og deres udtryk blev opreguleret i cellelinjer behandlet med epigenetiske reaktiverende stoffer (5-aza-2′-deoxycytidin, AZA og Trichostatin A, TSA). Hel eller delvis methylering af

PLCD1

promotor blev fundet i 79% (15/19) af tyktarmskræft cellelinjer, opdaget af såvel kvalitative som kvantitative methylering-specifik polymerasekædereaktion (MSP og qMSP henholdsvis ). De resterende fire cellelinier var helt methyleret. status methylering af tyktarmskræft cellelinjer blev bekræftet ved bisulfit sekventering under anvendelse af to ikke-overlappende sæt af primerpar helt dækker 69 CpG sites. Der var ingen sammenhæng mellem methylering og MSI-status cellelinjer. For primære carcinomer, kun ni ud af 70 (13%) prøver blev methyleret, som vurderet af MSP og qMSP. Størstedelen af ​​tumorerne betragtet som positive for methylering viste lave PMR-værdier (median 5,69). Interessant, otte af de ni methylerede tumorer var MSI, hvilket gav en methylering frekvens på 40% (8/20) i denne undergruppe. Desuden er alle de methylerede MSI tumorerne havde mutationer i

BRAF

, mens methylerede MSS tumor var vildtype. For

PLCE1

kun én af 19 tyktarmskræft cellelinjer viste promotor methylering. Dette blev bekræftet af bisulfit sekventering dækker 47 CpG sites. På grund af den lave

PLCE1

promotor methylering frekvens blandt cellelinjer, vævsprøver blev ikke udsat for methylering analyser.

Diskussion

Ved at udforske genekspression inden for fastlagte molekylære veje i to uafhængige CRC transkriptom datasæt, har vi identificeret en række molekylære netværk og komponenter deri, der er liberaliseret i CRC og kan bidrage til carcinogenese.

“Cell cyklus” blev ikke overraskende den mest omfattende ændret gen sat i vores analyser. Dens ordentlig regulering er afgørende for at sikre korrekt overførsel af genetisk information fra den ene generation til den næste, således deregulering af flere cellecyklus komponenter er defineret som kræft kendetegnende. Vores konklusion er i tråd med flere sammenlignelige studier af CRC, hvor gen-sæt udelukkende begrænset til kræftrelaterede veje [11] og flere online-databaser omfatter mere generelle veje, er blevet udforsket [12] – [14]. CRCs viste ekspressionsniveauer ændringer i talrige metaboliske veje,

dvs.

“oxidative fosforylering” var den mest signifikant nedreguleret metabolisk netværk over begge datasæt, hvorimod metabolisme af puriner, pyrimidiner, og N-glycaner, ud over den “pentosephosphat sti “blev opreguleret. Purin- og pyrimidin metabolismen var nyligt fundet at også opreguleret i adenomer sammenlignet med normal slimhinde, hvilket indikerer, at ændringer i disse netværk er tidlige hændelser i tumorigenese [14]. Omprogrammering af energistofskiftet blev for nylig lanceret som en ny kendetegnende for kræft, og resultaterne er også i overensstemmelse med, hvad Otto Warburg beskrev et halvt århundrede siden, benævnt “Warburg effekten”. Han identificerede et skift i glukosemetabolismen fra oxidativ fosforylering til aerob glykolyse i tumorceller [15]. Begrænsning metabolisme overvejende til glycolyse tillader omdannelse af glycolytiske mellemprodukter i nukleosider og aminosyrer. Dette igen letter biosyntesen af ​​makromolekyler og organeller kræves til forøget produktion af nye celler. Der blev også fundet biologiske processer, der involverer DNA-replikation og forskellige former af DNA-reparationsmekanismer dereguleret i vores datasæt. Disse grundlæggende systemer er ofte sat ud af spillet ikke kun i cancer, men også i andre sygdomme og syndromer, hvilket understreger alvoren af ​​ikke at kunne kopiere DNA- eller reparation fejl på den rigtige måde.

Udover mere generelle kræft celle træk, centrale kredsløb i CRC ligesom MAPK-, TP53-, og Phosphatidylinositol signalsystemer, hvor normalt en eller nogle få prominente spillere er indberettet som ofte ændres på DNA-niveau (på grund af punktmutationer, opformeringer, og /eller sletninger, [8], [16]), blev fundet signifikant dereguleret i vores analyser. Dette indebærer, at ændret genekspression af adskillige mindre “berømte” medlemmer i pathways bidrager også i colorektal carcinogenese. I denne undersøgelse observerede vi, at gener som

PIK3CA

PTEN

blev udtrykt i tumorprøver, men ikke på væsentligt forskellige niveauer fra normal colon væv i begge datasæt. Vi og andre har vist, at disse gener ofte lider af ændringer på DNA- eller proteinniveauer snarere end af ændringer i mRNA-ekspression [8], [17] – [19]

For at afsløre yderligere gener i. den “Phosphatidylinositol signalsystem” involveret i tumorigenese, vi udforskede ekspressionsniveauet af alle dens komponenter som kommenteret i Kegg. Begge inositol phosphataser, diacylglycerol kinaser og phospholipaser viste sig at have ændret ekspression. Blandt phospholipaseenzymer blev medlemmer af Phospholipase C familien godt repræsenteret, hvilket indikerer en vigtig rolle for denne familie i CRC. Dette blev understreget af RT-PCR-analyser validering at ekspressionsniveauerne af

PLCD1

og

PLCE1

blev udførligt nedreguleret i CRC forhold til normal colon mucosa. Undertrykkelsen af ​​

PLCD1

er i overensstemmelse med de præsenteret af Nomoto resultater og kolleger i 1995, hvor de rapporterer detekterbare niveauer af PLCD1 protein i otte tyktarmskræft cellelinjer og nedsatte niveauer i tolv af tretten tyktarmskarcinomer sammenlignet med deres parret normal slimhinde prøven [20]. Adskillige grupper har foreslået en rolle for PLCD1 i regulering af cellecyklus G

1 /S-kontrolpunkt, er imidlertid der modstridende resultater om, hvorvidt den har en onkogen eller tumor-undertrykkende funktion [21] – [23]. Baseret på de nuværende resultater, foreslår vi sidstnævnte funktion

PLCD1

i CRC. Lignende resultater er også blevet rapporteret for esophageal planocellulært karcinom (ESCC), gastrisk og brystkræft [21], [24] – [26]. Interessant, lav ekspressionsniveauerne af

PLCD1

var stærkt forbundet med mutationer i

TP53

KRAS

samt tumorer i MSS fænotype; selvom den biologiske betydning af disse foreninger er endnu ikke fastslået.

Den observerede undertrykkelse af

PLCE1

, det andet gen undersøgt i detaljer, er støttet af resultaterne fra Sorli

et al

. der også demonstreret signifikant reducerede mRNA ekspressionsniveauer i tyktarm og endetarm kræft prøver og tyktarmskræft cellelinjer, samt af Wang og kolleger, der rapporteres en frekvens på 36% tab af heterozygositet (LOH) af 10q23 hvor

PLCE1

ligger og nedregulering af PLCE1 i 21/50 kolorektal cancer prøver sammenlignet med matchede normale væv [27] – [29]. Desuden har vi observeret, at ekspressionsniveauerne af

PLCE1

var faldende med mere avancerede stadier, hvilket indikerer, at undertrykkelsen af ​​dette gen er til gavn for kræft progression. Især synes det niveau til at stige, da den nåede metastatisk sygdom (stadie IV), et fænomen, der tidligere er beskrevet for

PLCD1

og

PLCD3

i brystkræft [24]. Ikke desto mindre bør der udvises forsigtighed foretages ved fortolkning af resultaterne for den nuværende fase IV-gruppe, som kun syv tumorer er inkluderet. Ekspressionsniveauerne af

PLCD1

og

PLCE1

var korreleret, og som forventet, blev reduceret ekspression af begge gener associeret til mere avancerede tumor stadier (data ikke vist). Imidlertid blev de individuelle ekspressionsniveauer og ekspressionsniveauerne af begge gener kombineret ikke forbundet med patientens overlevelse (data ikke vist). Interessant, som for

PLCD1

, lav udtryk for

PLCE1

var stærkt associeret med mutationer i

KRAS

. Da PLCE1 viser sig at være både en opstrøms og nedstrøms effektor af Ras familie proteiner [30], korrelationen af ​​muterede

KRAS

med de reducerede ekspressionsniveauer sandsynligvis spiller en kritisk rolle i CRC tumorigenese. Endvidere blev det for nylig rapporteret, at overekspression af PLCE1 i en coloncancercellelinie inhiberede tumorcelleproliferation, reduceret antal kolonier dannet, reduceres migration og øget apoptose [29], hvilket tyder på en tumor undertrykkende rolle for dette gen i CRC.

Vi undersøgte derefter, om de reducerede ekspressionsniveauerne af

PLCD1

og

PLCE1

kunne skyldes promotor hypermethylering. Dette er en almindelig måde at inaktivere tumorsuppressorgener, og begge phopholipases er blevet fremsat som kandidater til promotor hypermethylering [27]. Men dette har indtil videre kun blevet bekræftet i

PLCD1

inden for et interval på 52-62% methylering i ESCC, gastrisk og brystkræft [21], [25], [26]. Vores resultater fra qMSP og bisulfit sekventering kan ikke bekræfte

PLCE1

som mål for denne type af epigenetisk inaktivering, og på trods af høj frekvens af methylering i tyktarmskræft cellelinjer, methylering i

PLCD1

promotor kan kun forklare reduceret udtryk i en undergruppe af karcinomer. Interessant dog, opdagede vi, at alle undtagen en af ​​de methylerede tumorer var MSI, hvilket gav en methylering frekvens på næsten fyrre procent blandt carcinomer med defekt mismatch reparation. Derudover blev de methylerede MSI tumorer lokaliseret i højre side af tarmen og havde

BRAF

mutation, i tråd med CIMP fænotype [3].

Ved at underkaste to CRC transkriptom datasæt til GSEA vi har identificeret en række statistisk signifikante deregulerede gen sæt i CRC, og vist, at denne metode kan vejlede opdagelsen af ​​nye molekylære mål og biomarkører for kræft. Verifikation analyser af udvalgte gener inden for et af de identificerede liberaliserede signalveje,

PLCD1

og

PLCE1

bekræftede reducerede niveauer af disse udskrifter i CRC sammenlignet med normale slimhinde prøver. Både en tumor undertrykkende og tumorfremmende rolle af disse gener og proteinprodukter er blevet foreslået i forbindelse med udvikling af cancer, afhængigt af væv af oprindelse [9]. De nuværende data understøtter en svulst undertrykkende rolle

PLCD1

og

PLCE1

i CRC, som for

PLCD1

muligvis kan forklares ved en epigenetisk mekanisme i mikrosatellitmarkørerne ustabile karcinomer.

Materialer og metoder

Etik erklæring

blev opnået skriftligt informeret samtykke fra alle fag indgår. Alle prøver blev hentet fra forskning biobanker som en del af forskningsprojekter, der er godkendt i henhold til nationale etiske retningslinjer. Biobanken serien er blevet registreret i henhold til national lovgivning og er godkendt af det regionale udvalg for Medical Research Ethics (REK sydøstlige S-09282c2009 /4958, Biobank 2781; REK Syd: 2003, S-02.126, Biobank 296-2005-174211 ).

transkriptom datasæt

To uafhængige kolorektal væv transkriptom profilering datasæt tidligere genereret i vores laboratorium blev anvendt til dette GSEA undersøgelse [31], [32]. De rå data er tilgængelige via NCBI s Gene Expression Omnibus offentlig opbevaringssted for microarray data (tal tiltrædelse GSE25071 og GSE24550). Den første datasæt omfatter genekspression profiler fra 46 CRC’er og fire normale colon mucosa prøver opnået ved hjælp af Applied Biosystems 1700 platform (Applied Biosystems af Life Technologies, Foster City, CA, USA; AB) [31]. Den anden genekspression datasæt indeholder 91 CRCs og seks normale colon-mucosa prøver genereret med Affymetrix GeneChip Humant Exon 1.0 ST arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA; HuEx) [32]. Der var ingen overlappende prøver mellem de to microarray datasæt. Et resumé af de kliniske data for patienter inkluderet i datasæt kan findes i tabel S3.

Vævsprøver og kræft cellelinjer

Patienten prøver indgår i mål verifikation analyser udgjorde en delmængde af tumorer anvendes i HuEx datasæt (n = 70) og 17 normale kolonmucosa prøver (herunder seks fra HuEx datasæt). Alle prøver blev taget fra patienter, der gennemgår primær operation for CRC i Oslo Universitetssygehus, Aker, Oslo, mellem 2005 og 2008. De normale colon mucosa prøver blev taget fra sygdomsfrie områder i resektionsranden af ​​CRC prøver (≥10 cm fra tumoren). En klinisk-patologisk beskrivelse kan findes i tabel S4.

Nineteen tyktarmskræft cellelinjer (Co115, Colo320, EB, FRI, HCT15, HCT116, HT29, IS1, IS2, IS3, LoVo, LS1034, LS174T, RKO, SW48, SW480, TC7, TC71, og V9P) blev inkluderet i undersøgelsen, og er grundigt beskrevet i [33]. Disse blev dyrket under standardbetingelser som vil blive givet efter anmodning. Seks af de cellelinier (HCT15, RKO, SW48, HT29, LS1034, og SW480) blev underkastet epigenetisk behandling under anvendelse af demethyleringsmiddel lægemiddel AZA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; 1 uM i 72 timer), den histondeacetylaseinhibitor TSA (Sigma-Aldrich, 0,5 uM i 12 timer), og en kombination af begge lægemidler (1 pM AZA i 72 timer og 0,5 uM TSA tilføjet de sidste 12 timer). Parallelt hermed de samme cellelinjer blev dyrket uden behandling i 72 timer. Alle kommercielt tilgængelige cellelinjer blev autentificeret ved hjælp AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems).

Isolering af nukleinsyrer

DNA fra frisk-frosne colon væv og tyktarmskræft cellelinjer blev ekstraheret ved et standard phenol /chloroform-protokollen. RNA fra tumorvæv blev ekstraheret under anvendelse af Qiagen AllPrep DNA /RNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland), hvorimod RNA fra normale kolonmucosa prøver og tyktarmskræft cellelinjer blev isoleret ved Ambion RiboPure ™ Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) og Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), hhv. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med fabrikanternes protokoller.

Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)

For GSEA gen sæt blev defineret i henhold til Kegg pathway samling (Homo sapiens (menneske) Slip 53,0 ) [7]. Analysen blev udført ved hjælp GSEABase pakke i BioConductor /R-version 2.9.2 [34]. De to microarray genekspression datasæt af CRC

versus

normal colon mucosa blev uafhængigt underkastet GSEA. Data forbehandling blev udført som tidligere beskrevet [31], [32]. Interkvartile område (IQR) blev anvendt som et mål for variabilitet. Gener med IQR 0,5, blev udelukket fra yderligere analyser med GSEA. For gener målrettet af flere udskrift klynger (HuEx) eller sonder (AB), blev journalist med største variabilitet brugt. Gener ikke tildelt nogen Kegg veje blev også udelukket fra analysen. I alt 3.361 og 4.797 gener med en kommenteret rolle i 205 og 220 Kegg pathways blev vurderet for AB og HuEx datasæt hhv. Veje, der omfattede mindre end 10 kommenterede gener blev fjernet fra yderligere analyse, hvorefter 167 og 185 veje i de respektive datasæt. Tosidet blev to-klasse t-tests under forudsætning ens varianser tværs CRC og normale prøver udført for alle inkluderet gener. Et gen sæt berigelse score blev beregnet som summen af ​​observerede t-statistik for generne i sættet, divideret med kvadratroden af ​​antallet af gener i sættet. Gene sæt

P

-værdier blev beregnet på grundlag af vektor af sandsynlighederne for de t-statistik på tværs af de omfattede gener [35].

Validering af PLCD1 og PLCE1 ekspressionsniveauerne ved kvantitativ Reverse Transcription- PCR

Total RNA fra CRC væv og normale mucosa prøver blev omdannet til cDNA ved hjælp af High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). CDNA af to endogene kontrol,

ACTB

(Hs99999903_m1) og

GUSB

(Hs99999908_m1), samt cDNA af generne

PLCD1

(Hs00979908_m1) og

PLCE1

(Hs00275279_m1) blev amplificeret separat i 384 brønds-plader som beskrevet af producenten (Applied Biosystems). Genekspression blev målt i realtid ved hjælp af 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Prøverne blev analyseret i triplikater og medianværdien blev anvendt til dataanalyse. En seriefortynding af cDNA fra universelle menneskelige reference-RNA (Agilent, Santa Clara, CA, USA) blev anvendt til at danne standardkurven. Ekspressionsniveauerne af

PLCD1

og

PLCE1

var normaliseret mod middelværdien af ​​de endogene kontrol.

bisulfitbehandling og promotor methylering assay design

Før til kvalitativ og kvantitativ MSP og bisulfit sekventering, 1,3 ug DNA fra hver prøve blev natriumbisulfit behandlet ved anvendelse af Epitect bisulfit Kit (Qiagen) ifølge producentens protokol. F, kvinde;