PLoS ONE: DNA-skader og reparation Biomarkører i livmoderhalskræft patienter behandlet med Neoadjuverende Kemoterapi: en sonderende Analysis

Abstrakt

livmoderhalskræft celler almindeligt huser en defekt G

1 /S checkpoint på grund af samspillet mellem virale oncoproteiner med p53 og retinoblastoma protein. Aktiveringen af ​​G

2 /M checkpoint kan således blive afgørende for at beskytte kræftceller fra genotoksiske fornærmelser, såsom kemoterapi. I 52 cervikale kræftpatienter behandlet med neoadjuverende kemoterapi, undersøgte vi, om niveauerne af phosphoryleret Wee1 (pWee1), en nøgle G

2 /M checkpoint kinase, og γ-H2AX, en markør for DNA dobbelt-strengbrud, diskriminerede mellem patienter med en patologisk komplet respons (pCR) og dem med residual sygdom. Vi testede også sammenhængen mellem pWee1 og phosphoryleret Chk1 (pChk1), en kinase handler opstrøms Wee1 i G

2 /M checkpoint pathway. pWee1, γ-H2AX og pChk1 blev retrospektivt vurderet i diagnostiske biopsier ved immunhistokemi. De grader af pWee1 og pChk1 udtryk blev defineret ved hjælp af tre forskellige metoder for klassificering, dvs. farvningsintensitet, Allred score, og en multiplikativ score. y-H2AX blev analyseret både som kontinuerlig og kategorisk variabel. Uanset den benyttede klassificering blev forhøjede niveauer af pWee1 og γ-H2AX signifikant associeret med en lavere PCR. I univariate og multivariate analyser, pWee1 og γ-H2AX var forbundet med reduceret PCR. Intern validering udført gennem en re-sampling uden udskiftning procedure bekræftede robustheden af ​​den flerdimensionale model. Endelig fandt vi en signifikant sammenhæng mellem pWee1 og pChk1. Det budskab, som nærværende analyse er, at biomarkører for DNA-skader og reparation kan forudsige effekten af ​​neoadjuverende kemoterapi i livmoderhalskræft. Yderligere undersøgelser er berettiget til fremadrettet validere disse opmuntrende resultater

Henvisning:. Vici P, Buglioni S, Sergi D, Pizzuti L, Di Lauro L, Antoniani B, et al. (2016) DNA-skader og reparation Biomarkører i livmoderhalskræft Patienter behandlet med Neoadjuverende kemoterapi: en eksplorativ analyse. PLoS ONE 11 (3): e0149872. doi: 10,1371 /journal.pone.0149872

Redaktør: Yanchang Wang, Florida State University, USA

Modtaget: December 3, 2015; Accepteret: 7 februar 2016; Udgivet: 1. marts 2016

Copyright: © 2016 Vici et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser : ATM, ataksi-telangiectasia muteret; ATR, ataksi telangiectasia og Rad3-relateret protein; Chk1, Checkpoint kinase 1; Chk2, Checkpoint kinase 2; DDR, DNA skade responset; DSB, dobbelt-streng brud; PCR, patologisk komplet respons; pChk1, hosphorylated Chk1; y-H2AX, phosphoryleret H2A histon familiemedlem X; pRb, retinoblastoma protein; pWee1, phosphoryleret Wee1; Wee1, Wee1-lignende protein kinase

Introduktion

eukaryote celler er konstant udsat for endogene og eksogene kilder til DNA-skader. Transmissionen af ​​ubeskadiget DNA til afkommet er sikret ved en kompleks molekylær netværk, DNA skade responset (DDR), der opererer gennem koordineret aktivitet af cellecyklus checkpoints, DNA reparationsmekanismer og apoptotiske veje [1, 2]. Tilstedeværelsen af ​​genetiske læsioner udløser checkpoint-medieret standsning af cellecyklussen [2]. Denne begivenhed giver DNA-reparationsprocesser effektorer og apoptotiske veje til at reparere læsionen eller eliminere uopretteligt beskadigede celler.

cancercellerne aberrerende bruge DNA reparationsmekanismer at overleve stressende betingelser, såsom udsættelse for kemoterapi [2]. Et fælles træk for en række tumorer er defekte karakter af G

1 /S-fasen checkpoint, der hidrører fra mutations eller funktionel inaktivering af p53 eller retinoblastom-protein (pRb) [3]. Når dette sker, kræftceller bliver meget afhængig af G

2 /M checkpoint for cellecyklusstop og DNA-reparation [3]. Den ataksi telangiectasia og Rad3-relateret protein (ATR) -Checkpoint kinase 1 (Chk1) -Wee1-lignende protein kinase (Wee1) kaskade repræsenterer kernen i G

2 /M checkpoint, hvis aktivering fører til inhibering af cyclin-afhængig kinase 1 og kulminerer i checkpoint-medieret cellecyklusstandsning [3]. På en sådan måde, kræftceller har tid til at rette kemoterapi-induceret DNA-læsioner, undgå indrejse i en dødelig mitose kendt som mitotisk katastrofe [4]. G

2 /M checkpoint afhængighed i en p53-defekt molekylære baggrund er et koncept i øjeblikket udnyttet for den kliniske udvikling af syntetiske letalitet-baserede lægemidler. Når G

1 /S-fasen checkpoint-defekte celler udsættes for kemoterapeutika, samtidig farmakologisk inhibering af G

2 /M checkpoint-kinaser er skadelig for celle fitness [3].

Vi begrundede at G

2 /M checkpoint “afhængighed” for at kompensere p53 eller pRb defekter ved udsættelse for genotoksiske midler kan udnyttes i søgningen efter forudsigende biomarkører som skal indeholde kemoterapi følsomhed /resistens. I denne eksplorativ analyse vi fokuseret på livmoderhalskræft, prototypen på p53 og pRb-defekte tumorer. Faktisk human papillomavirus E6 og E7 oncoproteiner fremme ubiquitinmedieret nedbrydning af p53 og pRb henholdsvis [5]. Vi derfor retrospektivt undersøgt sammenhængen mellem niveauerne af DNA skader og reparation biomarkører, vurderet i biopsi prøver indsamlet fra ubehandlede patienter på tidspunktet for diagnosen, og patologisk komplet respons (PCR) efter neoadjuverende kemoterapi, dvs. kemoterapi leveres i tidsrammen mellem diagnostiske biopsi og kirurgisk resektion. Alle patienter blev homogent behandlet med paclitaxel, ifosfamid og cisplatin (TIP regime). Vi fokuserede på phosphoryleret Wee1 (pWee1) som en proxy af G

2 /M checkpoint aktivering, og phosphoryleret H2A histon familiemedlem X (γ-H2AX) som en markør af DNA dobbelt-streng pauser. Phosphoryleret Chk1 (pChk1) blev testet i en brøkdel af prøver til en signalering undersøgelse.

Materialer og metoder

Undersøgelse Deltagere og procedurer

Fifty-to histologisk bekræftede livmoderhalskræft kræftpatienter (fase Ib2-IIIa), som fik neoadjuverende kemoterapi blev inkluderet i denne retrospektive analyse. Alle patienter blev behandlet med den TIP regime (paclitaxel 175 mg /m

2 på dag 1 + ifosfamid 2500 mg /m

2 på dag 1 og 2 + cisplatin 50 mg /m

2 på dag 2 hver 21 dage for tre eller fire cyklusser) efterfulgt af radikal kirurgi. Patienter blev anset støtteberettigede, hvis de afsluttede den planlagte behandling, data om kliniske funktioner og behandlingsresultater var til rådighed, og mængden af ​​biologiske materialer i deres biopsier var tilstrækkeligt for molekylære analyser. PCR blev defineret som ingen residual sygdom i kirurgiske prøver. Den immunhistokemiske vurdering af pWee1, γ-H2AX, og pChk1 blev udført i formalin-fikserede paraffin-indstøbt (FFPE) væv, fremstillet af de biologiske prøver indsamlet via biopsi procedurer i ubehandlede patienter, ved hjælp af følgende antistoffer: anti-phospho-H2AX ( Ser139) (klon JBW301) monoklonalt museantistof (mAb) (Upstate, NY, USA) ved en fortynding på 1: 500, anti-phospho-Wee1 (Ser642) (klon D47G5) kanin MAb (Cell Signaling, Danvers, MA, USA ) ved fortynding på 1: 100, og anti-phospho-Chk1 (Ser345) (klon 133D3) kanin MAb (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) ved en fortynding på 1: 100. Immunohistokemisk farvning blev udført i en automatiseret autostaineren (BOND-III, Leica, Milano, Italien) ved en biotin-fri polymer peberrodsperoxidase (HRP) linker antistofkonjugat-system (Leica, Milano, Italien). For hver tumor blev tre forskellige, 3 um paraffinsnit analyseret og undersøgt ved lysmikroskopi. Immunreaktion af tumorceller blev talt i fire high-power felter (400x forstørrelse) per sektion. pWee1 og pChk1 blev betragtet som positive, når ≥10% af de neoplastiske celler viste en distinkt nuklear immunreaktivitet. pWee1 og pChk1 blev gradueret på en fire-trinsskala baseret på farvning intensitet (0: negativ, 1+: svag, 2+: moderat, 3+: stærk). Tumorer blev klassificeret som negativ (0 = pWee1

neg og pChk1

neg) eller positiv (1-3 = pWee1

pos og pChk1

pos) .Den Allred scoringer blev opnået som tidligere beskrevet [6 ], overvejer farvning intensitet og procentdelen af ​​tumor-udtrykkende celler, og oplyses efter en skala fra 0 til 8. Tumorer blev klassificeret som lav udtrykke hvis Allred score var ≤ 2 (pWee1

Allred lav, pChk1

Allred lav), eller så højt udtrykkende hvis Allred nu var 2 (pWee1

Allred høj, pChk1

Allred høj). De multiplikative scoringer blev opnået ved at multiplicere farvningsintensitet x procentdelen af ​​tumor-udtrykkende celler, og blev udtrykt på en skala fra 0 til 300. Tumorer blev klassificeret som lav ekspression (pWee1

multi lav og pChk1

multi lav) eller høj udtrykke (pWee1

multi høj og pChk1

multi høj) ved hjælp af median score på alle tumorer som en cut-off point. γ-H2AX ekspression blev betragtet som den procentdel af tumor-udtrykkende celler og analyseret både som kontinuerlig (γ-H2AX

cont) og som kategorisk variabel, hvis modalitet blev defineret under anvendelse af median score på alle tumorer (γ-H2AX

lav og γ-H2AX

høj). Tumor prøver blev evalueret uafhængigt af to efterforskere (SB og MC), der var blindet til behandlingsresultater, og disharmoniske sager blev anmeldt (MM). Denne retrospektive undersøgelse blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og blev godkendt af Etik udvalg af “Regina Elena” National Cancer Institute i Rom, den koordinerende center. Skriftlige informerede samtykke var sikret før kemoterapi.

Statistisk analyse

kræft- og patientrelaterede funktioner blev deskriptivt karakteriseret for alle de patienter, der indgår i nærværende analyse. Medianer og intervaller blev brugt til at rapportere om kontinuerte variabler, mens kategoriske variabler blev udtrykt af frekvenser og procentvise værdier. For at vurdere forholdet mellem kategoriske variable den Pearsons chi-square test for uafhængighed (2-halet) og Fisher Exact test var ansat. Brugen af ​​univariate logistiske regressionsmodeller hjalp identificere variabler potentielt påvirker behandlingsresultater. Multivariate logistiske regressions modeller blev bygget af herunder variabler teste signifikant på univariate vurdering eller identificeret på grundlag af kliniske plausibilitet af deres rolle i at påvirke PCR. For at estimere risikoen for en overfitted multivariat model og undersøge dens stabilitet, blev en intern validering udføres ved hjælp af en re-sampling procedure uden erstatning. Til dette formål blev et hundrede datasæt genereres af tilfældigt fjerne ca. 20% af den oprindelige prøve. For hver simulering, vi gentog multivariat logistisk regressionsmodel og Cohens Kappa koefficient, den positive prædiktive værdi (PPV), den Negativ prædiktiv værdi (NPV), Sensibility og specificitet blev beregnet. Vi betragtet som statistisk signifikante p-værdier mindre end 0,05. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS software (SPSS-version 21, SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Resultater

Baseline karakteristika for de 52 patienter inkluderet i denne undersøgelse er sammenfattet i tabel 1. Median tid mellem diagnostisk biopsi og radikal kirurgi var 4,99 måneder [IQ Range: 4,01-5,83]. Alle præ-kemoterapi prøver, der består i diagnostiske biopsier, blev undersøgt for pWee1 og γ-H2AX, mens pChk1 data var tilgængelige for 37 prøver. Median procentdele af nukleare udtrykker celler til pWee1, pChk1 og γ-H2AX var 40% (min /max 10/80), 30% (min /max 10/80) og 30% (min /max 0/80), henholdsvis . Repræsentative immunohistokemisk farvning mønstre er vist i fig 1. Som vist i tabel 2, fandt vi en statistisk signifikant sammenhæng mellem forhøjede nuklear pWee1 ekspression og reduceret pCR sats. Foreningen testet betydelige for alle de scoring metoder undersøgt (pWee1

pos vs pWee1

neg, p = 0,016; pWee1

Allred høj vs pWee1

Allred lav, p = 0,016; pWee1

multi høj vs pWee1

multi lav, p = 0,034) (tabel 2). Ligeledes blev forhøjede nukleare niveauer af γ-H2AX forbundet med reduceret pCR sats, både når de betragtes som kategorisk og kontinuerlig variabel (p = 0,037 og p = 0,026 i tabel 2 og figur 2, henholdsvis). Når man overvejer at kombinationen af ​​de to markører, kun 1 patient ud af 16 med dobbelt positive tumorer oplevede en PCR, 9 ud af 16 patienter med dobbelte negative tumorer opnår en PCR, og en mellemliggende resultat sås hos patienter, hvis tumorer udtrykte kun en biomarkør (p = 0,009) (tabel 3). Seks ud af 8 dødsfald blev observeret i dobbelt positive tumorer (p = 0,013) (tabel 3). I univariate logistiske regressionsmodel blev pWee1 og γ-H2AX direkte forbundet med PCR (pWee1

pos vs pWee1

neg: Odds Ratio (OR) 5,31, 95% konfidensinterval (CI): 1,42 til 19,87, p = 0,013; y-H2AX

høj vs γ-H2AX

lav: OR 4,20, 95% CI: 1,13-15,59, p = 0,032, henholdsvis) (tabel 4); den flerdimensionale model bekræftede den prædiktive rolle pWee1 og γ-H2AX (tabel 4). Den interne validering udføres gennem en procedure re-sampling bekræftede robustheden af ​​den flerdimensionale model. Overensstemmelse, Positiv prædiktiv værdi, Negativ prædiktiv værdi, følsomhed og specificitet er vist i tabel 5. Endelig når han undersøger co-ekspressionsmønstre, vi ikke observere nogen sammenhæng mellem pWee1 og γ-H2AX (data til rådighed efter anmodning), mens en statistisk signifikant sammenhæng blev rapporteret mellem pWee1 og pChk1 (figur 3).

Tre på hinanden følgende sektioner for hver tumor er vist. (AC) En tredobbelt positiv tumor med nuklear γ-H2AX (A), pWee1 (B) og pChk1 (C) immunoreaktivitet. (DF) En tumor, der ikke udtrykte γ-H2AX (D), og at co-udtrykte pWee1 ( E) og pChk1 (F). (GI) En tumor, der udtrykker nukleare γ-H2AX (G), der manglede både pWee1 (H) og pChk1 (I) udtryk

I figuren:. Den øverste vandrette linje af boksen er den 75. percentilen; den nederste vandrette linje af kassen er den 25. percentil; den vandrette bjælke i boks er medianværdien; den øverste vandrette bjælke uden for boksen er den maksimale værdi; den nederste vandrette bjælke uden for boksen er de minimumsværdier.

(A) Association ifølge farvning intensitet-baseret klassifikation (positiv vs negativ). (B) Association ifølge Allred score klassificering (høj vs lav). (C) Association ifølge en multiplikativ score klassifikation (høj vs lav).

Vejviser

Et hundrede mindre-drevne simulation datasæt blev genereret, hver ca. 80 % af den oprindelige størrelse.

diskussion

i den foreliggende undersøgelse, vi efterfølgende udforsket prædiktive betydning pWee1 og γ-H2AX udtryk evalueres i diagnostiske biopsier relateret 52 livmoderhalskræft patienter, der modtaget neoadjuverende kemoterapi. Vi undersøgte også sammenhængen mellem pWee1 og pChk1 for at give et fingerpeg om, hvorvidt Wee1 aktivering i livmoderhalskræft er medieret af Chk1. Til vores viden, dette er den første undersøgelse rapportering om DNA skader og reparation biomarkører i livmoderhalskræft, der udnyttede begrebet defekte karakter af G

1 /S-fasen checkpoint. Samlet set har vi observeret en statistisk signifikant sammenhæng mellem forhøjet udtryk for pWee1 og γ-H2AX og nedsat PCR. Således har vi forudsat første antydninger at den forhøjede udtryk for DDR biomarkører i diagnostiske prøver kan være forbundet med suboptimal effekt af kemoterapi, evalueret gennem pCR i kirurgisk resektion tumorer. Vi observerede også en positiv sammenhæng mellem pWee1 og pChk1 udtryk, der antyder effektiv G

2 /M checkpoint aktivering. Vi er klar over, at vores resultater er hypotese-generering i naturen givet retrospektive design af undersøgelsen. . Ikke desto mindre, ud over den ligefremme analytiske tilgang, vores undersøgelse har nogle vigtige styrker

For det første neoadjuverende indstilling tilbyder flere fordele for identifikation og udvikling af kræft biomarkører: i) en analyse af potentielle markører i en molekylær baggrund ikke “forurenet” af eksponeringen af ​​tidligere kræftmidler, ii) identifikation af prædiktive markører for at vælge patienter, der vil mere sandsynligt gavn af kemoterapi, iii) identifikation af biomarkører, der også holder prognostisk betydning, selvom beviser på sammenhængen mellem pCR og langsigtede overlevelse resultater i livmoderhalskræft er ikke så robust som den er i brystkræft [7, 8].

for det andet, indtil videre, i livmoderhalskræft søgen efter forudsigende biomarkører i forbindelse med den øgede evne kræft celler til at beskytte deres genom når udfordret med kemoterapi eller strålebehandling er udelukkende fokuseret på nukleotid excision reparation (NER) proteiner, og især om excision reparation cross-komplementering GROUP1 (ERCC1) protein [9-13]. NER er deputed at korrigere voluminøse helix-fordreje læsioner, såsom dem påført DNA’et ved platinbaseret terapi. Men inden for rammerne af DDR, NER er en af ​​de mange distale effektorer tildelt opretholde genom integritet. En række molekylære netværk beskytte genomet, omend deres engagement afhænger af typen af ​​læsion. DNA reparation veje også bunden excision reparation (BER), mismatch repair (MMR), direkte reparation, og dobbelt-strenget pause (DSB) rekombinatorisk reparation. Sidstnævnte omfatter fejlfri homolog rekombination reparation (HRR) og fejlbehæftede non-homolog endesammenbinding (NHEJ) [1]. Derfor kan niveauet for biologiske kompleksitet DDR undervurderes, når udelukkende overvejer en, eller få, komponenter sammenstillede i en bestemt reparation netværk. Desuden blev bekymringer rejst på pålideligheden, og biologisk betydning af ERCC1 påvisningsmetoder [14, 15]. Omvendt vores undersøgelse med fokus på master-DDR komponenter, hvis aktivering er kendt for at være særlig effektiv i livmoderhalskræft.

Dernæst vi hypotese, at endogene niveauer af DNA-skader, spejlet af γ-H2AX, skulle have været parallel med forøget ekspression af pWee1 og pChk1.Even selvom ATR-Chk1-Wee1 aksen primært aktiveret ved strakt af enkeltstrengede DNA’er, kan disse unormale strukturer generere DSB’er upon replikation gaffel kollaps [16]. Desuden har vi begrundede, at aktiveringen af ​​G

2 /M checkpoint bør være særligt dygtige i tilstedeværelse af høje basale niveauer af endogene DNA skader, der repræsenterer en adaptiv mekanisme, gennem hvilken cancerceller modvirker onkogen-induceret replikation stress [16] . Faktisk er det kendt, at ATR og Chk1 undertrykke den apoptotiske respons efter DNA-replikation stress [17], og at tumorer karakteriseret ved forhøjede niveauer af replikativ stress, såsom Myc-drevne cancerformer, er ekstremt sårbare over den farmakologiske målretning af G

2 /M checkpoint kinaser [18-23]. Vi har ikke observere nogen sammenhæng mellem pWee1 og γ-H2AX, men snarere disse effektmål var uafhængigt associeret med PCR. Vi kan spekulere, at to uafhængige reparation veje, især effektive i livmoderhalskræft, blev fanget i dette studie. En egnet kandidat er Ataxia-telangiectasia muteret (ATM) -Checkpoint kinase 2 (Chk2) pathway, som hovedsageligt aktiveres af DSBs [16]. Der findes en omfattende samarbejde mellem ATM-Chk2 vej og ATR-Chk1-Wee1 signalering, og ATM phosphorylerer også H2AX [16].

Et andet aspekt på vej ud af denne undersøgelse vedrører sammenhængen mellem pWee1 og pChk1 udtryk. Wee1 er placeret nedstrøms Chk1 [3], og Wee1 phosphorylering ved Ser642 øger dens stabilitet i kernen og fremmer cellecyklusstop på G

2 /M overgang [24, 25]. Men så vidt vi ved formelt bevis, at denne reguleringsmekanisme, nemlig Chk1-drevet phosphorylering af Wee1 på Ser642, opererer i pattedyrceller mangler stadig. Aktuel beviser for det meste stammer fra studier med

Xenopus

ekstrakter og

Schizosaccharomyces pombe

som modelsystemer [26, 27]. Selvom vores undersøgelse ikke er designet til at generere mekanistiske indsigt i dynamikken for Wee1 aktivering, dens resultater giver et forslag til fremtidige prækliniske undersøgelser.

Et sidste punkt, der fortjener betragtning henviser til den beskyttende rolle af G

2 /M checkpoint aktivering i forbindelse med cancer stamceller [28]. Aktivering af aksen er blevet forbundet med terapeutisk modstand i forskellige cancer stamcellelinjer modeller, herunder hjerne-, lunge- og coloncancer [29-31]. Multiplikation indsatsen for at etablere en samling af patient-afledte livmoderhalskræft stamceller til omfattende molekylær karakterisering er en strategi, der skal forfølges yderligere dissekere det eksisterende mellem G

2 /M checkpoint aktivering og kemoterapi funktioner forhold. Relevansen af ​​denne tilgang er endnu tydeligere, når man overvejer behovet for mere præcise cellulære og dyremodeller i lyset af antallet af Chk1 og Wee1-hæmmere, der trådte klinisk udvikling [3, 32]. For eksempel, en fase I forsøg med den første i sin klasse Wee1 hæmmer AZD1775 (MK1775) i forbindelse med cisplatin og strålebehandling er i gang (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01958658), og et fase I /II forsøg i kombination med topotecan /cisplatin resultater som afsluttet (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01076400). Desuden har en fase I-II studie med AZD1775 i kombination med kemoterapi er igangsat i patienter med TP53-muteret epitelial ovariecancer, æggeleder, eller primær peritoneal cancer [33].

Konklusioner

for at opsummere, pWee1 andγ-H2AX udtryk i pre-kemoterapi prøver viste evne til at forudse pCR i livmoderhalskræft kræftpatienter behandlet med neoadjuverende paclitaxel, ifosfamid og cisplatin. Baseret på de ekstremt lovende resultater heri præsenteret prospektive validering eller alternativt er accessoriske molekylære analyser i forbindelse med prospektive forsøg berettiget til bedre karakterisere den prædiktive evne af disse biomarkører.

Tak

Vi takker Tania Merlino til teknisk bistand.