PLoS ONE: Sonic Hedgehog Pathway er afgørende for vedligeholdelse af Cancer Stem-lignende celler i Human Gastric Cancer

Abstrakt

Unormal aktivering af Sonic pindsvin (SHH) vej er blevet beskrevet i en lang række humane kræftformer og i cancer stamceller (CSCS) har dog ikke været rapporteret rolle SHH vej i gastrisk CSCS. I denne undersøgelse undersøgte vi muligheden for, at unormal aktivering af SHH-vejen fastholdt karakteristika gastriske CSCS. Først identificerede vi cancer stamceller-lignende celler (CSLCs) fra humane gastrisk cancer cellelinier (HGC-27, MGC-803 og MKN-45) ved hjælp af tumorsphere kultur. Sammenlignet med adhærente celler, de flydende tumorsphere cellerne havde mere selvfornyende kapacitet og kemoresistens. De celler, der udtrykker CSCS markører (CD44, CD24 og CD133) var også signifikant mere i tumorsphere celler end i adhærente celler. Endnu vigtigere, viste in vivo xenografundersøgelser at tumorer kan genereres med 2 × 10

4 tumorsphere celler, hvilket var 100 gange mindre end dem, der kræves for tumorer seeding af klæbende celler. Næste RT-PCR og Western blot viste, at ekspressionsniveauerne af ptch og Gli1 (SHH pathway målgener) var signifikant højere i tumorsphere celler end i adhærente celler. Resultaterne af kvantitative real-time PCR, var de samme som RT-PCR og Western blot. Yderligere analyse viste, at SHH vej blokeret af cyclopamin eller 5E1 forårsagede en større reduktion i selvfornyende kapacitet HGC-27 tumorsphere celler end det klæbende celler. Vi fandt også, at SHH pathway blokerer stærkt forbedret effektiviteten af ​​kemoterapeutiske lægemidler i HGC-27 tumorsphere celler in vitro og in vivo, men havde ingen signifikant virkning i adhærente celler. Endelig har vi isoleret de tumorspheres fra mavekræft prøve, disse celler havde også kemoresistens og tumorigen kapacitet, og SHH vej fastholdt mavens CSLCs karakteristika tumorsphere celler fra primær tumor prøver. Som konklusion vores data antydede, at SHH-vejen var essentiel for opretholdelse af CSLCs i human gastrisk cancer

Henvisning:. Song Z, Yue W, Wei B, Wang N, Li T, Guan L, et al. (2011) Sonic Hedgehog Pathway er afgørende for vedligeholdelse af Cancer Stem-lignende celler i Human Gastric Cancer. PLoS ONE 6 (3): e17687. doi: 10,1371 /journal.pone.0017687

Redaktør: Mikhail Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: November 27, 2010; Accepteret: 10. februar, 2011; Udgivet: 4 marts 2011

Copyright: © 2011 Song et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National High Technology Research and Development Program Kina (# 2006AA402A04, # 2006AA02A107), Major State Basic Research Program Kina (# 2009CB521704), og National Nature Science Foundation of China (# 30.872.468, # 30.873.031). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

CSCS spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft, denne delpopulation inden tumor besidder de karakteristika selvfornyende kapacitet, kemoresistens og tumorigen kapacitet derfor kan spille en afgørende rolle i initiering, progression og gentagelse af kræft. Undersøgelse og manipulere biokemiske veje involveret i disse kendetegn er en af ​​de bedste måder at bidrage til CSCS, der fører til udvikling af nye lægemidler og behandlingsmetoder. SHH vej spiller en afgørende rolle i mange CSCS, såsom glioblastoma stamceller [1], [2], CD34 + leukæmiceller [3], [4] og bryst CSCS [5], ud over, er det afgørende for udviklingen og homeostase af gastrisk kirtel [6], kan unormal aktivering af SHH pathway resultere i gastrisk cancer [7], [8], men rolle SHH pathway i gastrisk CSCS er ikke klart.

SHH vej hos pattedyrceller medieres af ligander Shh [9]. I fravær af Shh, det transmembrane receptor patched (ptch) hæmmer aktiviteten af ​​et andet transmembrant protein, smoothened (Smo), hvilket resulterer i inaktivering af SHH pathway [9], [10]. Binding af Shh til ptch ophæver den inhibitoriske virkning af ptch, og Smo er derepresseret, for derved at aktivere transkriptionsfaktor Gli (Gli1, Gli2 og GLI3) [9], [10]. Gli1 er en stærk positiv aktivator af nedstrøms målgener og er i sig selv en transskriptionel mål på SHH pathway [11]. Derfor er Gli1 betragtes som en markør for SHH pathway unormal aktivering [10], [12]

For nylig har flere typer af CSCS eller CSLCs blevet identificeret og isoleret fra maligne tumorer [13] -. [25]. I mavekræft, metodisk, er det vanskeligt at isolere og forstærke CSCS fra cellelinier eller tumor vævsprøver. På nuværende tidspunkt, CD44 synes at være den mest nyttig markør for potentiel oprensning af gastriske CSCS, er det imidlertid ikke yderst specifik for gastriske CSCS [26].

I denne undersøgelse har vi isoleret CSLCs fra human gastrisk cancercellelinier (HGC-27, MGC-803 og MKN-45) under anvendelse tumorsphere dyrkning i serumfrit medium og identificeret selvfornyelse kapacitet, kemoresistens og tumordannende kapacitet af tumorsphere celler; Dernæst undersøgte vi ekspressionen af ​​SHH pathway-relaterede molekyler, herunder Shh, ptch, Smo, Gli1 og Gli2 i tumorsphere celler og adhærente celler, især ekspressionen af ​​ptch og Gli1.Then, vi blokeret SHH pathway ved cyclopamin eller kontrol tomatidine, 5E1 eller kontrol PBS at undersøge, om de særlige kendetegn ved CSLCs i tumorsphere celler blev holdt ved unormal aktivering af SHH-vejen. Endelig har vi udnyttet primære gastrisk cancer prøver at analysere de funktionelle aspekter af SHH pathway i gastriske CSLCs.

Cyclopamin er en celle-permeabelt steroide alkaloid. Det forstyrrer kolesterol bio-syntese og specifikt antagoniserer SHH signalvejen gennem direkte vekselvirkning med Smo (smoothened), en fjern slægtning til G-protein-koblede receptorer. Det er et værdifuldt værktøj til undersøgelse af inddragelse af SHH signalering i udviklingen af ​​forskellige tumorer. Tomatidine er et steroidt alkaloid, der strukturelt ligner cyclopamin, men mangler evnen til at inhibere SHH signalering. Det kan anvendes som en negativ kontrol. 5E1 er en anti-Hh monoklonalt antistof, som neutraliserer den SHH og IHH aktivitet.

Resultater

1. Tumorsphere celler besad karakteristika CSLCs Salg

Vi voksede HGC-27, MGC-803 og MKN-45 adhærente celler i serum-frit medium beskrevet i metodeafsnittet. Efter 7 dage blev tumorspheres bestående af ca. 50 til 100 celler observeret (fig. 1A).

(A) Tumorspheres dannet efter 14 dage. (B) Den sub-tumorspheres dannelse evne tumorsphere celler (hvide søjler) og adhærente celler (sorte søjler). * = P 0,05. Bars = 1000 um. (C) Den kolonier dannelse evne tumorsphere celler (hvide søjler) og adhærente celler (sorte søjler) under forankringsuafhængige betingelser ved blød agar assays. * = P 0,05. (D) Effekt af 48 timer eksponering af tumorsphere celler (hvide søjler) og adhærente celler (sorte søjler) til 1000 uM kemoterapeutisk stof. Ox = oxaliplatin, Mi = mitomysin. * = P. 0,05

selvfornyende kapacitet i disse tumorspheres blev vurderet ved at dissociere dem i enkelt celle og vokser med en klontæthed på 1.000 celler per milliliter. Efter 2 uger, enkelt celle afledt fra HGC-27 tumorsphere celler genereret sub-tumorspheres på 41,83% ± 3,13% sammenlignet med 8,17% ± 2,40% af adhærente celler, i øvrigt, i MGC-803 og MKN-45, den sub-tumorspheres dannelse hastighed på tumorsphere celler var også højere end for adhærente celler. (Fig. 1B). Disse data antydede, at selvfornyende kapacitet tumorsphere celler var signifikant højere end for adhærente celler. Tumorsphere celler viste også en øget evne til at danne kolonier under forankringsuafhængige betingelser i et standard blød agar-assay efter 14 dage i HGC-27 og MKN-45 (fig. 1C).

Vi udførte også en begrænsende fortynding assay for sfæroider dannelse under anvendelse HGC-27 tumorsphere celler og adhærente celler. Som vist i tabel S1, kunne ca. 27-35% af tumorsphere celler producerer sfæroider, mens mindre end 5% af adhærente celler kunne generere sfæroider efter 3 ugers dyrkning. Derfor, i de HGC-27 tumorsphere celler, kunne vi vurderer, at sfæroiderne-dannende celler population bestod et maksimum på 35%.

kemoresistens er en anden karakteristisk for CSCS, så vi undersøgt, om en forskel i kemoresistens eksisterede mellem tumorsphere celler og adhærente celler. Resultaterne viste, at efter 48 timer, tumorsphere celler demonstrerede signifikant større resistens over for lægemidler sammenlignet med adhærente celler under de samme betingelser (fig. 1d). Vi vurderede også kemoresistens af HGC-27 tumorsphere celler og adhærente celler til forskellige koncentrationer af lægemidler, men begge tumorsphere celler og adhærente celler viste ikke signifikant kemoresistens over for lægemidler på en dosis-afhængig måde (Fig. S1).

Dernæst undersøgte vi ekspressionen af ​​CD44 i dissocierede tumorsphere celler og adhærente celler under anvendelse immunofluorescens assay og western blot. Resultaterne viste, at celler, der udtrykker CD44 var signifikant mere i tumorsphere celler end i adhærente celler (Fig. 2A). Endvidere blev ekspressionen af ​​andre CSCS markører (CD24 og CD133) i tumorsphere celler og adhærente celler undersøgt ved Western blot, sammenlignet med tumorsphere celler, ekspression af CD24 var signifikant lavere i adhærente celler, mens ekspressionen af ​​CD133 var ens (fig . 2B). Endvidere har vi fraktioneret HGC-27 celle ved FACS sortering for CD44, fandt vi, at CD44 (+) cellefraktion kunne generere flere sfæroide kolonier sammenlignet med CD44 (-) cellefraktion, Desuden er størrelsen af ​​kugleformede kolonier fra CD44 (+) celler var større end dem fra CD44 (-). celler (. fig 2C)

(A) immunofluorescens (venstre panel) og Western blotting (højre panel) analyse af CD44 (grøn farve) på mekanisk dissocierede tumorsphere celler og adhærerende celler. Kerner blev modfarvet ved DAPI (blå farve). TC’er = tumorsphere celler ACS = vedhæftende celler. Bars = 100 um. (B) Ekspression af CD24 og CD133 i tumorsphere celler og adhærente celler ved Western blotting, blev β-actin tilvejebragt som en kontrol. (C) Den tumorspheres dannelse kapacitet HGC-27 CD44 (+) celler og CD44 (-) celler. * = P 0,05. Bars = 1000 um.

2. Tumorsphere celler kunne generere tumorer upon xenotransplantation

For xenografundersøgelser, lige antal (2 × 10

4, 2 × 10

5, 2 × 10

6, 2 × 10

7) af frisk dissocierede tumorsphere celler eller kontrol adhærente celler blev injiceret sc i hver mus (6 mus pr gruppe). Resultaterne viste, at tumorer blev genereret med 2 × 10

4 tumorsphere celler, som var 100 gange mindre end dem, der kræves for tumor podning af adhærente celler (tabel 1). Endvidere genererede tumorsphere celler subkutane tumorer med større volumen og kortere tid sammenlignet med dem, der frembringes fra adhærente celler (fig. 3A, B). Således subkutan injektion af lave antal tumorsphere celler bekræftede, at sfæroide-celler bibeholdt stærkere tumorigene kapacitet i nøgne mus end adhærente celler.

(A) Subkutan tumorvækst i nøgne mus efter injektion af HGC-27 tumorsphere celler ( 2 × 10

5) i den venstre bageste flanke af hver mus og lige mange adhærente celler i den højre bageste flanke af hver mus. (B) Størrelse af subkutan tumor efter injektion af 2 × 10

5 HGC-27 tumorsphere celler, 2 × 10

5 HGC-27 klæbende celler og 2 × 10

6 HGC-27 klæbende celler. (C) H lukket cirkel = kontrol tomatidine). Sorte linjer er tumorsphere celler, rød er vedhæftende celler. * = P 0,05. TC’er = tumorsphere celler. Bars = 1000 um. (B) kolonierne dannelse af HGC-27 tumorsphere celler og adhærente celler behandlet med forskellige koncentrationer af cyclopamin eller kontrol tomatidine under forankringsuafhængige betingelser (åben cirkel = cyclopaminbehandlede; lukket cirkel = kontrol tomatidine). Sorte linjer er tumorsphere celler, rød er vedhæftende celler. * = P 0,05. TC’er = tumorsphere celler. (C) Procentdel af cellelevedygtighed blev analyseret på HGC-27 tumorsphere celler og adhærente celler (D) efter udsættelse for forskellige koncentrationer af cyclopamin eller 5 uM cyclopamin med forskellige lægemidler i 48 timer. Kontrolgruppe er tomatidine. Cyc = cyclopamin, Ox = oxaliplatin, Mi = mitomysin. * = P. 0,05

Dernæst undersøgte vi effekten af ​​SHH vej på kemoresistens af HGC-27 tumorsphere celler, vi behandlede de dissocierede celler med cyclopamin eller kontrol tomatidine i 48 timer, og derefter narkotika modstand tumorsphere celler blev evalueret. Når cyclopamin blev efterfulgt af lægemidler, behandling resulterede i en væsentlig forbedret samlet celledød sats. De bedste resultater blev opnået, når cyclopamin blev kombineret med Oxaliplatin plus Mitomycin (fig. 5C). Ingen sådan synergistisk virkning blev observeret i adhærente celler efter eksponering for lægemidler med cyclopamin i 48 timer (Fig. 5D).

Vi analyseret også virkningen af ​​forskellige koncentrationer af cyclopamin (2,5 pM, 5 pM, 10 uM) på celledød. Resultaterne viste, at cyclopamin alene at tumorsphere celler kunne gøre en lille, men konsekvent fald i antallet af levedygtige celler. Sammenlignet med HGC-27 tumorsphere celler, virkningen af ​​cyclopamin på celledød til adhærente celler var mere signifikans (fig. 5C, D).

Når SHH pathway blev blokeret af 5E1 eller kontrol PBS, resultaterne af self -renewing kapacitet og kemoresistens af tumorsphere celler og adhærente celler svarede til dem blokeret af cyclopamin eller kontrol tomatidine (fig. S2).

5. SHH pathway blokerer forbedret tumor respons på lægemidler in vivo

For at teste denne hypotese in vivo, vi analyseret, om SHH pathway blokerer forbedret kemoterapi effektivitet, cyclopamin eller kontrol tomatidine blev brugt til at hæmme SHH pathway svar. HGC-27 tumorsphere Cellerne fik lov at vokse til begge baghjul flanker af nøgne mus, indtil den større diameter af tumor nåede ca. 2 mm. Mus blev derefter behandlet to gange om ugen i 3 uger med cyclopamin eller kontrol tomatidine 24 timer før oxaliplatin levering. I alle behandlede mus, tumorer behandlet med Oxaliplatin var signifikant mindre end de ikke behandlet med oxaliplatin. Desuden viste tumorer signifikant større tumorvækstinhibering når de blev behandlet med Oxaliplatin i kombination med cyclopamin, blev tumoren reaktion på kemoterapeutisk lægemiddel forøget ved cyclopamin (fig. 6A, B). Vi undersøgte også, om SHH pathway blokeret af 5E1 eller kontrol PBS forbedret kemoterapi effektivitet in vivo, viste resultaterne, at 10 ug /ml 5E1 behandling førte til en signifikant større tumorvækstinhibering end dem kun behandlet med Oxaliplatin (fig. 6A, B).

(A) subkutane tumorer afledt af 2 × 10

5 HGC-27 tumorsphere celler dyrket i nøgne mus 4 uger efter ip behandling med PBS eller oxaliplatin i kombination med 10 pM kontrol tomatidine ved venstre bageste flanke omkring tumoren eller oxaliplatin i kombination med 10 pM cyclopamin på det rigtige bageste flanke omkring tumoren eller oxaliplatin i kombination med 10 ug /ml 5E1 til højre bageste flanke. Tom = tomatidine, Cyc = cyclopamin, Ox = oxaliplatin. TC’er = tumorsphere celler. (B) Tumorstørrelse afledt som i (A) efter 20 dage. Tom = tomatidine, Cyc = cyclopamin, Ox = oxaliplatin.

Disse data tydede på, at selv om standard kemoterapeutiske lægemidler forsinket tumor udvækst under behandlingen, da de blev kombineret med cyclopamin eller 5E1, effekten af ​​kemoterapi var væsentligt forbedret, og også mere vedvarende efter afbrydelse af behandlingen.

Dernæst at undersøge, om blokering af SHH vej in vivo havde en specifik virkning på HGC-27 tumorsphere celler. Mus blev kun behandlet cyclopamin på det rigtige bageste flanke eller kontrol tomatidine ved venstre bageste flanke (to gange om ugen i 3 uger), når tumorer fra HGC-27 tumorsphere celler nåede ca. 2 mm, efter 3 uger, udførte vi en begrænsende fortynding assay for sfæroider formation under anvendelse tumorceller behandlet med cyclopamin og behandlet med tomatidine hhv. Som vist i tabel S2, kunne ca. 9-15% af celler fra xenotransplanted tumor behandlet med tomatidine producere sfæroider, mens mindre end 2,5% af celler fra xenotransplanted tumor behandlet med cyclopamin kunne generere sfæroider. Derfor blokerer SHH pathway in vivo kan reducere antallet af gastrisk CSLCs.

6. SHH vej fastholdt mavens CSLCs karakteristika tumorsphere celler fra primær tumor prøver

For at afgøre, om SHH vej kunne være involveret i mavens CSCS karakteristika tumorsphere celler fra mavekræft væv, vi udnyttet primære mavekræft prøver at analysere funktionelle aspekter af SHH pathway i gastriske CSLCs.

først voksede vi frisk dissocierede bulk-celler fra mavekræft prøver i serum-frit medium beskrevet i afsnittet metoder, efter 10 dage, blev der observeret tumorspheres (fig. 7A, B). Derefter undersøgte vi kemoresistens og tumorigen kapacitet i tumorsphere celler fra mavekræft væv. Resultaterne viste, at tumorsphere celler fra mavekræft væv viste signifikant større resistens over for lægemidler end bulk-celler under de samme betingelser (Fig. 7C). Endvidere frisk dissocierede bulk-celler fra mavekræft prøver injiceret ved 2 × 10

7 celler per mus var i stand til oprettelse subkutane tumorer, mens så lidt som 2 × 10

4 af de tumorsphere celler fra mavekræft prøver kunne danne tumorer (tabel 1), xenotransplantaterne tumorer, der førte fra injektion af tumorsphere celler præsenterede de samme histopatologi funktioner som deres respektive menneskelige tumor (fig. 7F). Disse resultater viste, at tumorsphere celler fra gastrisk cancer væv besad karakteristika CSLCs. Dernæst observerede vi effekten af ​​SHH pathway blokering på kemoresistens af tumorsphere celler in vitro og tumor respons på lægemidler in vivo. Resultaterne viste, at cyclopamin eller kunne 5E1 resulterede i en signifikant forbedret samlet celledød sats (fig. 7D) og tumor respons på lægemiddel (fig. 7E). Salg

(A, B) Tumorspheres fra gastrisk cancer prøve dannet efter 2 uger senere. Barer = 1000 pm. (C) Effekt af 48 timer eksponering af tumorsphere celler (hvide søjler) og bulk celler (sorte søjler) til 1000 uM kemoterapeutisk stof. Ox = oxaliplatin, Mi = mitomysin. * = P 0,05. (D) Cellelevedygtighed blev analyseret på tumorsphere celler fra mavekræft tørvægt efter udsættelse for cyclopamin eller 5E1 med forskellige lægemidler i 48 timer. Kontrolgruppe er PBS. Cyc = cyclopamin, Ox = oxaliplatin, Mi = mitomysin. (E) subkutane tumorer afledt af 2 × 10

5 tumorsphere celler fra mavekræft eksemplar efter i.p. behandling med PBS eller oxaliplatin i kombination med 10 pM kontrol tomatidine bagest til venstre flanke omkring tumoren eller oxaliplatin i kombination med 10 pM cyclopamin på det rigtige bageste flanke omkring tumoren. Tom = tomatidine, Cyc = cyclopamin, Ox = oxaliplatin. TC’er = tumorsphere celler. (F) H & E-farvning analyse af humant tumor og xenotransplantater afledt tumorsphere celler. Bar = 100 um.

Diskussion

CSCS deler mange egenskaber med væv stamceller, såsom selvfornyelse, spredning, kemoresistens, og har hovedansvaret for at opretholde væksten af ​​tumorer [27], [28]. Mange forskere har anvendt fluorescensaktiveret cellesortering at identificere og isolere CSCS og fastslået, at disse celler kan danne sfærer i specialiserede serum-frit medium. I denne undersøgelse tog vi den modsatte vej ved at udvikle tumorsphere celler og derefter bestemmes, om disse celler erhvervet CSCS egenskaber.

Vi anvendte en defineret serumfrit medium bestående af EGF, FGF-2, B-27 supplement og N-2 supplement til at opretholde gastriske cancercellelinier. Disse betingelser var blevet brugt før til at opretholde endogene neurale stam- /progenitorceller og tumor stamceller fra humane tumorer og tumorcellelinier. For eksempel Kondo et al. [24] karakteriserede C6 rotte tumorcellelinie in vitro og in vivo og observeret en lille population af stamceller-lignende celler afledt fra velkarakteriserede side population. Setoguchi et al. [29] viste kræft stilk-lignende potentiale celle i andre cancer cellelinjer, herunder MCF7 brystcancer linje, B104 neuroblastom, og HeLa adenocarcinom.

På vores eksperiment, vi brugte tre gastrisk cancer cellelinjer (HGC- 27, MKN-45 og MGC-803) til kultur tumorspheres. HGC-27-cellelinje blev etableret af kulturen i metastatisk lymfeknude fra en mavekræft patient diagnosticeret histologiske som udifferentierede karcinom. MKN-45 blev etableret fra dårligt differentieret adenocarcinom i maven af ​​en 62-årig kvinde. MGC-803 er en epitelial dårligt differentieret human gastrisk mucokutant-adenocarcinom cellelinje fra en 74-årig mand.

To forskellige tilgange er typisk blevet brugt til at identificere CSCS i offentliggjorte undersøgelser [30], [31] . Den ene er en in vitro-metode kaldes “kugleformet kolonidannelse”, og en anden er in vivo metode involverer implantation af kandidat CSCS under huden på immundefekte mus.

Den tidligere metode indebærer dyrkning kandidat CSCS i petriskåle specielt belagt for noncell fastgørelse med serumfrie medier indeholdende epidermal vækstfaktor og basisk fibroblastvækstfaktor. Væksten i sfæriske kolonier efter et par uger er betragtes som vejledende for selvfornyelse evne, og ville være i overensstemmelse med en CSC fænotype. Sidstnævnte metode-vækst af celler i immunsvækkede mus-er nødvendig for at demonstrere ægte tumorigenicitet og er generelt betragtes som den gyldne standard for at bevise eksistensen af ​​CSCS. En række undersøgelser har antydet, at disse to tilgange giver normalt lignende resultater i evalueringen kandidat CSCS for mange solide tumorer.

På nuværende gastrisk CSCS har ikke specifikke overflade beslutningstagere, så udviklede vi tumorsphere celler og derefter afgøres, om disse celler erhvervede CSCS egenskaber, herunder selvfornyende kapacitet, kemoresistens og tumorigen kapacitet.

Vores data viste, at gastrisk cancer cellelinier (HGC-27, MGC-803, MKN-45) dyrkes i en defineret serum- frit medium kunne danne tumorspheres der indeholdt celler opfører sig som CSLCs. In vitro tumorsphere celler viste en øget evne til at danne kolonier i blød agar under forankringsuafhængige forhold og en øget evne til at danne sub-tumorspheres. Vi viste også, at selvfornyelse evne til at danne sub-tumorspheres af HGC-27 tumorsphere celler havde en stigning på passager 2 til 8 (fra 44,5% til 70,5%), og så er det fastholdt en relativ stabil andel efter 8 eller mere Passage ved dyrket ved klonal densitet (fig. S3). Disse data antydede, at det proliferative potentiale tumorsphere celler blev opretholdt efter længere passager. Desuden tumorsphere celler in vitro var mere modstandsdygtige over for oxaliplatin og Mitomycin sammenlignet med vedhængende celler, foreslog disse data, at tumorsphere celler består af berigede antal CSLCs, der potentielt gjorde dem mindre modtagelige for handlinger både Oxaliplatin og Mitomycin. In vivo, kunne tumorsphere celler generere tumorer upon xenotransplantation på et højere tempo end klæbende celler. Desuden genereres tumorsphere celler subkutane tumorer med større volumen og kortere tid sammenlignet med dem der genereres fra adhærente celler, Vigtigere, tumorspheres kunne re-afledt af de xenotransplanted tumorer, og de kunne danne tumor igen, foreslog disse data, at tumorspheres blev beriget i CSLCs .

i vores undersøgelse, adhærente celler formentlig indeholdt en relativt lav procentdel af CSCS, som blev anvendt nogen fremgangsmåde til isolering eller fjernelse af disse celler. Det kan hævdes, at det er denne lille population af CSCS der er ansvarlig for tumordannelse. Uanset, flere CSCS var tydelig i tumorsphere celler, hvilket kan forklare dets mere aggressiv adfærd.

Dernæst undersøgte vi, hvorvidt forholdene på CSLCs i tumorspheres blev opretholdt ved unormal aktivering af SHH-vejen. Først demonstrerede vi, at mRNA ekspressionsniveauer af SHH pathway-relaterede molekyler (Shh, ptch og Gli1) var signifikant højere i tumorsphere celler end i adhærente celler, mens Gli2 var høj udtrykt i begge celler. Gennemgået yderligere ekspressionsniveauerne af SHH pathway målgener (ptch og Gli1) ved Western blot og kvantitativ real-time PCR, var resultaterne de samme som RT-PCR. For det andet, hæmning af SHH pathway aktivitet ved cyclopamin eller 5E1 medførte nedsat selvfornyelse kapacitet og øget følsomhed over for narkotika i HGC-27 tumorsphere celler, men disse effekter blev ikke udtalt i klæbende celler. In vivo, i alle behandlede mus, tumorer behandlet med Oxaliplatin var signifikant mindre end de ikke behandlet med Oxaliplatin, efter behandling med cyclopamin eller 5E1, blev tumoren reaktion på kemoterapeutiske lægemidler forbedres. Disse data tydede på, at selv om standard kemoterapeutiske lægemidler forsinket tumor udvækst under behandlingen, da de blev kombineret med cyclopamin blev effekten af ​​kemoterapi væsentligt forbedret, og også mere vedvarende efter afbrydelse af behandlingen.

Endelig har vi udnyttet primær mavekræft prøver at analysere de funktionelle aspekter af SHH pathway i gastriske CSLCs. Resultaterne viste, at tumorsphere celler fra mavekræft eksemplar havde også kemoresistens og tumorigen kapacitet øvrigt SHH pathway blokering reducerede kemoresistens af tumorsphere celler og øget tumor respons på lægemidler in vivo.

Som for kemoresistens, flere funktioner i CSCS kan gøre dem svære at fjerne. CSCS er relativt inaktiv og dette giver dem mulighed for at flygte fra kemoterapeutiske regimer, der typisk er målrettet aktivt cykler celler. Som vist for deres normale modstykke, er blevet foreslået CSCS at udvise højniveauekspression af multilægemiddeltransportøren familie gener, sandsynligvis resulterer i mere effektiv udstrømning af kemoterapeutiske lægemidler og medfødte multilægemiddelresistens desuden signalveje, såsom Wnt, pindsvin eller Notch er dysreguleret i CSCS fører til tumorudvikling. Udviklingen af ​​en effektiv terapeutisk tilgang ville derfor kræve identifikation af karakteristiske molekylære veje er aktive i CSCS og identificering af midler, der kan enten blokere CSC proliferation eller fremkalde CSC differentiering og dermed øge følsomhed over for kemoterapeutiske stoffer. Så vigtige faktorer, der påvirker kemoresistens af CSCS er iboende faktorer.