PLoS ONE: Metformin Mål det metaboliske Achilles Heel for Human bugspytkirtelkræft Stamceller

Abstrakt

pancreas duktale adenocarcinomer indeholder en delmængde af udelukkende tumorigene cancer stamceller (CSCS), som er i stand repopulating hele heterogene cancer cellepopulationer og er meget modstandsdygtige over for standard kemoterapi. Her demonstrerer vi, at metformin selektivt ablateret pancreas CSCS som det fremgår af formindsket udtryk for pluripotens-associerede gener og CSC-associerede overflademarkører. Efterfølgende evne metformin-behandlede CSCS til klonalt udvide

in vitro

blev irreversibelt ophævet ved at inducere apoptose. I modsætning hertil ikke-CSCS fortrinsvis reagerede ved cellecyklusstop, men blev ikke elimineret ved metformin behandling. Mekanistisk, metformin øget reaktive ilt arter produktion i CSC og reduceret deres mitokondrie transmembrane potentiale. Den efterfølgende induktion af dødbringende energikrise i CSCS var uafhængig af AMPK /mTOR. Endelig i primær kræftvæv xenograftmodeller metformin reduceres effektivt tumor byrde og forhindrede sygdomsprogression; hvis de kombineres med en stroma målretning smoothened inhibitor for øget væv penetration, mens gemcitabin faktisk optrådte undværlige

Henvisning:. Lonardo E, Cioffi M, Sancho P, Sanchez-Ripoll Y, Trabulo SM, Dorado J, et al . (2013) Metformin Mål det metaboliske Achilles Heel for Human bugspytkirtelkræft stamceller. PLoS ONE 8 (10): e76518. doi: 10,1371 /journal.pone.0076518

Redaktør: Anita B. Hjelmeland, Cleveland Clinic, USA

Modtaget: May 3, 2013; Accepteret: September 1, 2013; Udgivet: 18 okt 2013

Copyright: © 2013 Lonardo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskningen blev støttet af ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233.460), Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram (FP7 /2007-2013) under tilskudsaftale n ° 256.974, den Subdirección General de evaluering y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria ( PS09 /02129), og Programa Nacional de Internacionalización de la i + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; begge Ministerio de Ciencia e Innovación, Spanien). E.L. er støttet af Roche Postdoc Fellowship Program. M.C. er støttet af La Caixa Predoctoral Fellowship Program. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er fortsat et af de mest ødelæggende kræftformer, og er den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i industrilande med et 5-års overlevelse på mindre end 5% [1]. Mange risikofaktorer herunder rygning, alkoholforbrug, og kronisk pancreatitis er blevet anerkendt som potentielle risikofaktorer for udvikling af PDAC [2]. Epidemiologiske studier tyder også på, at diabetes mellitus, især type 2, er forbundet med øget risiko for PDAC [3], [4]. Derfor har forskere gået i gang med at finde en formodet sammenhæng mellem brugen af ​​anti-diabetiske lægemidler og en reduceret risiko for udvikling og /eller progression af PDAC. Påfaldende, i en retrospektiv analyse blev oral administration af metformin hos patienter med diabetes mellitus type II sig at være forbundet med nedsat risiko for at udvikle PDAC [5] samt bedre resultat hos patienter med etablerede PDAC [6].

Den primære systemiske effekt af metformin (Met) er et fald i blodsukkerniveauet via reduceret hepatisk glukoneogenese og øget glukoseoptagelse i perifere væv [7]. Mekanistisk, metformin indirekte aktiverer AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) signalering [8] og efterfølgende hæmmer mTOR aktivitet, som ofte øges i kræftceller [9], herunder kræft i bugspytkirtlen stamceller (CSCS) som en yderst tumorigen subpopulation [10]. Denne inhibitoriske virkning af metformin på AMPK /mTOR signalering resulterer i reduceret proteinsyntese og celleproliferation [11], [12]. Desuden er der i etablerede PDAC cellelinier metformin er også i stand til at inhibere PDAC [13]. Interessant, en anden undersøgelse for nylig foreslået, at CSCS kunne målrettes ved metformin via re-ekspressionen af ​​miRNA impliceret i differentiering, selv om disse data er baseret på ikke-validerede cancer cellelinje-afledte CSCS [14].

I modsætning til den flertal af differentierede celler i tumoren, er CSCS vist sig at være meget resistente over for kemoterapi [15]. Derfor kan lægemidler, der selektivt målrettet CSCS repræsentere en mere effektiv tilgang til at overvinde modstand og /eller behandling tilbagefald i PDAC. Her har vi nu levere overbevisende dokumentation for, at CSCS afledt af et bredt sæt af primære humane PDACs er meget sårbare over for metabolisk omprogrammering af metformin resulterer i overlevelse af prækliniske musemodeller lang sigt.

Resultater

vi har tidligere vist, at primære pancreatiske CSCS kan beriges

in vitro

som forankringsuafhængige tredimensionale sfærer, som beriges for celler med stamcellelignende egenskaber [15]. Der er i alt ni menneskelige PDAC xenografter blev brugt med A6L, 163, 185, 215, 247, 253, og 286 bliver beskrevet tidligere [16], [17] samt 354 og JH029, der blev opnået ved hjælp af samme metode. Vigtigt er det, for

in vitro

eksperimenter alle celler var frisk isoleret fra tidlig passage implanteret og dyrket i lave passager som klæbende celler eller forankringsuafhængige sfærer. Kugler beriget med CD133

+ celler (Fig. S1a) og flere andre markører som er blevet associeret med en CSC fænotype sammenlignet med adhærente celler [18].

Metformin nedsætter ekspressionen af ​​CSCS markører

først etablerede vi et udtryk for den organiske kation transporter 1, 2, og 3 (OCT1-3) i vores primære PDAC celler (fig. 1A), som er afgørende for den cellulære optagelse af metformin. Metformin blev anvendt i koncentrationer, der ikke direkte toksisk for primære PDAC celler og ikke-transformerede bugspytkirtelceller (PSC, pancreas stjemeformige celler, HDPE, human duktale pancreasepitelceller) (Fig 1B.), Der er betydeligt lavere sammenlignet med anvendte koncentrationer i tidligere undersøgelser med PDAC cellelinier (10-30 mM) [14]. Dernæst fandt vi signifikante ændringer i mRNA-niveauer af CSCS gener (CD133, Alk4, Nodal, Activin og Smad2) og pluripotens-associerede gener (Nanog, Oct4 og Sox2) efter behandling med metformin (figur 1C;. Udnyttet primere er anført i tabel S1), der også blev bekræftet på proteinniveau (fig. 1D). Slående, metformin syntes at fortrinsvis fjerne CSCS som CSC-markør positive celler CD133, CD44, CXCR4 og SSEA-1 faldt, mens epitheldifferentiering maker EpCAM forøget (fig. 1E).

(A) Primære PDAC celler , men ikke normale pancreasceller udtrykker organisk kation transporter 1, 2, og 3 (n = 3). (B) Definition af det terapeutiske område for metformin i primære PDAC celler. Antal celler dyrket i nærværelse af de angivne koncentrationer af metformin i 24 timer (n = 6). (C) qPCR analyse af CSCS-associerede gener i kugler behandlet med 3 mM af metformin i 7 dage. Data er normaliseret til husholdning genet og præsenteres som gange ændring i genekspression i forhold til kontrol-celler (n = 6). (D) repræsentant Western blot, der illustrerer reduceret Oct4 proteinekspression i respons på metformin behandling (n = 3). (E) repræsentant flowcytometrianalyse for CSCS markører i kugler behandlet i 7 dage med 3 mM af metformin sammenlignet med ubehandlede kugler (øvre panel). Oversigt over data for PDAC-185, A6L, 215, 253, og 354 er vist (nederste panel, n = 6)

Metformin selektivt mindsker in vitro og in vivo tumorgenicitet

Vi næste undersøgte de funktionelle effekter af metformin på selvfornyelse kapacitet CSCS. Kuglen dannelse assay viste et kraftigt fald i størrelsen af ​​dannede sfærer af metformin (Fig 2A . S1B) via hæmning af udvidelsen af ​​afkom af CSCS, som repræsenterer størstedelen af ​​cellerne i de dannede sfærer. Endnu vigtigere, fandt vi, at metformin faldt betydeligt antallet af faktisk dannede kugler med samme effektivitet ved 3 og 10 mM (fig. 2B). For at undersøge den langsigtede effekt af metformin behandling på selvfornyelse kapacitet af celler, der ikke viste signifikant forskel i løbet af første passage sfære dannelse (Panc-185 og Panc-215), blev sekundære og tertiære sfærer indledt uden yderligere metformin behandling. Dannelse af kugler i det andet og tredje passager blev drastisk hæmmet tyder på, at metformin behandling havde irreversibelt fjernet størstedelen af ​​CSCS ved inhibering eller ophævelse af deres selvfornyelse kapacitet (fig. 2C). Konsekvent, forbehandling med metformin resulterede i dannelsen af ​​færre og mindre kolonier sammenlignet med kontrol (fig. 2D). Den gyldne standard for CSC aktivitet repræsenterer

in vivo

tumorigenicitet. Hyppigheden af ​​tumorigene celler, der stammer fra PDAC-354, 215, og A6L sfærer var jævnligt meget højt med værdier under 1:500 og blev markant rarified af metformin behandling (fig. 2E). Endelig fandt vi, at metformin forbehandling af pancreas CSCS efterfølgende reduceret deres vandrende (fig. S2A) og invasive kapacitet (fig. 2F).

(A) Metformin reducerer størrelsen af ​​kugler. Repræsentative billeder af kugler opnået efter behandling med metformin i 7 dage. Kvantificering af kugle størrelse (n≥6). (B) Sphere kapacitet dannelse i nærvær eller fravær af metformin i 7 dage (n≥6). (C) Self-fornyelse kapacitet på cancer stamceller isoleret fra tumorer reagerer dårligt i form af første passage sfære danner kapacitet. Celler blev kontinuerligt passage som sekundære og tertiære kugler behandlet med metformin eller køretøj kun under første generation sfære formation (n = 6). (D) Kolonidannelse for PDAC-185, A6L, 215, 253, og 354 fremgår af 0,05% krystalviolet efter 21 dage (n = 3). (E) Rarefication af

in vivo

tumorigene cancer stamceller i kugler behandlet med metformin sammenlignet med køretøjet. (F) Invasion af kugle-afledte celler efter 24 timers behandling med metformin eller kontrol (n = 3).

Metformin specifikt eliminerer pancreas CSCS

Befolkning fordobling af klæbende celler var markant reduceret med metformin med stærk intertumoral variation (fig. 3A). Konsekvent blev Ki67-ekspression formindsket tyder inhibering af celleproliferation (Fig. 3B), hvilket blev bekræftet ved reduceret ekspression af cyclinD1 på mRNA (fig. 3C) og proteinniveau (fig. S2B). Dernæst analyserede vi cellecyklen profil adhærente celler versus CSCS ved flowcytometri. Interessant, viste data, at den funktionelle effekt af metformin på cellecyklusprogression var meget mere marginal for kugle-afledte celler tyder på en særskilt mekanisme ansvarlig for deres efterfølgende tab under langvarig behandling (fig. 3D). Faktisk mens metformin ikke i væsentlig grad ændre hastigheden af ​​apoptotiske vedhæftende celler som påvist ved AnnexinV /Dapi farvning (1,23 ± 0,37 gange ændring), det resulterede i en kraftig induktion af apoptose i kugle-afledte celler (2,95 ± 1,10 gange forandringer; P 100 ng /ml), og retningen aktivering af AMPK (A769662; 10 uM) på kugle-dannelse og (n = 6). (D) kolonidannelse for PDAC-215, 253, og 354-celler (n = 3). (E) Total og mitokondrie (Mito) ROS produktion efter 8 timers kontrol eller metformin behandling. (F) Mitochondriel transmembrane potentiale efter 8 timers kontrol eller metformin behandling.

Næste, vi hypotese, at den særlige følsomhed CSCS til metformin kan skyldes anti-oxidant egenskaber til metformin [19]. Faktisk metformin behandling signifikant forøget mitokondriel produktion af reaktive oxygenarter (ROS) i CSCS afledt af alle anvendte tumorer, men disse ændringer var mere udtalt i hurtige responders (PDAC-253 og 354) sammenlignet med den sene respondere PDAC-215 og 286 (hvor metformin effekter ikke er påviselige i første generation sfære dannelse) (fig. 4E). Interessant nok blev opnået konsistente data for den mitokondriske transmembranpotentiale, som var mest fremtrædende reduceret i hurtige respondere (fig. 4F). Brug af mitokondrie sonde TMRE, vi viser, at metformin i disse tumorer faldt deres mitokondrie transmembrane potentiale (bruges som en generel markør for mitokondrietoksicitet og induktion af apoptose), mens den var uændret eller kun svagt reduceret i langsomme respondenter. Denne direkte effekt på mitokondrier kan også forklare forskellen følsomhed mellem ikke-CSCS og CSCS da sidstnævnte synes at være mere afhængige af deres mitokondrier til at generere energi, mens ikke-CSCS hovedsagelig afhænge mitokondrier-uafhængige kilder såsom aerob glykolyse (Warburg effekten) [20]. Derudover har vi også bekræftet, at effekten af ​​metformin på mitokondrier var uafhængig af AMPK /mTOR som hverken direkte AMP aktivator A769662 eller mTOR-hæmmer rapamycin var i stand til at efterligne virkningerne af metformin (fig. S4A /B).

metformin boder PDAC progression in vivo

først, vi undersøgte effekten af ​​metformin

in vivo

ved hjælp af en kort 7-dages metformin behandling af PDAC-185. Under den efterfølgende opfølgning på 40 dage observerede vi en signifikant reduktion i tumorvækst og et komplet remission i 3 ud 8 tumorer for metformin behandlede-mus i modsætning til ingen tilgivelse i kontrolgruppen (Fig. S5). Sammenhængende data blev opnået for andre PDACs med metformin monoterapi er meget effektivt inducerer sygdom regression (fig. 5A-F). Flere vigtige observationer blev gjort i løbet af disse undersøgelser. Først blev der ikke brutto toksicitet observeret under langvarig metformin behandling som kropsvægt forblev uændret (fig. 5A, højre panel). For det andet, tumorer langsomt, men regelmæssigt tilbagefald efter tilbagetrækning af metformin på dag 100 (fig. 5A, venstre panel). For det tredje, mens tilsætning af gemcitabin

in vitro

viste en additiv effekt på CSC befolkning (fig. 5C), ingen additiv effekt kunne noteres

in vivo

for metformin plus gemcitabin (fig. 5D)

(A)

Venstre panel

:. PDAC-215 væv blev implanteret og blev tildelt behandling efter indledende tumor tage blev verificeret. Mus blev behandlet med enten gemcitabin (GEM) eller metformin (Met). Metformin blev afbrudt på d100 at teste potentialet i de resterende læsioner at indlede sygdomstilbagefald. Efter dokumenteret sygdom tilbagefald, blev metformin behandling igen administreres.

Right panel

: Kropsvægt under behandlingen. (B)

Venstre panel

: Histologisk analyse: Hematoxylin Eosin (H Eosin (H . 75 um stort med ~ 97% CD133high. For seriel passage blev 7 dage gamle kugler høstet ved hjælp 40 um celle harper, dissocieret til enkelte celler med trypsin, og derefter igen dyrket i 7 d.