PLoS ONE: STAT3 Aktivering i skeletmuskulatur Links muskelsvind og den akutte fase respons i Cancer Cachexia

Abstrakt

Baggrund

Kakeksi, eller vægttab trods tilstrækkelig ernæring, i væsentlig grad hæmmer livskvalitet og respons på behandling hos kræftpatienter. Hos cancerpatienter, skeletmuskelsvind, vægttab og mortalitet er alle positivt associeret med øgede serum cytokiner, især interleukin-6 (IL-6), og tilstedeværelsen af ​​den akutte fase respons. Akut fase proteiner, herunder fibrinogen og serumamyloid A (SAA) syntetiseres ved hepatocytter som respons på IL-6 som en del af den medfødte immunreaktion. For at få indsigt i forholdene mellem disse observationer, vi studerede mus med moderat og svær Colon-26 (C26) -carcinoma kakeksi.

Metode /vigtigste resultater

Moderat og svær C26 kakeksi var forbundet med høje serum IL-6 og IL-6 familien cytokiner og meget lignende mønstre af skeletmuskulatur genekspression. De øverste kanoniske veje opreguleret i begge var komplementet /koagulationskaskaden, proteasom, MAPK signalering, og IL-6 og STAT3 veje. Kakeksi var forbundet med øget muskel pY705-STAT3 og øget STAT3 lokalisering i myonuclei. STAT3 målgener, herunder SOCS3 mRNA og akutfaserespons proteiner, var stærkt induceret i kakektiske muskel. IL-6 behandling og STAT3-aktivering både inducerede også fibrinogen i dyrkede C2C12 myotuber. Kvantificering af muskel versus liver fibrinogen og SAA proteinniveauer indikerer, at musklen bidrager en stor del af serum akutfaseproteiner i cancer.

Konklusioner /Signifikans

Disse resultater antyder, at STAT3 transkriptomet er en vigtig mekanisme til spilde i kræft. Gennem IL-6 /STAT3-aktivering, er skeletmuskel induceret til at syntetisere proteiner i akut fase, hvorved der etableres en molekylær forbindelse mellem observationerne af høj IL-6, forøget akutfaserespons proteiner og muskelsvind i cancer. Disse resultater tyder på en mekanisme, hvormed STAT3 kunne kausal indflydelse muskelsvind ved at ændre profilen af ​​gener udtrykt og oversat i muskler, således at aminosyrer befriet af øget proteolyse i kakeksi er syntetiseret i akut fase proteiner og eksporteres i blodet.

Henvisning: Bonetto A, Aydogdu T, Kunzevitzky N, Guttridge DC, Khuri S, Koniaris LG, et al. (2011) STAT3 Aktivering i skeletmuskulatur Links muskelsvind og den akutte fase respons i Cancer Kakeksi. PLoS ONE 6 (7): e22538. doi: 10,1371 /journal.pone.0022538

Redaktør: Gianni Parise, McMaster University, Canada

Modtaget: May 6, 2010; Accepteret: 29 Juni 2011; Udgivet: 20 Jul 2011

Copyright: © 2011 Bonetto et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud til TAZ fra National Cancer Institute R01 CA122596 (www.nci.nih.gov), fra det nationale institut for General Medical Studies R01 GM092758 (www.nigms.nih.gov), fra American Cancer Society Research Scholar Grant TBE-111.831 (www .acs.org), ved individuel tildeling fra en ACS Institutional Grant til universitetet i Miami, som Papanicoulau korps for Cancer Research (www.papcorps.org) ved Kvindernes Cancer Association of University of Miami (www.wcaofum. org), af Wendy Will Cancer Fund Case (www.wwccf.org), ved Department of Defense Breast Cancer Research Program (BCRP) BC045536 (cdmrp.army.mil), og af Amit familien. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kakeksi eller progressiv spild af fedt og skeletmuskulatur trods tilstrækkelig ernæring, er et omfattende og ødelæggende komplikation af kræft [1], [2], [3]. Kakeksi rammer mere end halvdelen af ​​alle patienter og resultater kræft i svaghed, formindsket livskvalitet, dårlig respons på behandlingen, og modtagelighed for sygdom. Endvidere kakeksi selv er ansvarlig for 25-30% af alle cancerpatienter dødsfald [1], [2]. I øjeblikket er der ingen godkendte, effektive behandlinger for muskelsvind i cancer.

Klinisk cancer kakeksi defineret som vægttab på mindst 5% i nærvær af underliggende sygdom med tilhørende muskelsvaghed, træthed, anoreksi, lav muskelmassen og unormal biokemi, herunder øget inflammation, anæmi og lavt serumalbumin. Vægttab på 5%, 10% eller 15% total legemsvægt omtales som mild, moderat eller svær kakeksi henholdsvis og både vægttab og hastigheden af ​​vægttab korrelerer positivt med dødelighed [4]. Ætiologien for kakeksi skyldes mange faktorer. Selv om en undergruppe af patienter oplever tidlig mæthed og anoreksi, har undersøgelser vist, at ernæringsmæssige indtag i kakektiske patienter bør være tilstrækkelig til at opretholde kropsvægten, men de tabe uanset [5]. Samt, kan kakektiske patienter være hypo-, normo- eller hyper-metabolisk med hensyn til hvile energi udgifter, hvilket tyder på, at ændringer i stofskiftet alene ikke kan være ansvarlig for den observerede tab af kropsmasse [2]. Endvidere tumor konkurrence om metaboliske brændstoffer er en utilfredsstillende forklaring af kakeksi, både fordi lokalisere tumorer kan producere kakeksi og fordi humane tumorer af 500 g eller større ikke nødvendigvis inducerer spilde [6].

systemiske metaboliske forstyrrelser, bemærkede i cancer kakeksi også observeret med andre former for systemisk inflammation [7]. Cytokiner, herunder tumornekrosefaktor (TNF) /cachectin, interleukin (IL) -1α, IL-1β, interferon-γ og IL-6 er blevet impliceret i cachexia både gennem eksperimentel manipulation i musemodeller og ved association af serumniveauer i patienter med kakeksi [6], [7]. IL-6 er et multifunktionelt cytokin, der indgår i en række forskellige værtsforsvar og patologiske processer [8]. Andre, og vi har vist, at IL-6 administration til mus er tilstrækkelig til at inducere spild af muskler og fedt butikker og i de mest alvorlige tilfælde, sidst død [9], [10], [11], [12], [13] , [14]. Samt, IL-6 spiller en væsentlig rolle ved fremkaldelse kakeksi i mus med colon-26 cancercellelinje og livmoderkræft linje, Yomoto, som administration af IL-6 blokeringsmidler reducerer muskelsvind i disse modeller [15], [ ,,,0],16], [17], [18]. Serum IL-6 er en følsom indikator af vægttab, også i patienter med fremskreden småcellet lungecancer [19] og tyktarmskræft [20]. IL-6 og andre gp130 ligander, såsom LIF og CNTF menes at mediere kakeksi ved en kombination af anoreksi, lipid katabolisme, insulinresistens, og virkninger på proteinsyntesen og nedbrydning. Imidlertid er de molekylære veje, der reguleres af IL-6 i skeletmuskler, der fører til muskelsvind er ukendte.

IL-6 virker på celler ved at binde IL-6-receptor α-kæde (IL-6Ra), også kendt som gp80, enten i sin membranbundet eller opløselig form, inducere dimerisering af gp130 og aktivering af dens tilknyttede Janus-kinaser (Jaks), som tyrosin phosphorylerer gp130 [21]. Disse begivenheder resulterer i aktiveringen af ​​to store signalveje, STAT3, og mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK /ERK) kaskade. STAT3-aktivering ved tyrosinphosphorylering fører til dimerisering og nuklear translokation, DNA-binding og modulering af genekspression. I samarbejde med c-Jun og forskellige former for transskriptionsfaktoren CAAT enhancer-bindende protein (C /EBP), IL-6-signalering gennem STAT3 opregulerer akutfaserespons protein genekspression i leveren. Den akutte fase respons er en generaliseret respons det medfødte immunsystem, der består af omkring 40 gener opreguleret op til flere tusinde gange ved stimulation [22].

Tisdale og Fearon med kolleger har knyttet kræft kakeksi med vedvarende forhøjede akutte fase respons proteiner i serum [23], [24], [25]. Ca. 50% af alle kræftpatienter demonstrere øget serum akutte fase respons proteiner på tidspunktet for kræft diagnose, og procentdelen af ​​kræftpatienter med en forhøjet serum akut fase respons stiger med sygdomsbyrden og scene [24], [26]. Forhøjede niveauer af fibrinogen observeres i mange maligniteter, herunder lunge- og melanom, og forøget ekspression korrelerer med en dyster resultat [27], [28]. Nuværende modeller postulere, at tumor og vært afledte faktorer fremkalde proteolyse for at brændstof en kronisk hepatisk akutte fase respons. Produktion af akutfaserespons proteiner i leveren kræver katabolisme af strukturelle proteiner i skeletmuskulatur som en kilde til aminosyrer. I betragtning af forskellene i aminosyresekvens udnyttelse i muskelproteiner versus akutfasereaktanter, op til 2,6 g muskelprotein eller 12 g muskelvæv kan være spildt at syntetisere 1 g akutfaserespons proteiner [29].

Vi forsøgt at bestemme potentielle sammenhænge mellem forhøjede cytokiner, den akutte fase respons og spilder i kræft. Her rapporterer vi karakterisering af serumcytokiner og musklen transkriptomet i colon-26 adenocarcinom model af cancer kakeksi. Vi leverer dokumentation for STAT3 aktivering, target genekspression og den akutte fase respons i både lever og skeletmuskulatur i disse mus, hvilket giver en molekylær forbindelse mellem disse observerede fænomener.

Resultater

Colon26 model cancer kakeksi

Implantation af colon-26 (C26) adenocarcinom celler i Balb /c eller CD2F1 mus er en klassisk model af kræft kakeksi [30], [31]. Som i de fleste kræftpatienter, er fødeindtagelse ikke reduceret i C26 cachexia og IL-6 niveauer er forhøjede [30]. Interventioner, der reducerer IL-6 i denne model også hæmme spilde [15], [16], [17], [18]. I vores hænder, CD2F1 hunmus injiceret med C26 celler oplevet progressive fald i kroppens samlede vægt (figur 1A-B). Mus blev aflivet ved 10% vægttab (19 dage efter injektion) og 15% vægttab (24 dage), hvilket afspejler moderat og svær kakeksi. Faldet i total legemsvægt var ledsaget af en forholdsmæssigt større tab af muskelmasse (figur 1C). Quadriceps vægttab 23,7% (

s

0,001 vs. PBS-injicerede kontroller) i moderat kakektiske mus og 24,4% (

s

0,001) hos svært kakektiske mus. Ligeledes gastrocnemius muskel vægte faldt 25,2% (

s

0,001) i moderat kakeksi og 30,0% (

s

0,001) i alvorlige kakeksi. Sådanne fald i muskelmasse er kendt for at skyldes forøget proteinnedbrydning på grund af en aktivering af den proteolytiske maskiner [32] og fra tab af specifikke muskelproteiner, såsom Myosin tung kæde (MyHC) [33]. I overensstemmelse med et tab i muskel protein, blev opløselige quadriceps proteinindhold (der målt i standard proteinekstrakter) reduceret i begge sygdomstilstande (Figur 1G). Desuden MyHC blev reduceret betydeligt i både moderat (-69%, p 0,01) og svær (-81%, p 0,01). Kakeksi (Figur 1E-F)

A, B, ændringer i legemsvægt for kontrolmus og for mus injiceret med C26 tumorceller. Mus aflivet på dag 19 havde mistet ca. 10% kropsvægt, betragtes som moderat kakeksi. Mus aflivet på dag 24 havde mistet -15% legemsvægt, anset for alvorlige kakeksi. C, faldt betydeligt quadriceps og gastrocnemius vægte blev observeret med C26 kakeksi. Forskelle var ikke signifikant i musklerne fra moderat versus svær kakeksi. D, Lever vægt og tumorvægt steg begge med sværhedsgraden /varighed kakeksi. E, repræsentant Western blotting for Myosin tung kæde (MyHC) i quadriceps muskel fra både kontrol- og tumor- bærende mus. F, Densitometrisk kvantificering af Western blotting for MyHC protein viser en markant reduktion i både moderat (-69% vs. kontroller) og svær (-81% vs. kontroller) kakeksi. G, samlede proteinindhold i quadriceps muskel fra kontrol- og tumorbærende mus. Proteinindholdet signifikant reduceret i både moderat (-7% vs. kontroller) og alvorlig (-13% versus kontroller). n = 4-5 pr gruppe; ** P 0,01, *** P. 0,001

I modsætning til muskelsvind, total lever masse steg 17,3% (

s

0,01) i moderat kakeksi og 36,4% (

s

0,001) i alvorlige kakeksi (Figur 1D). Tumorstørrelse også steget med tiden og spilder (figur 1D), som gjorde milt størrelse (data ikke vist).

Plasma analyt profilering af både moderat og alvorlig kakektiske mus viste, at cirkulerende niveauer af IL-6 og tre andre gp130 ligander, IL-11, leukæmi-hæmmende faktor (LIF) og Oncostatin M blev øget betydeligt i tumor-bærende mus (tabel 1). Niveauer af tumornekrosefaktor (TNF), IFN-y og IL-1a, tre andre cytokiner ofte forbundet med kakeksi, blev signifikant forhøjede samt. Serumniveauer af IL-6 responsive akutfasereaktanter fibrinogen, haptoglobin og Von Willebrand Faktor blev også markant induceret som respons på tumoren. Modsætning til i human, C-reaktivt protein (CRP) er ikke en akut fase-protein i mus og var ikke forhøjet i kakeksi. Denne forhøjelse af plasma-IL-6 og de akutfaserespons proteiner, kombineret med stigningen i leveren masse er i overensstemmelse med de kendte virkninger af IL-6 i mediering af hepatisk akutfaserespons [13], [34], [35], [36], [37]. Disse resultater i mus med C26 tumorer parallelt foreningen af ​​IL-6 og akut fase reaktion med muskelsvind hos kræftpatienter.

Transskription profil af C26 model af kræft kakeksi

Vi søgte at identificere ændringer i muskel genekspression forbundet med at spilde. Microarray analyse og data normalisering blev udført på RNA isoleret fra quadriceps af mus med moderat eller svær C26 kakeksi og ikke-tumorbærende kontroller. Uovervåget hierarkisk klassificering af prøverne klart adskiller kontrol muskel, moderat spildt og alvorligt spildte prøver (figur 2A).

A, Heat kort over lårmusklen genekspression i C26 kakeksi viser tydelig gruppering af gener ved forsøgsgrupper. Prøverne er normaliseret til kontrollerne. Blå angiver down-regulerede gener, gule up-regulerede gener og sort ingen ændring. Kun gener med

P

0,05 af envejs ANOVA vises. B, Sammenligning af genekspression i moderat og svær C26 cachexia (NextBio).

Statistisk analyse blev udført for at identificere gener, der udviser betydelige ændringer i ekspression under kakeksi. Blandt 45,281 transkripter fandtes 1607 gener, der skal udtrykkes forskelligt i moderat kakeksi og 1328 i alvorlig wasting (-2≤ gange ændring ≥2,

s Restaurant 0,05) (Figur 2B). Samlet blev 700 gener udtrykt i almindelige i moderat og svær kakeksi, som alle, bortset 5 blev reguleret i samme retning i begge grupper (Tabel S2). De øverste 30 gener ved fold-ændring reguleret i hver af moderat og svær kakeksi er vist i tabel 2 og 3. Af de resterende 907 var enestående til moderat kakeksi (tabel S3) og 628 til svær kakeksi (tabel S4). Ligheden af ​​genekspression mellem de to grupper var stærkt signifikant (

s

= 1,0 e-323). På trods af de mange væsentligt ændrede gener, de fleste gener almindeligvis anses for at være “husholdning” gener og anvendes til normalisering strategier var ikke forskellige blandt grupper. Specifikt gylceraldehyde-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), beta-actin (ACTB), b-actin (ACTB), 18S RNA (RN18S), aldolase (ALDOA, ALDOB, ALDOC) og de fleste tubulins (TUBA2, TUBB1, TUBB2a, TUBB2c, TUBB3, TUBB4, TUBG1, TUBG) var uændret.

regulatoriske gener

kendt muskel vækst

muskel spild af stort set alle ætiologier er forbundet med øget ekspression af skeletmuskulatur ubiquitin E3 ligaser, Trim63 /Murf-1 og Fbxo32 /Atrogin-1 [38], [39], [40]. Begge blev markant forøget i vores microarray analyse, med en større stigning i Trim63 /Murf-1 versus Fbxo32 /Atrogin-1 og højere udtryk i moderat versus svær spilde (figur 3). Disse tendenser blev bekræftet ved kvantitativ real-time RT-PCR. Muskelatrofi er også forbundet med nedsat ekspression af RNA’er der koder for strukturelle proteiner. Faktisk ved microarray og QRT-PCR, hjerte alfa aktin og myosin tung kæde 8 blev nedreguleret, så meget mere i alvorlig versus moderat spilde. Disse resultater er i overensstemmelse med rapporter fra andre i C26 kakeksi [33].

A, Ekspression af ubiquitin ligaser, Fbxo32 /Atrogin-1 og Trim63 /MuRF1 er fremkaldt af microarray og qPCR-analyse. Ekspression af gener, der koder muskel strukturelle proteiner, herunder ACTA1 og MHY8 nedsættes. B, genekspressionsmønstre i C26 kakeksi afbildet på skematisk regulering muskel vækst pathways. Gener med demonstreret vækstfremmende aktivitet i muskler er vist i grøn, væksthæmmende gener i rødt. Tallet til venstre repræsenterer fold-ændring i moderat kakeksi og højre i alvorlige kakeksi, med pil, der angiver retningen af ​​ændringen. Gener med ingen værdier blev enten ikke ændret eller ikke til stede i datasættet.

Pathway analyse

For at identificere molekylære veje reguleres som respons på C26-induceret kakeksi, gen profiler fra quadriceps til kontrol, moderat og svær kakeksi blev analyseret ved anvendelse NextBio (figur 4). Af de 20 Broad MSigDB kanoniske veje opreguleret i både moderat og svær kolon-26 kakeksi, blev otte relateret til inflammation, herunder supplere og koagulationsveje, IL-6, STAT3, JAK-STAT, cytokin og Toll-lignende receptor pathways. Pathways forbindelse med proteasomet, mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK), cellecyklussen, muskelsammentrækning, epidermal vækstfaktor, ErbB og mTOR signalering blev ligeledes forhøjet.

A. De øverste 20 Broad MSigDB kanoniske veje markant opreguleret i moderat og svær kakeksi versus kontroller. Lyserøde barer (øvre akse) repræsenterer betydningen af ​​overlapningen. Trekanterne (moderat cachexia) og cirkler (svær kakeksi) (nedre akse) betegne antallet af gener differentielt udtrykt i denne pathway. Røde pile angiver veje relateret til IL-6 /STAT3 /inflammation. B, De øverste 20 Broad MSigDB kanoniske veje betydeligt nedreguleret i moderat og svær kakeksi versus kontroller. Grønne barer (øvre akser) repræsenterer betydningen af ​​overlap. Trekanterne (moderat kakeksi) og cirkler (svær kakeksi) (lavere akse) som ovenfor.

De øverste kanoniske veje nedreguleret var relateret til skeletmuskulatur sammentrækning, peroxisomproliferatoraktiveret receptor-γ coaktivator -1α, calcium regulering, ekstracellulære matrix-interaktioner, skeletal myogenese, og insulin og WNT signalering, blandt andre.

STAT3-aktivering og målgenekspression i C26 kakeksi

i betragtning af beskaffenheden af ​​cytokinet /IL-6 /STAT3 veje i microarray analyse, søgte vi at karakterisere ekspressionen af ​​STAT3 interagerende gener i vores model. Genomatix Bibliosphere blev brugt til at generere en liste over de 124 dokumenterede fysiske og funktionelle interaktioner med STAT3 i forskellige systemer (tabel S5). Af dem, viste 26 gener betydelig regulering i de moderate og alvorligt spildte prøver (figur 5A)

A:. Heat kort over genekspression ændringer Stat3 og co-citerede genprodukter, som identificeret af Genomatix Bibliosphere. Blå angiver ned regulerede gener, gul op reguleret, og sort ingen ændring. Kun gener med P 0,05 ved envejs ANOVA er vist. B: En delmængde af STAT3 målgener identificeret gennem litteraturen er forskelligt reguleret i moderate og svære kakeksi versus kontroller. C: STAT3 og dets målgener SOCS3 og CEBPD øges på mRNA niveau ved microarray og qPCR. D: Protein niveauer for p-STAT3 og STAT3 i proteinekstrakter fra quadriceps, gastrocnemius og lever evalueret ved Western blotting-analyse. E: SOCS3 proteinniveauer. F: kvantitativ analyse af p-STAT3 /STAT3 og p-STAT3 /GAPDH ratio (udtrykt som fold-ændring vs. kontroller). G: kvantitativ analyse af SOCS3 protein niveauer (udtrykt som fold-ændring vs. kontroller). GAPDH blev anvendt som en intern reference til at bekræfte lig belastning. n = 3-5 pr gruppe; * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 vs. Controls,

$ P. 0,05 vs. moderat

Vi spurgte også, om STAT3 målgener var også induceret. Undersøgelse af litteraturen resulterede i identifikationen af ​​186 validerede STAT3 målgener identificeret i flere forskellige arter og systemer (tabel S6) [41], [42], [43], [44], [45], [46]. Af dem, 39 blev udtrykt i enten moderat eller svær kakeksi eller begge (figur 5B).

Blandt de kendte STAT3 mål steg i quadriceps i moderat og alvorlig kakeksi var STAT3 selv og transkriptionsfaktoren CCAAT /enhancer-binding protein δ (C /EBP δ) [47]. Begge transkriptionsfaktorer deltage i induktion og vedligeholdelse af akutfaserespons genekspression, herunder fibrinogen, serum amyloid A, haptoglobin, og lipid-bindende protein [47] – [48] [22]. C /EEBPδ har også vist sig at inducere ekspression af myostatin [49], en negativ regulator af muskelmasse [3], [50]. Microarray resultater blev bekræftet af qPCR og demonstrerede robust induktion af STAT3, C /EBPδ og akutfaserespons gener i moderat og alvorlig kakeksi. STAT3 også vides at inducere ekspression af sine egne tilbagemeldinger inhibitor, Suppressor of Cytokine Signaling-3 (SOCS3). Faktisk SOCS3 blev øget på mRNA niveau i kakeksi (figur 5C).

Alt dette robuste STAT3 target genekspression foreslog, at STAT3 aktivitet blev forøget i kakeksi. STAT3 aktiveres delvist af phosphorylering på Y705, som inducerer dimerisering, nuklear translokation og DNA-binding [51], [52]. Western blotting analyse af muskel ekstrakter viste øget pY705-STAT3-niveauer i både quadriceps og gastrocnemius af mus der bærer C26 tumor, i både moderat og svær kakeksi (figur 5 D). Analogt blev en markant stigning i pY705-STAT3-niveauer observeret i leveren (figur 5 D-F). Interessant SOCS3 viste sig at være kun minimalt opreguleret på proteinniveauet i moderat kakeksi i quadriceps og slet ikke i quadriceps i alvorlig kakeksi, mens det blev nedreguleret i gastrocnemius prøver i både moderat og svær kakeksi (figur 5 E- G). I modsætning hertil SOCS3 var uændret i leverprøver fra både kontrol- og kakektiske mus (Figur 5 E-G). I overensstemmelse med øget muskel pY705-STAT3 niveauer samlet øget nuklear pSTAT3 niveauer og myonuclei lokalisering blev observeret i muskler fra mus med C26 kakeksi (figur 6A-B).

A, p-STAT3 protein niveauer øges i nukleare ekstrakter fremstillet ud fra quadriceps af alvorligt kakektiske C26 tumor-bærende mus sammenlignet med kontroller. n = 5 pr gruppe. B, Immunofluorescensanalyse udførte afslører øget pSTAT3 lokalisering i myonuclei af gastrocnemius fra alvorligt kakektiske C26 tumor-gearing mus (grøn). Nuklear farvning er vist i blåt (DAPI).

Skeletmuskler er en stor bidragyder til akutte fase respons produktion

I betragtning af den robuste induktion af akut fase gen RNA i kakeksi (figur 5 ), søgte vi at bekræfte ekspression på proteinniveauet. Ved Western blotting-analyse, blev niveauer af det secernerede protein fibrinogen i quadriceps ekstrakter steg 2-12 gange i mus med C26 cachexia i forhold til kontroller, afhængigt af, hvilket bånd er kvantificeret (figur 7A). I leveren blev der fibrinogen proteinniveauer forøges 2-5 fold (figur 7A). Måling fibrinogen signal mod en standardkurve af oprenset murint fibrinogen, normale quadriceps indeholdt ca. 0,9 ng fibrinogen pr ug protein, mens quadriceps i C26 kakeksi indeholdt 1,9 ng /ug (figur 7B), et ~ 2-fold stigning. Normal lever indeholdt 1,8 ng /ug fibrinogen, mens leveren i C26 kakeksi indeholdt 5,2 ng /ug fibrinogen, et -3-fold stigning. Fibrinogen ekspression blev også forøget i quadriceps samt leveren som reaktion på indgivelse af IL-6 (figur 7B), hvilket antyder dette kan være en generel respons på betingelser med høj IL-6 og ikke begrænset til, cancer.

EN. Western blotting og kvantificering af fibrinogen niveauer i kontrol og C26 quadriceps og lever. Data (middelværdi ± SEM) er udtrykt som relativ densitometri værdi. ** P 0,01, *** P 0,001. B, Western blotting-analyse af fibrinogen standard proteiner og quadriceps og lever ekstrakter til kontrol, CHO-IL6 injicerede nøgne mus og C26 injiceret CD2F1 mus. Kvantificering blev udført på båndet vist med pilen. Data (betyder ± SEM) er udtrykt som ng fibrinogen /ug protein. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001. C, demonstrerer Western blotting analyse signifikant øget fibrinogen og SAA1 protein niveauer i quadriceps og gastrocnemius i moderat og svær C26 kakeksi. * P 0,05, ** P 0,01, *** P. 0,001

Disse resultater i figur 7A og 7B viser, at størrelsen af ​​fibrinogen induktion og syntese i quadriceps svarer til den i leveren. Fibrinogen ekspression blev også øget i gastrocnemius i moderat og svær kakeksi (Figur 7C), hvilket indikerer, at fibrinogen sandsynligvis bredt udtrykt i skeletmuskulatur. Proteinniveauer af SAA1 blev også forøget i quadriceps og gastrocnemius ved Western blotting-analyse, hvilket antyder, at skeletmuskel kan udtrykke proteiner til de fleste eller alle de akutfaserespons gener induceret ved mRNA-niveauet.

Dyrkede skelet muskelfibre ekspres akutfaserespons proteiner i respons på IL-6 eller STAT3-aktivering

trods induktionen af ​​fibrinogen og SAA mRNA i musklen, protein niveauer af akutfaseproteiner i skeletmuskler ekstrakter teoretisk kunne skyldes kontaminerende plasma. For yderligere at teste hypotesen, at fibrinogen produceres direkte fra skeletmuskel efter aktivering af IL-6 /STAT3 pathway, vi inficerede C2C12 murine myotube kulturer med en rekombinant adenovirus, der udtrykker en konstitutivt aktiveret form af STAT3, cSTAT3 [53], sammen med GFP som en markør. Western blotting af C2C12 ekstrakter 48h efter infektion viste betydelig forhøjelse af fibrogen i Ad-cSTAT3-GFP kulturer versus Ad-GFP kulturer (+ 86% vs. GFP, s 0,01, figur 8A). For at bestemme, om fibrinogen blev fremstillet efter IL-6 udfordrende, blev C2C12 myorør eksponeret på murint rekombinant IL-6 i op til 48 timer. Dette resulterede i en samlet stigning i fibrinogen, både i det cellulære rum ved Western blotting (figur 8B) og i dyrkningsmediet ved ELISA (figur 8C). Disse forsøg viser, at selv i fravær af andre celletyper og væv, skeletmuskelceller reagerer på IL-6 og aktivering af STAT3 ved at syntetisere akutfaseprotein RNA’er og proteiner til sekretion.

A, Western blotting-analyse og kvantificering af fibrinogen i C2C12 myorør inficeret med Ad-cSTAT3-GFP eller Ad-GFP som kontrol. Fibrinogen udtryk blev øget i overensstemmelse med stigningen i niveauet af STAT3. ** P 0,01, *** P 0,001 vs. GFP. B, Western blotting-analyse og kvantificering af fibrinogen ekspression i C2C12 behandlet med IL-6 (100 ng /ml) i 1, 24, 48 timer. GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. Forøget ekspression af fibrinogen blev observeret ved hvert tidspunkt efter IL-6 behandling. Data (betyder ± SEM) er udtrykt som relativ densitometri værdi. *** P 0,001 vs. respektive kontroller. C, fibrinogen niveauet med ELISA af det konditionerede medium af C2C12 udsat for IL-6 i 30 min, 1, 6, 24, 48 timer. Fibrinogen-niveauer blev signifikant forhøjet efter 6, 24 og 48 timer af IL-6 behandling. Data (middelværdi ± SEM) er udtrykt som ng /ml. ** P 0,01, *** P. 0,001 vs. kontrol (C)

Diskussion

Vi søgte at efterligne den høje serum IL-6, akut fase respons og muskelsvind af patienter med cancer kakeksi. Vi valgte C26 adenocarcinom, som udviser forøget cirkulerende niveauer af IL-6, der falder sammen med muskelsvind [15]. Visse kloner af C26, som ikke forårsager kakeksi coincidently ikke producerer IL-6 [54], [55], [56]. I overensstemmelse med en forårsagende rolle i muskelsvind hos mennesker, cirkulerende IL-6 er blevet rapporteret at være en markør for vægttab hos patienter ramt af forskellige former for cancer [19]. Endvidere direkte administration af IL-6 til mus inducerer systemisk muskeltab. Konsistensen af ​​sådan muskelsvind tværs af forskellige ruter af IL-6 administration, herunder ved direkte injektion af rekombinant IL-6 [11], ved transgenese [57], ved implantation af osmotisk pumpe leverer rekombinant IL-6 [13], ved injektion af IL-6 udtrykkende CHO-celler i athymiske nøgne mus [12] – [13], og ved transfektion af plasmid-DNA, der koder IL-6 [14], [58], vidner om styrken, hvorved IL-6 forårsager kakektiske fænotype .

Uanset, IL-6 er sandsynligvis ikke den eneste cytokin, som medierer muskelsvind i cancer eller endog i C26-modellen. Inhibering af IL-6 kun delvist redder muskelsvind i C26-modellen, hvilket fik nogle til at konkludere, at IL-6 er kun en af ​​flere aktører i C26-modellen og kan ikke i sig selv inducerer den fulde kakektiske syndrom [16]. De andre cytokiner vi observerede øgede i C26 mus, der ligeledes kan spille en rolle i muskelsvind omfatter IL-6-familie-ligander såsom LIF, samt TNF-a, IFN-gamma, som alle kan inducere kakeksi uafhængigt. Zhou et al. nylig hypotese IL-6 kan tjene kun en marginal rolle i kakeksi [59]. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser [60], de rapporterede, at myostatin inhibering under anvendelse af en opløselig receptor-fusionsprotein udviklet af Lee et al. [61] reduceres muskeltab i C26-modellen. Serum IL-6-niveauer i sådanne mus var ikke forskellig fra kontrol- behandlede C26 mus. Såvel, forfatterne var ikke i stand til at inducere muskeltab i mus indgivet rekombinant IL-6 ved osmotisk pumpe. De konkluderer, at muskel udtynding i kræft kakeksi kan afhænge af myostatin og relaterede ligander snarere end på pro-inflammatoriske cytokiner alene. En alternativ fortolkning af disse data, er imidlertid, at myostatin inhibering resulterer i muskel hypertrofi, der afbalancerer IL-6 eller andre cytokin-induceret muskelsvind. For det andet er det også sandsynligt, at forfatterne ikke opnå en tilstrækkelig dosis af IL-6 til virkning wasting. De brugte humant IL-6, der har en 5- til 10 gange lavere aktivitet end murint IL-6 på murine celler [62], ved niveauer 40-60 gange mindre end dem rapporteret at inducere alvorlige wasting [13]. (ED

50 til rekombinant humant IL-6 i T1165.85.2.1 muse plasmacytoma assay er 0,2-0,8 ng /ml, mens det er 0,02-0,06 ng /ml for rekombinant murint IL-6.) Således den overvægt af beviser indikerer, at IL-6 kan forårsage muskelsvind. Om effekten er direkte eller indirekte er stadig uklart, og hvilken mekanisme fører til muskelsvind er stadig ukendt.

Her er vi dokumentere, at STAT3 pathway aktiveres i skeletmuskulaturen i C26-bærende mus, og at ekspressionen af ​​STAT3 mål