PLoS ONE: ændringer i genekspression og Cellular Arkitektur i en kræft i æggestokkene Progression Model

Abstrakt

Baggrund

Kræft i æggestokkene er den femte hyppigste årsag til kræftdødsfald blandt kvinder. Tidligt stadium sygdommen ofte forbliver uopdaget grund af manglende symptomer og pålidelige biomarkører. Identifikationen af ​​tidlige genetiske ændringer kunne give indsigt i nye signalveje, der kan udnyttes til tidlig påvisning og behandling.

Metode /vigtigste resultater

Mus æggestokkene overflade epitel (Mose) celler blev anvendt til identificere stage-afhængige ændringer i genekspression niveauer og signaltransduktionsveje af muse hele genomet microarray analyser og gen ontologi. Disse celler har gennemgået spontan transformation i cellekultur og skiftet fra ikke-tumorigent til mellemliggende og aggressive, maligne fænotyper. Markant ændrede gener overrepræsenteret i en række veje, især cytoskelettet funktionelle kategori. Samtidig med genekspression ændringer, den cytoskeletale arkitektur blev gradvist uorganiseret, hvilket resulterer i afvigende udtryk eller subcellulær fordeling af vigtige cytoskeletale regulatoriske proteiner (fokal vedhæftning kinase, α-actinin, og vinculin). Den cytoskeletale forvaltningsmæssigt blev ledsaget af ændrede mønstre af serin og tyrosinphosphorylering samt ændrede udtryk og subcellulære lokalisering af integreret signalsystemer mellemprodukter APC og PKCβII.

Konklusioner /Betydning

Vores undersøgelser har identificeret gener, der er afvigende udtryk under MOSE celle neoplastisk progression. Vi viser, at tidlig fase dysregulering af actin mikrofilamenter efterfølges af progressiv forvaltningsmæssigt af mikrotubuli og intermediære filamenter på senere stadier. Disse fase-specifikke, trinvise ændringer give yderligere indsigt i den tid og rumforløb af begivenheder, der fører til den fuldt transformerede tilstand, da disse ændringer også observeres i aggressive humane ovarie cancer cellelinjer uanset deres histologiske type. Desuden støtter vores undersøgelser en sammenhæng mellem afvigende cytoskelet organisering og regulering af vigtige downstream signalering begivenheder, der kan være involveret i kræft progression. Således er vores MOSE-afledt celle model repræsenterer en unik model for i dybden mekanistiske studier af kræft i æggestokkene progression

Henvisning:. Creekmore AL, Silkworth WT, Cimini D, Jensen RV, Roberts PC, Schmelz EM (2011) ændringer i genekspression og Cellular Arkitektur i en kræft i æggestokkene Progression Model. PLoS ONE 6 (3): e17676. doi: 10,1371 /journal.pone.0017676

Redaktør: Robert Oshima, Sanford-Burnham Medical Research Institute, USA

Modtaget: November 12, 2010; Accepteret: 8. februar 2011; Udgivet: 3 marts 2011

Copyright: © 2011 Creekmore et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelserne blev støttet af NIH R01 CA118846 (til EMS, PCR) og AICR indrømmer 04B071 (EMS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ovariecancerpatienter udgør kun 3% af diagnosticerede kræft, men er den femte hyppigste årsag til kræftdødsfald blandt kvinde, med fem-års overlevelse satser på kun 45 [1]%. Den gennemsnitlige alder ved diagnose er 63 år, og de fleste patienter (62%) til stede med metastatisk sygdom på tidspunktet for diagnose [1]. Kræft i æggestokkene er en heterogen sygdom med forskellige historikere eller klinisk-patologiske undertyper, der udvikler og nuværende forskelligt. Den traditionelle opfattelse er, at ca. 90% af ovariecancere er afledt af encellede lag af overfladen epitel, der omgiver [2] æggestok. Som ovarieepitelet forvandles til en malign fænotype, den skelner i flere undertyper, der er blevet kategoriseret i serøs, mucinous, endometrioide og clear cell carcinoma, baseret på deres morfologi snarere end deres genotype [3]. Men oprindelsen af ​​de enkelte undertyper kan variere og et højere bidrag fra æggeledere og endometriet til mere aggressive kræftformer er i øjeblikket i diskussion [4]. Oprindelsen af ​​både ovarie- og fallopian epitel er den samme, nemlig coelomic epitel [2], som kan bidrage til kontroverser.

Epiteliale ovariecancer viser en høj grad af genetisk heterogenitet som følge af mutationer, silencing, og sletninger. Da ændringer i genekspression, enten gennem mutation epigenetisk regulering, eller differentiel splejsning events, indflydelse tumorudvikling, progression, narkotika reaktionsevne og ultimativt overlevelsen af ​​patienten, identifikation af tumor subtype og dets genetiske fingeraftryk er afgørende. For nylig har en ny klassifikation af epitelial æggestokkræft i type I og type II kræftformer blevet foreslået: type 1 er godartede at borderline tumorer med relativt stabile genotyper mens type II omfatter aggressive og høje kvalitet tumorer, der er genetisk ustabile og udviser betydelige genetiske ændringer [ ,,,0],5]. De fleste epitelial kræft følge en progression ordning, hvor indledt celler videre til adenomer til adenokarcinomer og metastase, akkumulere genetiske ændringer i en trinvis måde under progression [6]. Denne sekvens er også blevet beskrevet for lav kvalitet ovariecarcinomer; Det er imidlertid drøftet hvis alle ovariecancer følge denne kræft udvikling siden forstadielæsioner for de mest aggressive ovarietumorer (type II) ikke er blevet endeligt identificeret [5]. For nylig, Lee et al. har foreslået, at fimbria af æggelederen kan være oprindelsen til “Type II” serøse carcinomer celler [7]. De foreslår, at type II tumorer opstår fra “p53 signatur” forstadielæsioner stammer fra amplifikation af sekretoriske epitelceller. Efterfølgende mutationer derefter lette progression til serøs tubal intraepithelial karcinom og i sidste ende til serøs karcinom.

I øjeblikket har genekspressionsmønstre kun været anvendt med succes til at skelne mellem mucinøs og klar celle fra serøse carcinomer [8] eller mellem lav kvalitet , lave maligne potentiale og høj kvalitet, metastatiske tumorer [9], [10], [11]. Pålidelige molekylære eller kliniske markører til at identificere ændringer i de tidlige stadier af progression er endnu ikke etableret, og siden de tidlige stadier af sygdommen er relativt asymptomatisk diagnosen ofte kun sker ved sene stadier. Derfor karakterisering af genekspression profiler af tidlige stadie precursor læsioner af kræft i æggestokkene kan give ny indsigt og identificere nye mål for forebyggende og behandlende indsats.

Vi har tidligere udviklet og karakteriseret en celle model af epitelial ovariecancer progression at undersøge sekvensen af ​​begivenheder, der fører til epitel ovariecancer [12]. De syngene mus æggestokkene overflade epitel (MOSE) celler, der stammer fra C57BL6 mus, har gennemgået spontan transformation i cellekultur. De heterogene mose celler undergår forskellige fænotypiske ændringer, da de hele tiden er passeret i kultur, med tidlige passager, der repræsenterer en præmaligne, ikke-tumorigen fænotype, mellemliggende passager, der repræsenterer en overgangsperiode fænotype, og senere passager udvikler sig til en særdeles aggressiv maligne fænotype, når det administreres til immunkompetente mus . Overgangsbestemmelser tilstande af progression var skelnes ved ændringer i vækstraterne, celle størrelse, tab af kontakt hæmning af vækst, og evnen til at vokse som sfæroider under ikke-klæbende betingelser. Vigtigere, både MOSE-I (mellemprodukt passage) og MOSE-L (sen passage) celler har også fået evnen til at danne tumorer, når de injiceres i den peritoneale kavitet af syngene immunokompetente mus, omend førstnævnte var mindre invasiv [12].

i den foreliggende undersøgelse identificerede vi signifikante ændringer i genekspression mønstre som ikke-transformerede MOSE-afledte celler overgang til mere aggressive fænotyper og anvendte gen ontologi værktøjer til at bestemme deres funktionelle kategorier. De overgangsordninger tilstande af denne model tillod os at identificere stage-afhængige gener, genprodukter og signaltransduktionsveje involveret i æggestokkene tumorudvikling. Her fremhæver vi progressive forandringer, der fører til en meget dysreguleret cytoskelet. Mange af disse ændringer blev bekræftet i arkiverede menneskelige æggestokkene kræft microarray datasæt. Vigtigere, demonstrerer vi, at cytoskeleton forvaltningsmæssigt kan have dybtgående virkninger på den subcellulære lokalisering af vigtige signalsystemer mellemprodukter, som i sidste ende kan føre til modulerede signalveje, der bidrager til æggestokkene udvikling af kræft. Disse gener, deres genprodukter og de tilhørende signalveje kan repræsentere nye mål for tidlig indgriben af ​​neoplastisk progression.

Resultater

Differentielt regulerede gener i mus æggestokkræft progression

Til identificere genekspression forandringer under progressionen af ​​epitelial ovariecancer og bestemme potentielle fase-specifikke mønstre, brugte vi hele genomet microarray analyse at sammenligne genekspressionsniveauer i celler repræsenterer benign (MOSE-E), mellemprodukt (MOSE-i), og maligne ( MOSE-L) faser af muse ovariecancer. Tre biologiske gentagelser blev brugt til at tage variationer konto i heterogene kulturer. Af de 45,102 probesæt på microarray (som repræsenterer 18,136 kommenterede gener), blev 960 probesæt sig at være betydeligt opreguleret (701 kommenterede gener) og 1006 var signifikant nedreguleret (711 kommenterede gener) større end 2 gange (p≤ 0,05) mellem MOSE-E og MOSE-L-celler. Af disse 1966 skiftende probesæt, 58,9% udviste ingen signifikant ændring i ekspressionsniveauer under progressionen mellem MOSE-E og MOSE-I, der angiver de fleste af ændringer i genekspression er forbundet med senere begivenheder i ondartet udvikling i vores model, med 608 stigende og 549 faldende som celler overgangen fra MOSE-i til Mose-L. I modsætning hertil 33,3% af de berørte gener viste en progressiv stigning (272 probe sæt) eller fald (382 probe sæt) i udtryk som celler overgang fra MOSE-E til Mose-I til Mose-L-celler (figur 1). Et lille antal af berørte sonder sæt, 3,9%, demonstrerede MOSE-I /MOSE-E ratio, der var inden for 0,4 fold af MOSE-L /MOSE-E ratio, hvilket indikerer, at disse genekspression ændringer kan være forbundet med meget tidlige begivenheder i maligne progression af vores celler. Sammen indikerer disse data, at de fleste af de ændringer i genekspression niveauer enten forekommer kontinuerligt, på en trinvis måde, hele udviklingen af ​​vores model eller finde sted i senere stadier mens kun en begrænset delmængde ændring under tidlige stadier. Det fuldstændige datasæt findes i GEO database (GSE24789).

Af 45,102 probe sæt analyserede, 970 var signifikant (p ≤ 0,05) opreguleret (A) og 1006 blev nedreguleret (B ) større end to gange. Pile angiver ekspressionsmønster ændrer sig med antallet af probesæt angivet ved siden af ​​pilen. Probe sæt angivet som andre fulgte ikke de beskrevne mønstre.

overrepræsenteret gen ontologi kategorier i æggestokkræft progression

For at opdage veje, der kan bidrage til at fremme og progression af æggestokkene cancer blev Gene Trail program anvendes til at identificere de funktionelle grupper af gener, der demonstrerer statistisk signifikante ændringer i deres ekspressionsniveauer mellem MOSE-E og MOSE-L-celler. Gene Trail er en avanceret gen sæt berigelse analyseværktøj, der bestemmer over-repræsenteret gen ontologi kategorier datasæt [13]. Den overrepræsenterede cellulær komponent, biologisk proces, og molekylære funktion gen ontologi kategorier findes i MOSE-L versus MOSE-E differentielt udtrykte gensæt er anført i tabel 1 (p 0,01). Overrepræsentation af gener i cellens cyklus og celleproliferation kategorier var forventet på grund af den tidligere rapporterede øget vækst i de MOSE-L-celler [12] og inddragelse af den ukontrollerede celledeling i kræft [14]. Interessant, cytoskelettet og Metal Ion /kation bindende kategorier repræsenterede et betydeligt antal af de differentielt udtrykte gener, med en betydelig overlapning af gener kategoriseret i begge disse ontologi kategorier. Men i modsætning til den brede vifte af funktioner af generne i metalionen /kation bindende kategorien gener udarbejdet i cytoskelettet genet ontologi kategori var funktionelt meget specifik. Da det menes, at ændringer i ekspressionsniveauerne af cytoskeletale proteiner og deres regulatorer er forbundet med progression og metastase [15], [16], [17], ændringer i gener involveret i strukturen og reguleringen af ​​cytoskelettet under progression af vores MOSE model var genstand for yderligere undersøgelse.

forvaltningsmæssigt af den cellulære cytoskelet under ondartet progression

actincytoskelettet.

af de 141 gener kategoriseret inden cytoskelettet gen ontologi kategori, 90 har genprodukter, der er underenheder af actinfilamenter (tabel 2), eller er involveret i organiseringen og reguleringen af ​​actincytoskelettet (tabel 3, komplet liste i supplerende tabel S1). For de fleste af disse gener, ekspressionsniveauer ændres gradvis på en trinvis måde som celler skiftet fra MOSE-E til Mose-I til Mose-L, indikerer, at disse ændringer er kontinuerligt igennem hele progression. Kun tre gener, γ-actin 1, formin 1, og drebrin 1, demonstrerede MOSE-I /MOSE-E ratio, der var inden for mindre end 0,4 fold af MOSE-L /MOSE-E ratio, hvilket tyder disse er tidlige ændringer i ondartet progression (tabel 2 og 3). Syv gener, herunder integrin-av, -β1, og -β2 viste ekspressionsniveauer, der ændres ved den største størrelsesorden i MOSE-I-celler, hvoraf to blev bekræftet ved QRT-PCR (tabel 2 og tabel 3). Et stort antal af disse gener er dysreguleret i kræft eller er involveret i metastaser herunder alle de 15 gener, der blev bekræftet af QRT-PCR (tabel 2 og 3).