PLoS ONE: Hæmning af proliferation og induktion af Autophagy af Atorvastatin i PC3 prostatacancerceller korrelerer med nedregulering af Bcl2 og opregulering af miR-182 og p21

Abstrakt

epidemiologisk sammenhæng mellem statin brug og nedsat risiko for fremskreden prostatacancer antyder, at statiner kan inhibere prostatakræft udvikling og /eller progression. Undersøgelser blev udført for at bestemme virkningerne af en model statin, atorvastatin (ATO), på proliferation og differentiering af prostata kræftceller, og for at identificere mulige mekanismer ATO handling. ATO inhiberede

in vitro

proliferation af både LNCaP og PC3 humane prostatacancerceller på en dosis- og tidsafhængig måde. Den større inhiberende aktivitet af ATO i PC3-celler var associeret med induktion af autofagi i denne cellelinie, som påvist ved forøget ekspression af LC3-II. MIR-182 blev konsekvent opreguleret af ATO i PC3-celler, men ikke i LNCaP-celler. ATO opregulering af miR-182 i PC3 celler var p53-uafhængig og blev vendt ved geranylgeraniol. Transfektion af MIR-182 inhibitorer nedsat ekspression af MIR-182 af 98% og svækkede den antiproliferative aktivitet af ATO. MIR-182 ekspression i PC3-celler blev også øget som reaktion på stress induceret af serum tilbagetrækning, hvilket antyder, at MIR-182 opregulering kan forekomme på grund af ernæringsmæssige stress. Bcl2 og p21 blev identificeret til at være potentielle mål gener af miR-182 i PC3 celler. BCL2 blev nedreguleret og p21 blev opreguleret i PC3-celler udsat for ATO. Disse data antyder, at MIR-182 kan være en stress-responsive miRNA der medierer ATO indsats prostatacancerceller

Henvisning:. Peng X, Li W, Yuan L, Mehta RG, Kopelovich L, McCormick DL (2013 ) Hæmning af proliferation og induktion af Autophagy af Atorvastatin i PC3 prostatacancerceller korrelerer med nedregulering af Bcl2 og opregulering af miR-182 og p21. PLoS ONE 8 (8): e70442. doi: 10,1371 /journal.pone.0070442

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: Marts 21, 2013; Accepteret: 18 juni 2013; Udgivet: 1. august, 2013 |

Copyright: © 2013 Peng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af kontrakt N01-CN-43303 fra afdelingen for Cancer Prevention, National Cancer Institute, Department of Health og Human Services. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Statiner anvendes bredt til forebyggelse og behandling af hypercholesterolæmi; den cholesterolsænkende aktivitet af statiner sker gennem deres inhibering af 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzym A (HMG-CoA) reduktase, et nøgleenzym i cholesterolbiosyntese [1], [2]. Ud over virkningerne på kolesterol biosyntesen, har statiner såsom atorvastatin (ATO) tiltrukket sig betydelig interesse for deres mulige værktøj til forebyggelse og terapi af kræft [3], [4].

Resultaterne af adskillige epidemiologiske undersøgelser og meta -analyser antyder et omvendt forhold mellem statin brug og prostatakræft risiko, især risikoen for fremskreden eller metastatisk prostatacancer [5], [6], [7]. De seneste data fra undersøgelser i forsøgsdyr prostatakræft modeller viser, at samtidig administration af statiner med andre agenter kan give additive eller synergistiske anticancer effekter [4], [8]. Flere potentielle mekanismer er blevet identificeret gennem hvilke statiner kan modulere kræft progression; disse mekanismer indbefatter inhibering af celleproliferation, induktion af autophagy og apoptose og inhibering af angiogenese [3], [9], [10]. Statiner er kraftige inhibitorer af mevalonat biosyntese [11], hvilket resulterer i inhiberingen af ​​protein prenylering; de antiproliferative og anticancer effekter af statiner kunne påvirkes gennem denne vej. Den specifikke biokemiske mekanisme (r), hvorigennem ATO og andre statiner udøve cancer forebyggende og /eller terapeutisk aktivitet i prostata stort set udefineret.

Autophagy er en cellulær proces, hvorigennem makromolekyler og organeller nedbrydes i perioder af cellulær stress i forbindelse med næringsstof sult, infektion, eller apoptose [9]. Nylige

in vitro

data viser, at ATO kan fremkalde autofagi og autofagi-associeret celledød i PC3 prostatacancerceller [9]. På dette grundlag induktionen af ​​autofagi tilvejebringer en potentiel mekanisme, gennem hvilken inhibering af prostatacancer progression af ATO kan udføres. I PC3 prostatacancerceller, ATO inducerer autophagic flux, cellecyklusstop og derefter celledød [9]. I denne proces vises induktion af autofagi at være et nødvendigt skridt før celledød [9], [12].

miRNA er små ikke-kodende RNA’er, der styrer genekspression ved at udløse translation undertrykkelse eller nedbrydning af mRNA [13], [14]. miRNA synes at være involveret i reguleringen af ​​en bred vifte af cellulære processer, og ændrede mønstre af miRNA-ekspression ses i en række patologiske tilstande. Akkumulerende tyder på, at miRNA udtryk ændres i kræft i flere steder, herunder prostata [15], [16], [17]; ændringer i ekspression af specifikke miRNAer kunne give en mekanisme, hvorigennem farmakologiske agenter og kosten manipulationer kan hæmme kræft induktion og /eller progression. Derudover kan miRNA være nyttige til karakterisering molekylære signaturer af neoplasmer [18] og til identificering af potentielle mål for udvikling af lægemidler mod cancer [19]. For eksempel er ekspression af miRNA i cancerceller moduleret ved kræftbehandling, såsom doxorubicin og trastuzumab [20], [21]. Tilsvarende kan modulation af miRNA ekspression ved kostkomponenter såsom folat, retinoider, og curcumin til grund deres cancer forebyggende aktiviteter [18]. På dette grundlag, vi hypotese, at ændringer i miRNA udtryk kunne være ansvarlig for, eller associeret med, ATO handling i prostata kræftceller, og at ændrede ekspression af specifikke miRNA er knyttet til induktion af autophagy ved ATO.

Materialer og metoder

Reagenser

Atorvastatin (ATO) blev leveret af kemoforebyggende middel Repository vedligeholdes af afdelingen for Cancer Prevention, National Cancer Institute, Rockville, MD. ATO blev opløst i DMSO (50 mM) og blev opbevaret ved -20 ° C før brug. Geranylgeraniol (GGOH), farnesol (FOH), CoQ10, squalen, og MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO ).

cellelinier, Cell Culture and Cell Proliferation Assay

Humane prostatacancerceller (PC3-celler og LNCaP-celler) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Underlinjer af PC3 celler (kloner 7, 19 og 20), der blev etableret gennem klonselektion [22] blev venligst stillet til rådighed af Dr. Ann R. Kennedy ved University of Pennsylvania. Alle prostatacancercellelinjer blev dyrket i RPMI-medium indeholdende 10% FBS. Celleproliferation blev kvantificeret under anvendelse af MTT-assayet eller krystalviolet (CV) assay eller ved direkte celletælling under anvendelse af en Z2 Coulter Particle Counter (Beckman Coulter, Brea, CA). Foreløbige undersøgelser udført i vores laboratorium har vist, at absorbansen (OD-værdi) for både MTT og CV-analyser er proportional med celle nummer.

Western blot analyse

Ved 40-50% Confluence, celler blev udsat for ATO i 24 timer, 48 timer eller 72 timer. Efter eksponering blev cellelysater fremstillet og 50 ug totalt protein blev påsat for Western blot-analyse. LC3-II-polyklonalt antistof blev købt hos Abgent (San Diego, CA). BCL2 og p21 muse monoklonale antistoffer var fra NeoMarker (Fremont, CA). Actin polyklonalt antistof og α-tubulin, p53 og PCNA monoklonale antistoffer og alle sekundære antistoffer blev købt hos Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA).

microarray analyse

PC3 og LNCaP-celler blev podet i dyrkningsskåle så cellerne nåede -30% konfluens på dag 2. på det tidspunkt, dyrkningsmediet blev udskiftet, og cellerne blev udsat for ATO (10 uM) i 24 timer. Totalt RNA, der skal anvendes i både mRNA og miRNA assays blev isoleret og oprenset ved anvendelse af Ribopure RNA-isolering (Invitrogen, Grand Island, NY). mRNA microarray og miRNA vifte profilering blev udført af slægten Biosystem (Northbrook, IL) ved hjælp af Agilent Menneskelige v2 GE 4x44K arrays og Agilent Menneskelig miRNA v14 rev.2 arrays henholdsvis; parallel microarray og miRNA blev udført under anvendelse af de samme samlede RNA-prøver. Data blev analyseret ved anvendelse af Agilent Feature Extraction og GeneSpring GX v7.3.1 softwarepakker. Microarray-filer til de 4 analyserede prøver i denne rapport findes på GEO, tiltrædelsen GSE46376.

Kvantitativ RT-PCR

Total RNA blev ekstraheret med Trizol reagens (Invitrogen), og mRNA-analyser blev udført som tidligere beskrevet [23]. To RT reaktioner for hver prøve blev puljet og fortyndet med en lige mængde DNase /RNase-frit vand. Real-time PCR blev udført med 2 pi fortyndet RT produkt i en MyiQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA) under anvendelse iQ ™ SYBR Green PCR Supermix (Bio-Rad) ifølge producentens anvisninger [24] . Genspecifikke primere blev udformet med Primer 3 (https://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). Actin blev anvendt som en reference-gen til normalisering af data. Fold induktioner blev beregnet ved hjælp af formlen 2

– (ΔΔCt), hvor ΔΔCt er ACt

(behandling) – ACt

(kontrol), ACt er Ct

(target-gen) – Ct

(actin) og Ct er den cyklus, hvor tærsklen krydses

for miRNA analyse blev 20 ng af total RNA anvendt til cDNA syntese af Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit (Invitrogen).; miRNA ekspressionsniveauer blev kvantificeret under anvendelse af Taqman MicroRNA assay (Invitrogen) ved at følge producentens instruktioner. Relative ekspressionsniveauer af miRNA blev normaliseret til U6 snRNA og beregnet som tidligere beskrevet [25].

miRNA Transfektion

miRNA transfektioner blev udført i PC3-celler under anvendelse lipofectomine 2000 (Invitrogen) ved at følge fabrikantens protokol . PC3-celler blev dyrket natten over i normalt vækstmedium, transficeres derefter med MIR-182 mimic (Sigma) eller MIR-182 inhibitor eller negativ kontrol i OPTI-MEM (Invitrogen) indeholdende 3% FBS i 18-28 timer. MiRNA mimic, inhibitor for MIR-182, og negativ kontrol (Invitrogen) blev hver anvendt i en slutkoncentration på 20 nM. Transficerede celler blev derefter dyrket i normalt vækstmedium med eller uden ATO behandling i forskellige tidsperioder.

Statistical Analysis

Normalt fordelt parametriske data er præsenteret som gennemsnit ± SD, og ​​blev analyseret ved Students t -test eller en-vejs ANOVA;

post-hoc

analyser blev udført ved hjælp af Tukey Multiple Sammenligning Test. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Software (San Diego, CA) og Microsoft Office Excel. Forskelle mellem midler blev anset for at være signifikante ved p. 0,05

Resultater

Differential Virkninger af atorvastatin i LNCaP og PC3 Prostata Cancer Cells

Når administreres i koncentrationer fra 0 -20 pM, ATO inhiberede celleproliferation i både LNCaP og PC3-celler på en dosis- og tidsafhængig måde; den laveste effektive dosis i begge cellelinier var 2,5 uM (data ikke vist). Repræsentative vækstkurver for LNCaP og PC3-celler dyrket i fravær og nærvær af ATO (10 uM) er tilvejebragt i fig. 1A. Ved en koncentration på 10 uM, ATO inducerede en kontinuerlig, tidsafhængig inhibering af LNCaP-celleproliferation i perioden 6-dages eksponering; ingen tegn på celledød blev set i LNCaP-celler udsat for ATO ved 10 uM for denne periode. I PC3-celler, blev ATO inhibering af celleproliferation ses på dag 2; betydelig celledød i PC3-celler blev set på dag 4 og 6, som celletal i ATO-behandlede grupper på disse tidspunkter var under antallet af celler oprindeligt podet. Disse data antyder, at (a) PC3 celler er mere følsomme over for ATO end er LNCaP-celler, og (b) de virkningsmekanismer for ATO i de to prostatakræft-cellelinier kan være anderledes.

(A) LNCaP og PC3-celler blev podet i plader med 6 brønde (36000 celler /brønd) og inkuberet natten over og derefter behandlet med DMSO (kontrol) eller 10 uM ATO i 2, 4 og 6 dage. Celleantal er udtrykt som gennemsnit ± SD, n = 3. (B) Mikroskopi af LNCaP og PC3-celler efter behandling with10 pM ATO i 2 og 4 dage. C: LNCaP og PC3-celler blev behandlet med 5 pM ATO i 24 og 48 timer blev cellelysater indsamles for LC3-II-ekspression analyse under anvendelse western blot. ATO induceret LC3-II-ekspression kun PC3 celler.

Virkningerne af ATO (10 uM) på celle tæthed og cellulær morfologi i LNCaP- og PC3 celler efter to og fire dages eksponering er vist i figur 1B. Morfologiske ændringer var til stede i både LNCaP og PC3 celler udsat for ATO; ændringer celletæthed var i overensstemmelse med ændringerne i celleantal rapporteret ovenfor. I processen med autophagosome dannelse, er cytosolisk mikrotubulus-associeret protein let kæde 3 (LC3) konjugeret med phosphatidylethanolamin (PE) ved sin carboxylterminal [26], [27]. Det konjugerede LC3 (identificeret som LC3-II) indsættes derefter i autophagic vesikelmembranen. LC3-II kan påvises ved immunblot eller immunfarvning, og er almindeligt anvendt som en biokemisk markør for cellulær autofagi [28], [29]. Brug af LC3-II som en biomarkør for autophagy, analyser western blot vist, at ATO induceret autofagi i PC3-celler, men ikke i LNCaP-celler (Fig. 1C). Disse resultater knytte induktion af autophagy af ATO i PC3 prostatacancerceller med celledød i disse celler; hverken autophagy eller celledød blev induceret af ATO i LNCaP celler.

Effekter af Atorvastatin på Cell Proliferation og LC3-II Expression i PC3 Celler

For at bekræfte sammenhængen mellem autophagy og celledød i PC3 prostata cancer celler udsat for ATO, vi først karakteriseret virkningerne af ATO på celletal i forældrenes PC3 celler og flere PC3 underlinjer [22]. Eksponering af forældrenes PC3 celler til ATO (5 uM) hæmmede celledeling med 38% på dag 2 (p 0,01) og 85% (p 0,001) på dag 4 (figur 2A.). Alle underlinjer (klon 19, 7 og 20) (. Figur 2B-D) var lydhøre over for ATO behandling, men PC3 klon 19 var mest følsom over for ATO blandt de tre testede kloner: efter to og fire dages udsættelse, ATO ( 5 uM) inhiberede proliferationen af ​​PC3-klon 19 celler med 70% og 95% (p 0,001 for begge sammenligninger;. figur 2B); hvorimod to andre kloner (klon 7 og 20) reagerede på ATO på en lignende måde som parentale celler med nogle variabilitet. Desuden blev signifikant celledød observeret i alle cellelinier på dag 4. Derfor forældre- og den mest følsomme klon blev udvalgt til yderligere karakterisering af LC3-II-ekspression. I begge PC3 parentale og PC3-klon 19 celler, ATO induceret LC3-II-ekspression i en tidsafhængig måde (figur 2E.); Men i de følsomme PC3-klon 19 celler, LC3-II demonstrerede hurtigere og kvantitativt større induktion af ATO. Disse data antyder, at ATO induceret autophagy aktivitet korrelerer med cellulær følsomhed i afhængighed af ATO, og at autofagi kan være involveret i celledød induceret af ATO i PC3-celler.

(A-D) PC3 parental (A) og PC3 klon 19 (B), 7 (C) og 20 (D) celler blev dyrket i plader med 6 brønde og behandlet med 5 pM ATO i 2 eller 4 dage. Celleantal er udtrykt som gennemsnit ± SD, n = 3. (C) PC3 parentale og PC3-klon 19-celler blev behandlet med 5 pM ATO side om side med proliferationsassayet (A B) i 24 timer, 48 timer eller 72 timer. Cellelysater blev indsamlet til western blot analyse af LC3-II-ekspression.

Effekter af Atorvastatin på genekspression i LNCaP og PC3 Cells (Microarray Studier og Pathway Analysis)

Microarray analyser var udført for at bestemme virkningerne af ATO på genekspression og miRNA ekspression i LNCaP og PC3-celler; side om side sammenligninger blev udført ved anvendelse af total RNA-prøver isoleret fra celler behandlet med ATO (10 μ M) i 24 timer. ATO induceret statistisk signifikante ændringer i ekspressionen af ​​1427 gener i LNCaP celler og 3755 gener i PC3 forældrenes celler (fig. S1). Kegg veje analyse af de 1427 differentielt udtrykte gener i LNCaP-celler identificerede 7 funktionelle veje, for hvilke den differentielle ekspression af komponent gener var statistisk signifikant på

s

≤0.01 (tabel S1). Nogle veje (

fx

, cholesterolbiosyntese, steroid biosyntese.) Var forudsigeligt ud fra den kendte aktivitet af ATO som en inhibitor af HMG-Co-A-reduktase; andre kan være specifikt relateret til den antiproliferative aktivitet af ATO i LNCaP celler. Som det kunne forventes, var et meget større antal ændrede funktionelle veje (46 veje) identificeres ved Kegg analyse af differentielt udtrykte gener i PC3 celler udsat for ATO (tabel S2). Ud over veje, der overlappede dem, der i LNCaP celler, ATO modulerede flere veje med klare forbindelser til celledeling og celledød; disse funktionelle veje inkluderet DNA-replikation, cellecyklus, og MAPK signalering.

Microarray Studies af atorvastatin og Mirna Expression I LNCaP Og PC3 Celler

ATO induceret differentieret ekspression af talrige miRNA i LNCaP og PC3 celler . Brug cutoff værdier på 1,5 for fold-change forskelle i udtryk og p 0,05 for statistisk signifikans blev 131 miRNA forskelligt udtrykt i LNCaP celler udsat for ATO, og 111 miRNA blev udtrykkes forskelligt i PC3 celler udsat for ATO (Fig S1.).

for at identificere miRNA hvis forskellen udtryk kunne ligge til grund for ATO cytotoksicitet i PC3 celler, en fold ændring cutoff af ≥2.00 blev anvendt på PC3 data, efterfulgt af fjernelse af miRNA hvis retningsbestemt ændringer i udtrykket var de samme i PC3 og LNCaP celler. Denne strategi er identificeret i alt 42 miRNA, der var forskelligt reguleret af ATO specifikt i PC3-celler (Tabel S3).

Mir-182 opreguleres Af Ato I Pc3 Celler

For at bekræfte miRNA array-data i PC3 celler blev QRT-PCR (Taqman teknik), der anvendes til at bekræfte den differentierede udtryk for tre miRNA (MIR-555, miR-654 og MIR-182) identificeret som opreguleret af ATO og tre miRNA (miR- 494, miR-1255a og miR-550a), der blev nedreguleret af ATO. Disse specifikke miRNA blev udvalgt til yderligere undersøgelse på grundlag af fold-change forskelle i udtryk set i microarray studier. MIR-182 (som blev opreguleret af fire gange i PC3-celler udsat for ATO) blev også valgt på grund af dens kendte forhold til celle stress [29].

ATO opregulering af MIR-182 i PC3-celler blev bekræftet ved QRT-PCR (figur 3A.); andre miRNA fandtes at kun udtrykkes ved meget lave niveauer, og ekspressionsniveauerne af disse miRNA viste betydelig variation mellem prøver. MIR-182-ekspression blev øget med 56% (p 0,01) ved 24 timer og 66% (p 0,01) efter 48 timer i PC3-celler udsat for ATO (figur 3A.). Derimod ATO nedreguleres MIR-182 i LNCaP-celler med 24% (p 0,01) efter 48 timer (fig 3B.). Disse data tyder på, at miR-182 regulering af ATO i prostatacancerceller er celle-specifikke, og at opregulering af miR-182 kan være involveret i ATO handling i PC3 celler.

(A) PC3 celler eksponeret for 5 uM ATO i 24 timer og 48 timer. Totalt RNA blev isoleret og udsat for Taqman QRT-PCR-analyse under anvendelse primersæt for MIR-182. (B) LNCaP-celler blev udsat for 5 uM ATO i 48 timer, efterfulgt af analyse af MIR-182-ekspression. Data er opsummeret fra 3 uafhængige forsøg og udtrykt som gennemsnit ± SD. ** P. 0,01

Mir-182 Opregulering By Ato I PC3 Celler Er faldende Efter Geranylgeraniol Co-behandling og er uafhængig af P53 Expression

Vi har tidligere rapporteret, at miR-182 er en stress-responsive miRNA i bryst epiteliale celler [29]. Da MIR-182 opreguleres ved ATO, og ATO kan forårsage cellulær stress ved at inhibere mevalonat biosyntese [3], [9], vi hypotese, at MIR-182 opregulering af ATO kan skyldes ATO-induceret cellulær stress. Hvis denne hypotese er korrekt, ville fjernelse af ATO stress omvendt miR-182 opregulering. For at evaluere denne hypotese blev MIR-182-ekspression kvantificeret i PC3-celler behandlet med ATO ± flere mevalonat metabolitter, hvis syntese inhiberes som følge af ATO undertrykkelse af mevalonat biosyntese. Agenter studerede inkluderet geranylgeraniol (GGOH), farnesol (FOH), co-enzym Q10 (co-enzym Q10), og squalen. I en indledende undersøgelse, kun GGOH vendt virkningerne af ATO på miR-182-ekspression i PC3 celler. På dette grundlag blev en endelig række forsøg udført ved hjælp GGOH og FOH. I overensstemmelse med resultaterne af den foreløbige undersøgelse, GGOH vendt effekten af ​​ATO på miR-182 udtryk; FOH havde nogen virkning (fig. 4A). Vi evaluerede også virkningen af ​​GGOH og FOH på ATO-medieret hæmning af celledeling og induktion af autofagi i PC3 celler. Som vist i fig. 4B, GGOH vendes også virkningen af ​​ATO på celleproliferation og LC3-II-ekspression; FOH havde ingen effekt. Disse data viser klart, at ATO-medieret inhibering af biosyntese af geranylgeraniol, men ikke farnesol, resulterer i opregulering af MIR-182, suppression af proliferation og induktion af autofagi.

(A) PC3-celler blev behandlet med 5 pM ATO i 48 timer i nærvær og fravær af metabolitter herunder geranylgeraniol (10 uM) og farnesol (10 uM) blev miR182 ekspression detekteres derefter ved QRT-PCR. (B) PC3-celler blev behandlet med 5 pM ATO til 2 eller 4 dage i nærvær og fravær af geranylgeraniol (10 uM) og farnesol (10 uM), celleproliferation (4 dages behandling) blev vurderet ved MTT-assay og LC3-II ekspression (2 dages behandling) undersøgt ved western blot. (C) PC3-celler blev dyrket i normalt vækstmedium (10% FBS) natten over, og blev derefter understreget ved dyrkning i lavt serum-medium (1% FBS) i 48 timer, efterfulgt af kvantificering af MIR-182-ekspression ved QRT-PCR. (D) p53-ekspression blev undersøgt ved western blot-analyse i PC3-celler, tjente MDA-MB-231 brystcancerceller som en positiv kontrol for p53-ekspression. For alle søjlediagrammer, er data udtrykt som gennemsnit ± SD; for QRT-PCR-analyser, n = 3; for MTT assay n = 8; * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001

Vi brugte en anden stress model – serum deprivation – at bestemme specificiteten af ​​MIR-182 reaktioner på ATO og til. afgøre, om miR-182-ekspression også blive styrket ved andre typer af stress i PC3 celler. PC3 celler blev dyrket i vækstmedium indeholdende 10% FBS, efterfulgt af dyrkning i to dage i vækstmedium, der kun indeholder 1% FBS. Serum afsavn i 2 dage steg miR-182-ekspression med 26% (p 0,001;. Figur 4C), hvilket tyder på, at miR-182 opregulering i PC3 celler induceret af forskellige typer af stressfaktorer

p53 er. anses for at være tæt forbundet med celle stress [30]. Fordi reguleringen af ​​MIR-182 for nylig er blevet rapporteret at være p53-afhængig [20], undersøgte vi niveauerne af p53-ekspression i PC3-celler med eller uden udsættelse for ATO. p53 protein udtrykkes ikke i PC3 celler under enten tilstand (fig. 4D), hvilket viser, at miR-182 regulering af ATO i PC3 celler er p53-uafhængig.

Ato Regulerer Bcl2 Og P21, som er potentielle mål for Mir-182 PC3 Celler

virkningerne af ATO på potentielle target gener af miR-182 blev undersøgt for at vurdere den hypotese, at ATO modulering af miR-182 udtryk inducerer ændringer i regulerende funktion. For at løse denne hypotese, Targetscan (https://www.targetscan.org/) og PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/) blev anvendt til at identificere potentielle målgener af MIR-182; generne identificeret ved hjælp af disse computersimulering programmer blev derefter screenet under anvendelse microarray data. Gennem denne iterative proces, blev identificeret 41 potentielle target gener af miR-182; 24 gener var opreguleret og 17 gener blev nedreguleret ved ATO (tabel S4).

Fordi miR-182 blev opreguleret ved ATO, de direkte mål for miR-182 er mest sandsynligt at blive nedreguleret. Brug differential genekspression cutoff værdier på ≥2.0 med statistisk signifikans sat til p ≤ 0,05, vi identificeret fem miR-182 target gener, der blev nedreguleret ved ATO i PC3 celler; gener identificeret gennem denne proces var Bcl2, BNC2, FRMD4A, ELL og AMOTL2. QRT-PCR-analyser bekræftede, at Bcl2 og FRMD4A hver nedreguleres med 65% i PC3-celler udsat for ATO (p 0,001 for begge gener, data for Bcl2 er vist i figur 5A.). Nedregulering af Bcl2 af ATO blev også bekræftet på proteinniveau (figur 5A).

(A) (B) PC3-celler blev behandlet med 5 pM ATO i 48 timer, efterfulgt af QRT-PCR og western blot-analyse af Bcl2 (A) og p21 (B). Data udtrykkes som gennemsnit ± SD. n = 3. ATO faldt både mRNA og protein udtryk for Bcl2 mens øget både mRNA og protein udtryk for p21. (C) (D) PC3-celler blev transficeret med en negativ kontrol (NegCon), MIR-182 mimic (miR182-mi), eller MIR-182 inhibitor (miR182-in) til 24 og /eller 48 timer, efterfulgt af analyse af ekspression af miR -182 (C), Bcl2 og p21 (D). C bekræfter den succesfulde transfektion af miR182-mi og miR182-in ved påvisning af øget eller nedsat ekspression af miR-182. D demonstrerer Bcl2 og p21-ekspression status på mRNA (øverst) og proteinniveauer (nederst) ved 48 h efter transfektion. miR-182 overekspression faldt Bcl2 mRNA udtryk, men havde minimal effekt på dets proteinekspression; mens MIR-182 knock-down havde ingen virkning på Bcl2 mRNA-ekspression, men øget sin proteinekspression. p21 var positivt korreleret til miR-182 udtryk på både mRNA og protein niveauer. Actin eller α-tubulin tjente som lastning kontrol til proteinekspression.

Vi fandt også, at p21 CDK-inhibitor, en vigtig negativ regulator af cellecyklussen, er konsekvent opreguleret i PC3-celler eksponeret for ATO , opregulering af p21 af ATO blev demonstreret på både mRNA og protein niveauer (fig. 5B).

En række transfektionsundersøgelser blev udført for at belyse forholdet mellem ATO eksponering, mIR-182-ekspression, og BCL2 og p21 mRNA og proteinekspression i PC3-celler. Som vist i fig. 5C, transfektion af miR-182 efterligner øget miR-182-ekspression ved 400-500 gange ved både 24 timer og 48 timer efter transfektion; derimod transfektion af MIR-182-inhibitor undertrykte MIR-182 ekspression af 98%. Overekspression af MIR-182 faldt Bcl2 mRNA-niveauer med 26% (p 0,05), men havde ingen signifikant virkning på Bcl2 proteinekspression ved 48 timer. Transfektion af MIR-182 inhibitor havde ingen virkning på Bcl2 mRNA-ekspression, men signifikant forøgelse Bcl2 proteinekspression (fig. 5D). Disse data antyder, at Bcl2 er et direkte mål for MIR-182 i PC3-celler; eftersom det basale proteinniveauet af Bcl2 var allerede lave, var der lidt protein ekspression kan dokumentere yderligere nedregulering gennem MIR-182 overekspression. Disse resultater tyder også på, at miR-182 ikke kan bidrage til Bcl2 nedregulering som reaktion på ATO i PC3 celler.

Derimod blev p21 ikke identificeret som et direkte mål for miR-182 ved enten Targetscan eller PicTar . Interessant nok blev p21-ekspression positivt korreleret med MIR-182-ekspression på både mRNA og protein niveauer (fig. 5D). Overekspression af MIR-182 forøgede p21-mRNA-ekspression med 57% (p 0,05), mens knock-down af MIR-182 ved transfektion MIR-182 inhibitor faldt p21-mRNA-ekspression med 36% (p 0,05). Disse data tyder på, at p21 er en indirekte mål for miR-182, og at miR-182 kan bidrage på en eller anden måde til p21 opregulering af ATO i PC3 celler.

Effekt af Mir-182 Expression om Cell Proliferation som svar på Ato i Pc 3 celler

for at undersøge den funktionelle rolle miR-182 som mediator af ATO reaktioner, miR-182-ekspression manipuleret af transfektion miR-182 efterligner eller miR-182-hæmmer i PC3 celler . Transficerede celler blev udsat for en lav koncentration af ATO (2,5 uM) i 4 dage, efterfulgt af kvantificering af celleproliferation ved MTT (fig. 6A) eller CV-assay (fig. 6B). Koncentrationen af ​​ATO 2,5 uM blev anvendt for at muliggøre studiet af differentierede virkningerne som følge af manipulering af MIR-182-ekspression. Som vist i fig. 6A, overekspression af MIR-182 i ubehandlede celler inhiberede proliferation med 36% (p 0,001); knock-down af miR-182 i ellers ubehandlede celler øget proliferation med 43% (p 0,001). miR-182 overekspression ændrede ikke PC3 celle responser på ATO; dog knock-down af MIR-182 reducerede aktiviteten af ​​ATO som en inhibitor af celleproliferation (fig. 6A). I nærværelse af ATO, absorbansen genereret af MIR-182 inhibitor-transficerede celler steg med 89% (p 0,001, n = 8) i forhold til den negative kontrol-transficerede celler. Fig. 6B viser billeder af CV-farvning ved 4 dage efter transfektion af MIR-182 mimic og MIR-182 inhibitor i PC3-celler. CV-assay demonstrerede lignende resultater (data ikke vist) som MTT assay. Disse resultater viser, at MIR-182 direkte inhiberer proliferationen af ​​PC3-celler, og kan også mediere suppressionen af ​​celleproliferation induceret af ATO.

(A) PC3-celler blev transficeret med MIR-182 mimic (miR182-mi , 20 nM) og mIR-182 inhibitor (miR182-i, 20 nM) i plader med 48 brønde henholdsvis med en miRNA mimic der bekræftede at have minimal sekvensidentitet med miRNA i humant som en negativ kontrol (NegCon, 20 nM) og derefter behandlet med 2,5 pM ATO i 4 dage, blev celleproliferation evalueres ved MTT-assayet. Absorbans-værdier er udtrykt som gennemsnit ± SD, *** p 0,001, n = 8. (B) PC3-celler blev transficeret som beskrevet i A, og dyrket i yderligere 4 dage efter transfektion blev cellerne derefter farvet med krystalviolet anvendelse af standard CV assayproceduren; billeder af celledeling status blev registreret med mikroskopi. (C) PC3-celler blev transficeret med en negativ kontrol eller MIR-182-inhibitor, derefter behandlet med 2,5 pM ATO i 48 timer blev celler opsamlet til western blot-analyse af LC3-II-ekspression. Actin tjente som en belastning kontrol. Et repræsentativt Western blot vises. De værdier under hvert bånd repræsenterer det normaliserede LC3-II intensitet (total pixels) af det præsenterede western blot, som bestemt ved FN-SCAN-it-software (Silk Scientific Inc., Orem, UT).

da ATO inducerer autofagi i PC3 celler, vi brugte western blots og UN-SCAN-it-software til at bestemme virkningerne af miR-182 på LC3-II-ekspression. Transfektion med MIR-182-inhibitor (MIR-182-i) nedsatte basale ekspression af LC3-II ved -30% (n = 3, er et repræsentativt Western blot vist i fig. 6C).