PLoS ONE: Modulation af Intestinal mikrobiota Alters Colitis-Associated Kolorektal Cancer følsomhed

abstrakt

Det er velkendt, at den intestinale mikrobiota spiller en central rolle i patogenesen af ​​Crohns sygdom (CD) og ulcerativ colitis (UC) samlet benævnt inflammatorisk tarmsygdom (IBD). Epidemiologiske undersøgelser har givet stærke beviser for, at IBD patienter bære øget risiko for udvikling af kolorektal cancer (CRC). Men virkningen af ​​mikrobiota på udviklingen af ​​colitis-associeret cancer (CAC) forbliver stort set ukendt. I denne undersøgelse har vi etableret en ny model for CAC hjælp azoxymethan (AOM) -exposed, conventionalized-

IL10

– /-

mus og har udforsket bidrag værtens tarm mikrobiota og MyD88 signalering til udvikling af CAC. Vi viser, at 8/13 (62%) af AOM-

IL10

– /-

mus udviklede colontumorer sammenlignet med kun 3/15 (20%) af AOM- vildtype (WT) mus . Konventionaliseret AOM-

IL10

– /-

mus udviklede spontan colitis og kolorektale karcinomer mens AOM-WT mus colitis-fri og udviklet kun sjældne adenomer. Vigtigere, tumor mangfoldigheden direkte korreleret med tilstedeværelsen af ​​colitis.

IL10

– /-

mus mono-associeret med mildt colitogenic bakterie

Bacteroides vulgatus

de viste signifikant reduceret colitis og kolorektal tumor mangfoldigheden i forhold til

IL10

– /-

mus. Kim-fri AOM-behandlede

IL10

– /-

mus viste normal colon histologi og var blottet for tumorer.

IL10

– /-

;

MyD88

– /-

mus behandlet med AOM de viste reduceret ekspression af

Il12p40

TNF

mRNA og viste ingen tegn på tumor udvikling. Vi præsenterer den første direkte påvisning af, at manipulation af den intestinale mikroflora ændrer udviklingen af ​​CAC. Den TLR /MyD88 vej er afgørende for mikrobiota-induceret udvikling af CAC. I modsætning til resultater opnået ved hjælp af AOM /DSS modellen, viser vi, at sværhedsgraden af ​​kronisk colitis direkte korrelerer til kolorektal tumor udvikling, og at bakterielle-induceret inflammation drev progression fra adenom til invasive karcinom

Henvisning: Uronis JM, Mühlbauer. M, Herfarth HH, Rubinas TC, Jones GS, Jobin K (2009) Modulation af Intestinal mikrobiota Alters Colitis-Associated Colorectal Cancer følsomhed. PLoS ONE 4 (6): e6026. doi: 10,1371 /journal.pone.0006026

Redaktør: Stefan Bereswill, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Tyskland

Modtaget: May 19, 2009; Accepteret: 30. maj 2009; Udgivet: 24 juni 2009

Copyright: © 2009 Uronis et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (NIH): ROI DK 47700 og RO1 DK 73.338 (C. Jobin) og Gastroenterology Forskeruddannelse give NIH 5 T32 DK007737 (J. Uronis) og NIH P30 DK034987 (center for Gastrointestinal Biologi og sygdom). Gnotobiotiske og kim-fri arbejde blev støttet af NIH Grant: P40RR018603. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

evnen til at montere en inflammatorisk respons efter skade eller eksponering for fremmede organismer er afgørende for vært homeostase og overlevelse. Men en vedvarende forhøjet immunrespons som den observeret ved kroniske inflammatoriske lidelser alvorligt forringer vært organfunktion, i sidste ende resulterer i sygdom [1]. En væsentlig risiko forbundet med kronisk inflammation øges sandsynligheden for udvikling af cancer [2] – [4]. Crohns sygdom (CD) og ulcerativ colitis (UC) kollektivt betegnet inflammatorisk tarmsygdom (IBD) er indbegrebet eksempel, hvori kronisk inflammation oversætter til øget risiko cancer [2]. Den kumulative incidens af kolorektal cancer i IBD patienter varierer fra 7,6% til 18,4%, 30 år efter diagnosen [5] – [8]. Desuden epidemiologiske data tyder på, at varigheden og sværhedsgraden af ​​kronisk colitis repræsenterer væsentlige risikofaktorer for colitis-associeret tyktarmskræft (CAC) [9] – [11]. Selvom ætiologien af ​​IBD er endnu ikke klarlagt, animalsk modelbaserede undersøgelser viser, at værten intestinal mikrobiota udløser et immunrespons, der er nødvendige for indtræden af ​​sygdom [12] – [15]. Denne ukontrollerede immunrespons sandsynligvis repræsenterer en defekt i et eller flere immunosuppressive mekanismer, der skal give tolerance til værten intestinal microbiota, hvilket resulterer i overproduktion af proinflammatoriske mediatorer [12], [16]

Konceptet af en afbalanceret immunsuppressiv respons til formål at regulere mikrobiota kan bedst illustreres i interleukin-10 knock-out (

IL10

– /- iBooked.dk) mus. Disse mus, som udviser intolerance over for deres tarm mikrobiota udvikler spontan colitis som følge af mikrobiel-induceret aktivering af effektor T-celler [17] – [19]. Salg

human colon havnens så mange som 36.000 bakteriearter beløber til over 100 trillioner aerobe og anaerobe bakterier [20], [21]. Som et produkt af vores co-evolution med bakterier, har et kommunikationssystem udviklet, der giver os mulighed for at regulere hinanden, og dermed bevare tarm homeostase [21]. En integreret rolle i cross-talk, der opstår mellem den menneskelige tarm og dets hjemmehørende mikrobiota udføres af medfødte bakterielle sensorer kendt som mønstergenkendelse receptorer (PRRS) [21]. To hovedklasser af PRRS er blevet vist at regulere kommunikationen mellem tarmepitelet og mikrobiota. Toll-lignende receptorer (TLRs) og Nod-lignende receptorer (NLRs) tjener til at alarmere vært til tilstedeværelsen af ​​bakterier i de ekstracellulære og intracellulære rum henholdsvis [22], [23]. Brug af azoxymethan (AOM) /DSS model af CAC, Fukata og medarbejdere viste, at TLR4 deltager i udviklingen af ​​tyktarmskræft [24]. Selvom interessant, har denne undersøgelse ikke direkte rettet virkningen af ​​mikrobiota i CAC udvikling. Derudover AOM /DSS model af CAC synes at vise en dissociation mellem sværhedsgraden af ​​intestinal inflammation og cancerudvikling. Det er klart, er behov for yderligere undersøgelser af virkningen af ​​bakterier på udvikling af CAC.

I denne undersøgelse vi udnyttet kim-fri og gnotobiotiske teknologi til at modulere indholdet af de intestinale mikrobiota at bestemme direkte indvirkning af bakterier på udviklingen af ​​CAC. Vi viser, at AOM-behandlede

IL10

– /-

mus udvikler CAC i nærvær af colitogenic bakterier hvorimod kimfrie mus forbliver sygdomsfri. Tilstedeværelsen af ​​colitis direkte korrelerer med tumor mangfoldigheden og fungerer som en promotor af kolorektal cancer. Derudover AOM-behandlede

IL10

– /-

;

MyD88

– /-

mus undladt at udvikle kolorektal tumorer, hvilket indikerer, at bakteriel signalering gennem TLR /MyD88 kræves et system til udvikling af CAC

Resultater

. bakteriel-medieret colitis forbedrer kolorektal tumorigenese

for at undersøge rollen af ​​bakteriel-medieret colitis i starten af ​​kolorektal carcinogenese, konventionaliseret WT og

IL10

– /- iBooked.dk mus blev administreret et regime af AOM og overvåges

in vivo

for tegn på colitis og tumor udvikling ved koloskopi ved definerede intervaller (fig. 1). Efter 16 uger viste WT mus ingen tegn på makroskopisk inflammation og vises en semi-gennemskinnelig slimhinde med veldefineret vaskularisering forbundet med en sund kolon (fig. 2A, venstre panel). I modsætning hertil

IL10

– /-

mus udstillet slimhinde fortykkelse og tab af tilsyneladende vaskulatur associeret med makroskopisk tarmbetændelse (figur 2A, midterste panel.). Makroskopiske læsioner er kompatible med tumorer blev observeret i stiliserede

IL10

– /-

mus ved uge 16 (fig 2A, højre panel.). For yderligere at studere disse læsioner, blev histologisk analyse af colon væv udført på WT og

IL10

– /-

mus. Vi bekræftede, at de makroskopiske læsioner observeret i

IL10

– /-

mus tumorer, der er udviklet i den betændte tyktarm. Som vist i fig. 2B, AOM-behandlede

IL10

– /-

mus viste en dramatisk stigning i tumor penetrans og multiplicitet sammenlignet med WT-mus. I vores undersøgelse, 8/13 (62%) af

IL10

– /-

mus udviklede colontumorer sammenlignet med kun 3/15 (20%) af WT mus. Endvidere tumor mangfoldigheden var, 5 gange højere hos

IL10

– /-

mus med et gennemsnit på 1- mod kun 0,2 tumorer i WT mus (Fig 2B.) (P = 0,034). Notatet tumor udvikling

IL10

– /-

mus var forbundet med øget tarmbetændelse, som bestemt ved histologisk analyse (figur 2C.) (P 0,0001). Colon udtryk for

IL12p40

TNF

mRNA var signifikant forhøjet i

IL10

– /-

-. I forhold til WT mus (. Figur 2C)

kimfrie mus blev overført til SPF betingelser og fik lov at akklimatisere sig i 5 uger. Mus blev givet AOM injektioner en gang om ugen i 6 uger (sorte pilespidser). Udvikling af colitis og tumordannelse blev overvåget af koloskopi fra uge 4 til 18 efter overførsel fra kim fri til SPF betingelser (hvide pilespidser). Musene blev aflivet mellem 18 og 20 uger og væv behandles til histologiske og mRNA-ekspression analyse.

A. Repræsentative eksempler på WT (venstre panel) og

IL10

– /-

koloner (midterste og højre paneler) fra AOM-behandlede mus 16 uger efter overførsel til SPF betingelser. B. Tumor penetrans og mangfoldighed i WT og

IL10

– /-

mus (venstre og højre paneler) (p = 0,034). C. WT og

IL10

– /-

kolon inflammation scoringer, distal colon

Il12p40

TNF

mRNA-niveauer efter 18-20 uger under SPF betingelser (p = 0,026).

for yderligere at undersøge sammenhængen mellem bakteriel-induceret colitis og udvikling af tumorer, vi udførte lineær regressionsanalyse, sammenligner histologiske betændelse score mod tumor nummer. Pearson korrelationsanalyse viste en stærk positiv korrelation mellem inflammation og colon tumor udvikling (p = 0,0028). Disse data tyder på, at kronisk colitis øger progressionen af ​​tidlige transformationsbegivenheder initieret af AOM, måske ved oprettelse af et mikromiljø mere støttende af celleproliferation.

Kronisk colitis forbedrer AOM-induceret kolorektal tumor progression

I betragtning af den dramatiske stigning i følsomheden over for colon tumor udvikling, vi hypotese, at mus med kronisk colitis kan også vise øget følsomhed over for avanceret tumor progression. Histologisk evaluering blev udført, og tumorer blev klassificeret som enten lav eller høj kvalitet dysplasi eller som invasive karcinom. Syv af otte (88%) af tumorbærende AOM /

IL10

– /-

mus udviklede høj kvalitet eller invasiv karcinom mens ingen af ​​de 3 tumorer observeret i WT mus viste tegn på fremskreden histologisk stadie ( fig. 3A). Repræsentative eksempler på colontumor histologi observeret i AOM-behandlede WT og

IL10

– /-

mus er vist i figur 3B. Disse data antyder, at kronisk colitis ikke kun disponerer til øget modtagelighed for AOM-inducerede kolorektal tumorudvikling, men også forbedrer tumorerne onkogent potentiale, og derved fremme progression til mere avancerede faser.

A. Procent af tumor-bærende WT og

IL10

– /-

mus med høj kvalitet eller invasiv carcinom (øverste panel). Repræsentant lav kvalitet adenom observeret i WT mus (midterste panel). Repræsentant invasiv karcinom observeret i

IL10

– /-.

Mus (nederste panel)

NFicB aktivitet og celleproliferation i tumorer fra

IL10

– /-

mus

NFKB signalering spiller en afgørende rolle i at fremme bakterie-induceret colitis i

IL10

– /-

mus [25], [26]. For at kontrollere tilstedeværelsen af ​​aktiverede Rel A (NFKB) -signaling i AOM /

IL10

– /-

model af CAC, vi vurderede udtryk /lokalisering af fosforyleret RelA (S 276) i

IL10

– /-

kolon væv ved immunhistokemi (IHC). Kolon fra

IL10

– /-

mus viste rigelige phosphorylerede RelA positive infiltrerende immunceller (figur 4A.). Endvidere blev tilstedeværelsen af ​​talrige fosforylerede RelA positiv immun- og intestinale epitelceller observeret i adenomer fra

IL10

– /-.

Mus (. Figur 4B)

A. Phosphoryleret-Rel En immunfarvning af normalt

IL10

– /-

kolon væv. B. Udvidelse af Rel En positiv immun infiltrat i A. C. Phosphoryleret Rel En immunfarvning i

IL10

– /-

adenom. D. Udvidelse af adenom i CE kanin IgG negativ kontrol.

På grund af sin rolle i at fremme celleproliferation og overlevelse, vi vurderet fordelingen af ​​Ki67 positive celler i aktivt betændte og neoplastiske regioner af kolon isoleret fra AOM /

IL10

– /-

mus. Nuclear Ki67-farvning var hovedsagelig begrænset til krypt baser i WT-mus (fig. 5A). I modsætning hertil tyktarmsslimhinden fra betændt

IL10

– /-

mus udviste områder med øget proliferation strækker sig i nogle tilfælde hele krypt længde (fig 5A.). Desuden kolorektale adenomer høstet fra

IL10

– /-

mus viste konsekvent øget Ki67 farvning forhold til normal slimhinde (Fig 5B.). Denne forbedrede spredning er i overensstemmelse med øget akkumulering af nuklear CTNNB1 i adenomatøs væv fra

Il-10

– /-

mus (. Figur 5C). Tilsammen antyder disse data, at den øgede inflammatoriske og proliferativ tilstand observeret i forbindelse med

IL10

– /-

mus kolon kombineret med AOM-induceret aktivering af WNT /CTNNB1 pathway resulterer i en øget tilbøjelighed til kolorektal tumor dannelse og progression.

A. Ki67-positive celler er begrænset til crypt baser i normal WT colon. Normale koloner fra

IL10

– /-

mus udviser aflange krypter med udvidet Ki67 positiv farvning. B. Repræsentant adenom fra

IL10

– /-

mus viser forøget Ki67 positiv farvning (venstre panel). Kanin IgG negativ kontrol (højre panel). C.

IL10

– /-

adenom viser positiv CTNNB1 farvning

Germ gratis

IL10

-. /-

Mus mono-forbundet med

Bacteroides vulgatus

display reduceret colitis og kolon tumor udvikling i forhold til

IL10

– /-

SPF mus

for yderligere at afgrænse rolle bakterier i at fremme udviklingen af CAC, vi mono-associeret kim-fri WT og

IL10

– /-

mus med

Bacteroides vulgatus

(.

B vulgatus

), en enterisk bakterie, som er indberettet tidligere at fremkalde kun mild colitis i

IL10

– /-

model af IBD [18]. Histologisk evaluering viste, at

IL10

– /-

mus koloniseret med

B. vulgatus

udviklet moderat colitis (gennemsnitlige score = 1,6) sammenlignet med WT-mus (gennemsnitlige score = 0,36) (fig. 6A). Disse værdier var dog betydeligt mindre end inflammatoriske scores observeret i konventionaliserede

IL10

– /-

mus (gennemsnitlige score = 2,6, p = 0,03) (fig 6A.). Overensstemmende med betændelse status, mono-associerede

IL10

– /-

mus viste en signifikant lavere tumor mangfoldigheden i forhold til deres konventionaliserede modstykker (0,4 og 2,3, p = 0,002) (Figur 6B). Pearson lineær regressionsanalyse viste en stærk positiv korrelation mellem histologisk colitis score og kolorektal tumor nummer blandt

B. vulgatus

mono-associeret mus (p = 0,009). Desuden AOM-behandlede kim gratis

IL10

– /-

mus undladt at udvikle colitis og dermed kolorektale tumorer som bekræftet af histologisk evaluering (Fig 6A . B). Disse resultater viser, at tilstedeværelsen af ​​colitogenic bakterier er afgørende for udviklingen af ​​CAC.

A. Sammenligning af betændelse scoringer for

IL10

– /- iBooked.dk mus under SPF,

B. vulgatus

mono-associerede og kim gratis forhold. B. Tumor mangfoldighed i

IL10

– /- iBooked.dk mus under SPF,

B. vulgatus

mono-associerede og kim fri forhold.

MyD88 signalering er nødvendig for bakteriel-induceret CAC

For at undersøge, hvilken rolle TLR /MyD88 pathway signalering i CAC udvikling,

IL10

– /-

;

MyD88

– /-

mus blev administreret AOM og kolorektal tumordannelse blev evalueret. Koloskopi viste tilstedeværelsen af ​​neoplastiske læsioner i

IL10

– /-

mus mens

IL10

– /-

;

MyD88

– /-

mus viste ingen tegn på sygdom (data ikke vist). Repræsentative eksempler på kolon væv histologi for

IL10

– /-

IL10

– /-

;

MyD88

– /-

mus er vist i figur 7A.

IL10

– /-

mus udviklede et gennemsnit på 0,8 kolorektale tumorer /mus, mens

IL10

– /-

;

MyD88

– /- iBooked.dk mus var blottet for neoplastiske læsioner (Figur 7B)

A.. Repræsentant histologi observeret i

IL10

– /-

IL10

– /-

;

MyD88

– /-

mus behandlet med AOM. B. Tumor mangfoldighed i

IL10

– /-

IL10

– /-

;

MyD88

– /-

mus behandlet med AOM. C. Relativ udtryk for

Il12p40

TNF

mRNA i de distale koloner af

IL10

– /-

IL10

– /-

;

MyD88

– /- Restaurant mus

For at undersøge muligheden for, at ophævede tumordannelse i

IL10

– /-

.;

MyD88

– /-

mus er resultatet af ændret inflammatorisk-cytokinekspression, anvendte vi semikvantitativ PCR for at bestemme de relative mRNA ekspressionsniveauer af pro-inflammatoriske cytokiner

TNF

a og

Il12p40

i den distale colon, den dominerende sted for tumordannelse. Vi observerede signifikant lavere

Il12p40

mRNA-ekspression (p = 0,032) samt en bemærkelsesværdig tendens til formindsket

TNFa

ekspression (p = 0,089) i

IL10

– /- ; MyD88

– /-

forhold til

IL10

– /-

mus (Figur 7C). Tilsammen indikerer disse resultater, at bakteriel-induceret inflammation fremmer udviklingen af ​​colitis-associerede kolorektal cancer og er afhængig af TLR /MyD88 pathway signalering.

Discussion

Selvom UC repræsenterer det prototypiske eksempel på tilknytning, kronisk inflammation og risiko for at udvikle kolorektal cancer, mekanismerne bag denne proces er endnu ikke klarlagt. Dette skyldes sandsynligvis begrænsninger forbundet med eksisterende forsøgsmodeller, som gør det vanskeligt at rekapitulere virkningerne af kronisk inflammation på kolorektal tumorigenese. I denne undersøgelse viste vi, at colitogenic bakterier er nødvendige for udviklingen af ​​kronisk tarmbetændelse fører til tumorigenese. Ved hjælp af AOM som en tumor initiativtager og mikrobiota at udløse kronisk colitis i genetisk modtagelige

IL10

– /-

mus, viser vi, at betændelse direkte korrelerer med kolorektal tumor mangfoldigheden og forbedrer tumor progression. Disse hændelser blev ikke observeret i

IL10

– /-

mus opstaldet under kim-fri betingelser og var stærkt svækkede i mus forbundet med

B. vulgatus

, en svag inducer af tarmbetændelse. Desuden afbrydelse af MyD88 signalering, en central integrator af flere TLRs forhindrede udviklingen af ​​kolorektale tumorer i

IL10

– /-

mus. Disse resultater kraftigt etablere mikrobiota centrale i udløsning tarmbetændelse og neoplastiske forandringer i en modtagelig vært. Rolle TLR signalering i udviklingen af ​​colorektal cancer har været genstand for nyere intens undersøgelse. Rakoff-Nahoum og medarbejdere viste, at MyD88 signalering bidrager til tumor progression i

Apc

Min

model af menneskets familiær adenomatøs polypose, hvilket tyder på en rolle for intestinale mikroorganismer i processen med tumorigensis [27]. Men fordi cytokiner, såsom IL1 og IL18 også udnytte MyD88 at aktivere nedstrøms målgener [28] inddragelse af den intestinale mikroflora i denne model er uklar. Desuden blev inddragelse af MyD88 signalering i udviklingen af ​​CAC ikke behandlet i denne undersøgelse. Et bedre billede af den rolle, TLR signalering i CAC er begyndt at dukke op fra undersøgelser ved hjælp af AOM /DSS modellen. F.eks Fukata og medarbejdere vist, at kolorektal tumorgenese er stærkt reduceret i

TLR4

– /- Salg mus, hvilket antyder, at denne medfødte receptor er vigtig for udviklingen af ​​CAC [24]. Dette blev dog kraftig reduktion i neoplasi ikke ledsaget af en samtidig reduktion i inflammation. Der er derfor en tilsyneladende modsætning mellem tarmbetændelse og tumorigenese i AOM /DSS model. Dette fænomen er ikke specifik for TLR signalering, da en nylig rapport viste, at tumorigenese dramatisk reduceres i

IL6

– /- Salg og

STAT3

– /-

mus, trods markant højere inflammatoriske scorer i disse mus [29]. I modsætning hertil ved hjælp af AOM /

IL10

– /-

model, observerede vi en stærk sammenhæng mellem betændelse score og tumor mangfoldigheden. Dette antyder, at alvorlig betændelse understøtter mere rammende overlevelse tidlige transformationsbegivenheder. Derudover vores data viser, at tilstedeværelsen af ​​inflammation uanset sværhedsgrad påvirker tumorudvikling. Det er muligt, at tumoren mikromiljø stede i AOM /DSS modellen adskiller sig fra i AOM /

IL10

– /-

model, som kunne redegøre for nedsat tumorigenese trods den høje inflammatorisk tilstand i det tidligere model.

de seneste rapporter har givet indsigt i rollen som colitis som promotor af kolorektal tumorigenese i AOM /DSS modellen [24], [29]. Et vigtigt spørgsmål, som forbliver ubesvaret er imidlertid, om disse tumorfremmende effekter fremkaldes af sårheling reaktion inhærent forårsaget af DSS behandling eller af den betændelse, der ledsager den. For eksempel Grivennikov og medarbejdere viser, at

IL6

– /-

mus udviser nedsat tumor mangfoldigheden og belastning i forhold til WT mus efter AOM /DSS behandling endnu disse mus viste mere alvorlig tarmbetændelse end WT mus . Følgelig reduceret tumorigenese i denne model er resultatet af nedsat IL6 /STAT3 signalering i intestinale epitelceller (IEC) og ikke nødvendigvis af intestinal inflammation. Vi demonstrerer her, at AOM /

IL10

– /-

model af CAC kan bruges til at undersøge konkret indvirkning colitis på kolorektal tumorigenese. Hvorvidt IL6 /STAT3 signalering er vigtig for udviklingen af ​​CAC i AOM /

IL10

– /-

mus mangler at blive undersøgt. Derudover viser vi, at CAC forekommer i forbindelse med aktiverede NFKB-signalvejen, som vist ved tilstedeværelsen af ​​NFKB-positive immunceller hvilket antyder, at denne inflammatoriske signalvej er vigtig i udviklingen og /eller fremme af neoplasi. Yderligere studier vil være forpligtet til mere specifikt at definere en rolle for NFicB-medieret inflammatorisk signalering i CAC.

Sammenfattende viser vi, at tarmen mikrobiota er afgørende for udviklingen af ​​CAC og at kronisk colitis fremmer onkogent potentiale af kolorektale tumorer resulterer i progression til fremskredne stadier. Disse begivenheder er afhængige af mikrobiel anerkendelse af TLR /MyD88 system. Modulation af dette vigtige medfødte sensorsystem kunne udgøre en roman middel til at forebygge /dæmpe udviklingen af ​​CAC.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alle dyr protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of North Carolina i Chapel Hill

Mus og induktion af CAC

WT og

IL10

-. /-

mus på 129 SvEv baggrund blev avlet og opstaldet i gnotobiotiske Animal Facility på University of North Carolina i Chapel Hill. Ti til tolv uger gamle kimfri mus blev overført til SPF (SPF) betingelser (konventionaliseret), og efter 5 uger blev injiceret i.p. med 10 mg /kg legemsvægt AOM (Sigma-Aldrich) en gang om ugen i 6 uger.

IL10

– /-

;

MyD88

– /-

mus og kontrol

IL10

– /-

mus (C57BL /6J /129) blev rejst under SPF betingelser og ved 12 ugers alderen blev injiceret med AOM som beskrevet ovenfor. Alle mus testet fri af Helicobacter hepaticus og Helicobacter pylori, to kendte induktorer af tumorigenese i

IL10

– /-.

Mus [30]

Bakteriel kolonisering

IL10

– /-

– og WT mus mono-associeret ved 10-12 ugers alderen ved tvangsfodring fodring og rektal pensling med levedygtige bakterier dyrket fra marsvin isolater af

Bacteroides vulgatus

. Mono-associeret mus blev opretholdt i gnotobiotiske Animal Facility på University of North Carolina i Chapel Hill. Bakteriel forening og fravær af forurening med andre bakteriearter blev bekræftet ved periodisk aerob kultur af afføringsprøver og gram farvning.

obduktion og tumor histologi

Ved offer, koloner blev fjernet fra coecum til endetarmen, skyllet med PBS, spredte langs og tumorer talt. Distale colon vævsprøver blev opsamlet og hurtigt nedfrosset. Koloner var swiss-valset fra den distale til den proximale ende, fikseret natten over i 10% formalin og indstøbt i paraffin. Seks um snit blev fremstillet og farvet med hematoxylin og eosin til histologisk analyse. Tumorer blev bedømt for inflammation og tumorklassificering.

Histologisk evaluering af slimhindeinflammation blev udført under anvendelse af et scoringssystem fra 0 til 4 for at klassificere graden af ​​lamina propria mononukleære celle infiltration, krypt hyperplasi, bæger cellereduktion og arkitektoniske forvrængning som tidligere beskrevet [18]. Tumorer blev klassificeret som lav kvalitet dysplasi, da de viste en uorganiseret epithel foret med hyperkromatiske celler med nukleare pseudostratification. Tumorer blev klassificeret som høj kvalitet, når de indeholdt back-to-back kirtler, høj nukleare til cytoplasmatiske nøgletal, øget nuklear pleomorphism og tab af cellulære polaritet. Tumorer blev klassificeret som invasive karcinomer når der var klar penetration af dysplastiske regionen gennem muscularis mucosa resulterer i desmoplastiske svar fra nabolandet stroma. Inflammation og neoplastiske læsioner blev scoret af en uddannet patolog.

Immunhistokemi

Vævssnit blev afparaffiniseret i xylen og rehydreret gennem en gradueret serie af alkohol vaske. Immunhistokemi for phosphoryleret-Rel A (RelA 276) blev udført med en kanin-polyklonalt antistof fortyndet 1:50 (Cell Signaling Technology) under anvendelse af Vectastain Elite kanin IgG-kit (Vector Laboratories). Ki67 immunohistochemisry blev udført som følger: Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved inkubation i 0,3% H

2O

2 i 30 minutter. Antigen genfinding blev udført ved kogning sektioner i 7 minutter i 0,01 M citratpuffer pH 6,0 og afkølet ved stuetemperatur i 30 minutter. Blokering blev udført med 3% BSA i phosphatbufret saltvand (PBS) i 30 minutter ved stuetemperatur. Ki67 monoclonoal antistof (Dako) blev fortyndet 1:200. Biotinyleret sekundært antistof (Vector Laboratories) blev fortyndet 1:200 i 1% BSA /PBS. Efterfølgende trin blev udført under anvendelse af Vectastain ABC kit ifølge producentens instruktioner. CTNNB1 immunohistohistochemistry blev udført ved hjælp af en muse-anti-CTNNB1 antistof fortyndet 1:100 (Transduction Laboratories) med M.O.M. peroxidase kit (Vector Laboratories). Primært antistof inkubationstrin blev udført natten over ved 4 ° C. Visualisering blev udført ved anvendelse 3,3′-diaminobenzidin (Dako).

Real-time PCR

RNA blev isoleret fra distale colon væv under anvendelse af TRIzol-metoden (Invitrogen, Carlsbad, CA). cDNA blev fremstillet ved revers transkribering 1 ug RNA ved anvendelse 126 enheder af M-MLV revers transkriptase, 1 mM dNTP’er og 875 pmol vilkårlige primere (Invitrogen). Semi-kvantitativ real-time PCR blev udført under anvendelse af en Eppendorf Realplex Master Cycler. PCR-reaktion: 150 nM slutkoncentration af forward og reverse primere, 6 pi QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, Valencia, CA) og 50 ng cDNA skabelon i alt 12 pi. De følgende PCR-betingelser blev anvendt: 95 ° C, 15 minutter; (95 ° C, 15 sekunder; 56 ° C, 30 sekunder; 72 ° C, 30 sekunder) × 40 cyklusser. Specificiteten og lineariteten af ​​amplifikation for hver primersæt blev bestemt ved at smelte kurve analyse og beregning af hældningen fra serielle fortyndede prøver. Relative fold-ændringer blev bestemt ved anvendelse af ΔΔCT beregningsmetoden. Værdier blev normaliseret til den interne kontrol β-actin. Primere:.

TNF

(5 ‘ATGAGCACAGAAAGCATGATC 3’and 5’ TACAGGCTTGTCACTCGAATT 3 ‘) og

Il12p40

(5′ CACGGCAGCAGAATAAATATG 3 ‘og 5’ TTGCATTGGACTTCGGTAGA 3 ‘)

Statistisk analyse

statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism-version 5.0a. Sammenligninger mellem WT og

IL10

– /-

eller

IL10

– /-

IL10

– /-

;

MyD88

– /-

mus blev analyseret under anvendelse af en to-halet uparret t-test. Sammenligninger mellem SPF,

B. vulgatus

mono-associeret og kimfri mus blev analyseret ved anvendelse af en envejs variansanalyse (ANOVA). Individuelle sammenligninger blev efterfølgende fremstillet ved anvendelse af en to-halet uparret t-test. Pearson korrelation analyse blev udført for at vurdere sammenhængen mellem tumor nummer og inflammation sværhedsgrad hos AOM-behandlede WT og

IL10

– /- Salg mus (n = 22) under anvendelse af SAS (SAS Institute, Cary NC)

Koloskopi

koloskopi blev udført 4, 8, 12, 16 og 18 uger efter overførsel af mus fra kim-fri til at SPF betingelser (fig. 1) for at følge udviklingen af ​​colitis og tumordannelse .

In vivo

visualisering af tumorer blev udført ved hjælp af en “Coloview System” (Karl Storz Veterinary Endoskopi). Mus blev bedøvet ved anvendelse af 1,5% til 2% isofluran og -4 cm af tyktarmen fra den anale randen fra milten flecture blev visualiseret. Procedurerne blev digitalt optaget på et AIDA Compaq PC.

Tak

Vi takker Maureen Bower og Cindy Spivey på The National gnotobiotiske gnaver Ressourcecenter for deres eksperthjælp i kim-fri gnaver teknologi. Forfatterne vil gerne takke Amber McCoy fra Center for Gastrointestinal Biologi og Sygdom (CGIBD) Histologi Core Facility for hjælp til histologisk behandling.