PLoS ONE: akut pancreatitis Accelererer Indledning og Progression til kræft i bugspytkirtlen i mus, som udtrykker oncogen Kras i Nestin Cell Lineage

abstrakt

Målretning af onkogene Kras til pancreas nestin-udtrykkende embryonale stamceller og efterfølgende til den voksne acinære rum og Nestin-udtrykkende celler er tilstrækkeligt til udvikling af low-grade pancreas intraepitelialneoplasi (Panin) mellem 2 og 4 måneder. Musene dør omkring 6 måneder gamle af uafhængige årsager, og det er derfor ikke muligt at vurdere, om de læsioner vil videre til karcinom. Vi rapporterer nu, at to korte episoder af caerulein-induceret akut pancreatitis i 2 måneder gamle mus forårsager hurtig Panin progression og pancreas ductal adenocarcinom (PDAC) udvikling ved 4 måneders alderen. Disse hændelser forekommer med samme hyppighed som observeret hos dyr, hvor onkogenet er målrettet under embryogenese til alle pancreas celletyper. Således disse data viser, at onkogene Kras-drevet Panin oprindelse i en ikke-duktalt rum hurtigt kan udvikle sig til PDAC når den udsættes for en kort inflammatorisk fornærmelse

Henvisning:. Carrière C, Young AL, Gunn JR, Longnecker DS , Korc M (2011) akut pancreatitis accelererer Indledning og Progression til kræft i bugspytkirtlen i mus, som udtrykker oncogen Kras i Nestin Cell Lineage. PLoS ONE 6 (11): e27725. doi: 10,1371 /journal.pone.0027725

Redaktør: Wafik S. El-Deiry, Penn State Hershey Cancer Institute, USA

Modtaget: Juni 7, 2011; Accepteret: 23. oktober 2011; Udgivet: November 28, 2011

Copyright: © 2011 Carrière et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra: The National Cancer Institute: CA-R37-075059 til Murray Korc og CA-127.095 til Catherine Carrière; Den Lustgarten Foundation for kræft i bugspytkirtlen Research til Catherine Carrière. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) tegner sig for over 95% af alle eksokrine pancreas maligniteter og er den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA, med en median overlevelse på 6 måneder [1]. I de sidste 30 år har patient overlevelsesrater ikke forbedret væsentligt, og PDAC forbliver genstridig i sine sene stadier. Således er der et presserende behov for at udvikle nye metoder til tidlig påvisning af PDAC samt nye behandlingsformer rettet mod tidlige kræft stadier. Mouse modeller af PDAC der rekapitule- human cancer har potentiale til at fremme vores forståelse af de tidlige begivenheder i udviklingen af ​​kræft.

PDAC er nu anerkendt at opstå overvejende gennem progression af pancreas intraepitelialneoplasi (Panin), der spænder fra lav- (Panin-1A, -1b) til høj-kvaliteter (Panin-2, -3), Panin-3 repræsenterer karcinom

in situ

og den umiddelbare forløber for duktalt adenokarcinom [2]. Denne histologiske progression er korreleret med akkumulering af genetiske abnormiteter i hvilke mutationer der fører til konstitutiv aktivering af KRAS er de tidligste og mest almindelige (95%) [3]. De første relevante musemodeller af PDAC blev genereret ved at målrette en betinget muteret

Kras

allel (

Kras

G12D

) til tidlige bugspytkirtlen progenitorer (ved hjælp Pdx1 og Ptf1a initiativtagere) og derefter til alle pankreatiske celletyper [4], [5]. Disse modeller sammenfattet trofast det fulde spektrum af humant Panin progression og pancreascancer udvikling, hvilket viser, at oncogene Kras ekspression er tilstrækkelig til PDAC initiering. For at afgrænse de celler oprindelseslande PDAC blev flere modeller efterfølgende udviklede hvor muterede Kras var målrettet til mere begrænsede embryonale eller voksne cellepopulationer. Vi brugte en Nestin-Cre-driver til at målrette Kras

G12D at acinar og Nestin udtrykker celler (Nestin-Cre; LSL-Kras

G12D eller N /K-mus) (. Figur 1A), mens andre målrettede onkogene Kras til acinar kun eller acinære /centroacinar celler med forskellig elastase-Cre og mist1-Cre drivere [6], [7], [8], [9]. I alle disse modeller, kunne PDAC initiering og progression bemærkes, hvilket viser, at PDAC kan have en ikke-duktalt oprindelse i mus. Selv om en nyere undersøgelse antydede, at PDAC kunne indlede i det endokrine rummet, er det blevet vist, at promotoren anvendt i denne undersøgelse også kunne målrette en lille brøkdel af acinære celler [10], [11]. I alle de modeller, hvor onkogen Kras blev aktiveret under embryogenese, lav kvalitet PanINs udviklet, generelt forløber i løbet af 8-12 måneder til high-grade læsioner og PDAC. Vi var ikke i stand til at observere progression til PDAC i N /K-mus, da de generelt dør omkring alderen 6 måneder fra af centralnervesystemet komplikationer.

(A) Skematisk af den betingede Kras

G12D allel. I fravær af Cre-rekombinase, er kun WT Kras udtrykkes; når Cre udtrykkes, er stoppet regionen skåret ud og Kras

G12D bliver udtrykt. (B-E) I Nestin-Cre /R26R-mus, er LacZ-farvning kun observeret i acinære celler (B), og er fraværende i duktale celler (pilespidser) og øer (I). (C) Overlay af LacZ immunfarvning (E) med CK19 (D) viser, at duktale celler ikke er målrettet. (F) Pdx1-Cre fører til ekspression af Kras

G12D i alle pancreas celletyper mens Nestin-Cre driver ekspressionen af ​​Kras

G12D kun i acinære celler. Scale bar: 20 pm

Aktivering af Kras

G12D i den voksne pancreas førte til ikke-forløber lav kvalitet læsion dannelse [7], [8], [12].. Men efter induktion af kronisk betændelse i bugspytkirtlen, disse dyr udviklede high-grade læsioner og skred til PDAC [7]. Disse data er i overensstemmelse med epidemiologiske undersøgelser viser, at patienter, der lider af kronisk pancreatitis har en 16-fold øget risiko for udvikling pancreascancer [13]. Mens korte episoder med akut pancreatitis (AP) føre til hurtig Panin progression og øget hyppighed af PDAC i Pdx1-Cre; LSL-Kras

G12D mus [14], [15], [16], er det uvist, om det også vil føre til PDAC i Nestin-drevne musemodel. Vi viser nu, at N /K-mus, når de udsættes for to episoder af caerulein-induceret AP, hurtigt udvikle high-grade PanINs der har kapacitet til at udvikle sig til PDAC. Denne undersøgelse bekræfter, at akut pancreas skade har potentiale til at bidrage til PDAC udvikling i Kras-baserede musemodeller og støtte den hypotese, at PDAC kan opstå i Nestin celle afstamning.

Resultater

Nestin stamfader celler giver ikke anledning til duktale celler

Vi har tidligere vist, at embryonale nestin-udtrykkende pancreas progenitorer giver anledning til acinære celler og ikke for hormonforstyrrende eller centroacinar celler, medens et potentielt bidrag til duktale celler ikke blev fuldstændig udelukket [ ,,,0],6]. Du kan løse problemet, blev der flere afstamning sporing eksperimenter udført af avl musen linje, der udtrykker Cre rekombinase under kontrol af nestin regulatoriske elementer [17] med reporter mus linje R26R. Denne sidste linje bærer β-galactosidase (LacZ-genet) under kontrol af den allestedsnærværende promoter R26 og en transkriptionel stopper region omgivet af loxP-sites (LoxP-Stop-LoxP eller LSL) [18]. I de dobbelte transgene mus, er LacZ-ekspression aktiveres følgende Cre-medieret rekombination i embryoniske nestin-udtrykkende celler (metode svarende til den, der er beskrevet for Kras i fig. 1A). Efterfølgende ved genetisk transmission, alle celler afledt fra Nestin-udtrykkende progenitorer udtrykker LacZ. Sektioner på tværs af pancreas af Nestin-Cre /R26R dyr ved 2 måneders alderen blev farvet for LacZ-aktivitet. Som observeret før, nestin-Cre transgen tilladt for målretning af -70% af acinære celler (fig. 1B). LacZ farvning blev kun observeret i acinære strukturer, aldrig i duktalt, endokrine eller centroacinar celler (fig. 1B) og co-immunofluorescens med duktalt markør cytokeratin 19 (CK19) bekræftede denne observation (Fig. 1C-E). Disse resultater viser, at embryonale pancreatiske nestin-udtrykkende progenitorer ikke giver anledning til duktale celler (fig. 1F). Ekspression af LacZ blev også sjældent observeret i pankreatiske ikke-parenchymale celletyper såsom endotelceller og mesenchymale celler (ikke vist).

Akut pancreatitis dramatisk accelererer læsion progression i N /K pancreas

Mellem 2 til 6 måneder, N /K mus udviklede lav kvalitet PanINs i begrænset antal (2-10 isoleret læsioner eller små foci per snit), samt begrænsede områder af acinære at duktalt metaplasi (ADM) (fig. 2A-B, G) svarer til, hvad der observeres i Pdx1-Cre; LSL-Kras

G12D (P /K) mus [4], [14]. Mens med tid P /K-mus kan udvikle PDAC men ved meget lav frekvens, N /K mutant mus sjældent overlevede forbi 6 måneder på grund af alvorlige neurologiske problemer, der forhindrer os i at følge en eventuel progression til kræft i bugspytkirtlen.

( a-F) H (C-F) caerulein-behandlede pancreas show omfattende dysplasi med en blanding af lav- (*) og high-grade (pilespids) læsioner (D, indpresningsdybde af C) og (E) samt ADM foci (markeret med stiplet linje ) (F). (G) morfometrisk analyser viser dramatiske stigninger i antallet af dyr, der udviser høj kvalitet Panin læsioner og områder af microinvasion i caerulein behandlet pancreas. (H) Betydelige stigninger i proliferation observeres i caerulein behandlet pancreas (* P 0,05, ** P 0,01). Målestok: 50 pm

Vi har tidligere vist, at to episoder af akut pancreatitis (AP) induceret af caerulein accelereret Panin progression fra lav- til høj kvalitet og øget PDAC frekvens i P /K. musemodel [14]. For at teste den mulighed, at muterede Kras aktivering i Nestin afstamning kunne føre til PDAC, en kohorte af 17 2-måneder gamle N /K-mus blev udsat for caerulein behandling. Caerulein er en cholecystokinin (CCK) analog som binder til og aktiverer CCK-receptoren [19], [20]. Mens lægemiddeldosering vi bruges er lav sammenlignet med dem, der anvendes af andre grupper [21], [22], blev der observeret omfattende tab af acinære celler i vildtypemus efter 24 og 48 timer efter AP, samtidig med en dramatisk inflammatorisk infiltration og interstitiel ekspansion (Fig.S1) som beskrevet af andre [21], [22], [23]. En uge efter AP, blev næsten fuldstændig regenerering af pancreas observeret ved den histologiske niveau, med sjældne resterende inflammatoriske infiltrater mens spredning niveauer forblev høj som vist ved Ki67-ekspression i acinære celler (Fig.S1A-D). Disse resultater er i overensstemmelse med et andet offentliggjort rapport [15]. For at vurdere muligheden for, at følgende bugspytkirtlen skade, kunne Nestin udtryk påvises i forskellige pancreas celletyper, blev gjort kort sigt afstamning sporing eksperimenter. LacZ-farvning i Nestin-Cre /R26R pancreas, 1 uge efter caerulein behandling blev kun observeret i acinære strukturer og ingen farvning blev detekteret i endokrine, centroacinar eller duktale celler (ikke vist).

Alle 17 caerulein-behandlede N /K mus begyndte at blive syge, når de var omkring 4 måneder gamle, 2 måneder efter behandlingen, og måtte ofres. Seks dyr blev tabt uden obduktion. Derimod kun 3 ud af 9 ubehandlet N /K mus døde, og ingen af ​​de andre blev ofret på grund af sygdom i denne periode. P /K-mus når den udsættes for AP afse kortere levetid end ubehandlede mus mindste over en periode på 8 måneder (ikke vist). Disse observationer tydede på, at faldet i samlet overlevelse af N /K-mus fra 6 til 4 måneder ikke var direkte relateret til pankreatisk insufficiens. Fire måneder gamle N /K pancreas udviste få Panin-1A og 1b og sjældne ADM foci (mindre end 5% af sektionen) (fig. 2A, B og G). To måneder efter caerulein-induceret AP omfattende pancreas dysplasi blev observeret i N /K pancreas karakteriseret ved en blanding af lav- og høj kvalitet Panin og store ADM foci (Fig. 2C-F). Stigningen i læsion klasse og den omfattende ADM blev dokumenteret ved morfometriske analyser, at sammenlignet tilstedeværelse og kvalitet af læsioner mellem afsnit fra behandlede og ubehandlede N /K-mus. Mens de fleste sektioner fra ubehandlet N /K pancreas udviste lav kvalitet læsioner kun og mindre end 5% af det afsnit præsenteres ADM, viste mest caerulein behandlet pancreas signifikante stigninger i Panin-2 og -3 (P 0,0002) samt omfattende ADM omfatter 15 til 95% af pancreas (fig. 2G). Disse resultater svarer til dem vi observeret i et parallelt kohorte af P /K udsat ved 2 måneder gamle at caerulein-induceret AP (Fig.S2); P /K musene aflivet 6 måneder efter behandling (i en alder af 8 måneder), hvilket forklarer de højere high-grade læsioner og PDAC /microinvasion både ubehandlede og behandlede mus. Som observeret i N /K-mus, hele caerulein-behandlede P /K mus viser omfattende ADM dækker 25-95% af sektionerne (P 0,001) og dramatisk progression til high-grade læsioner og PDAC (Fig.S2). I modsætning hertil alle kontroldyr (vildtype eller transporterer en enkelt mutation, Nestin-Cre, Pdx1-Cre eller LSL-Kras

G12D kun) behandlet med caerulein, at pancreas syntes at være normal med lejlighedsvis rester af inflammation ( ikke vist).

Low-grade læsioner i N /K pancreas viste en spredning indeks på 13% ± 3% svarer til, hvad der observeres i P /K-mus [4]. Den høje kvalitet læsioner observeret efter caerulein behandling vises som forventet en høj spredning indeks (55% ± 3%), men interessant lav kvalitet læsioner viste også en højere spredning indeks på 31% ± 4% (fig. 2H, S3A). Det generelle stigning i proliferation observeret i bugspytkirtlen umiddelbart efter AP episoder [21] blev opretholdt 2 måneder efter skaden, men kun i de neoplastiske læsioner i nærvær af en aktiveret Kras allel.

Som observeret i human PDAC prøver, PanINs udtrykt højt CK19, hvilket understreger deres epitel karakter, vises slim ophobning som vist ved MUC5A ekspression (Fig.S3B-C), og var omgivet af kollagen-rige stroma (fig. S3F). Læsionerne viste en reaktivering af den tidlige pancreas stamfader markør Pdx1 samt Notch signalering markør Hes1, begge kendt for at blive genaktiveret i tidlige stadier af PDAC (Fig.S3D-E). ADM blev demonstreret ved co-ekspression af acinære og duktale markører i de samme celler (Fig.S3G-I), som observeret af andre [24]. Disse data bekræfter, at caerulein-induceret AP påvirker ikke karakteren af ​​de læsioner på molekylært niveau, men fremskynder deres progression til høj kvalitet.

Det blev vist for nylig, at den inflammatoriske mediator Stat3 og interleukin IL6 var vigtige bidragsydere til Panin progression og PDAC udvikling i det mindste i de tidlige stadier af sygdommen og var vigtige komponenter til den akutte respons på caerulein-induceret AP [16], [25]. Immunohistokemisk analyse i N /K pancreas viste, at phospho-Stat3 stadig stærkt blev udtrykt 2 måneder post AP (fig. 3), mens IL6 ikke blev påvist (ikke vist). Phospho-Stat3 blev vist tidligere at være stærkt aktiveret i PanINs umiddelbart efter AP episoder [16], [25]. Men to måneder senere phospho-Stat3 syntes ikke at blive udtrykt i læsionerne selv men blev rigeligt påvist i de inflammatoriske celler, i ADM foci og i grupper på tilsyneladende normale acinære celler (Fig. 3A-D). Tilsvarende i ubehandlede N /K-mus, phospho-Stat3 blev sjældent påvises og kun i celler, der omgiver de PanINs (ikke vist).

(A-D) IHC for phospho-Stat3 i N /K pancreas 2 måneder bogføre caerulein behandling. (A) lav forstørrelse billede af et repræsentativt område. Phospho-Stat3 er sjældent udtryk i udviklingen af ​​Panin læsioner, men er observeret i de celler, der udviser en normal ductal morfologi (B, pile); (Det er primært udtrykkes i inflammatoriske celler (C), i celler, der undergår ADM (C, D, pile) samt i morfologisk normale acinarceller (D, pilespidser) Målestok:.. 20 pm

oncogen Kras aktivering i Nestin celle afstamning fører til PDAC udvikling

i halvdelen musene udsat for AP, kan observeres områder microinvasion i pancreas som vist ved tabet af basalmembranen i nogle PanIN- 3 (fig. 4A-B) og CK19 ekspression i celler indenfor det tilstødende stroma (fig. 4C). fra en lille gruppe på 4 N /K dyr behandlet med caerulein på senere stadier (4 måneder gamle), 3 overlevede indtil alder 6 måneder og heraf 2 viste tumorer (diameter ~ 5 mm) er synlig ved grov anatomisk niveau. Kun én tumor var tilgængelige for histologisk analyse, der viser den morfologiske kendetegn ved PDAC, og afslørende lokal invasion af fedt og fiber væv (Fig . 4D). på trods af at kernerne var forstørret og overfyldt, blev en glandular morfologi vedligeholdes og lav til high-grade PanINs blev også observeret (fig. 4E-F). Store områder i bugspytkirtlen viste omfattende ADM (ikke vist). Som observeret i human PDAC, tumorerne var stærkt proliferative som vist ved Ki67-ekspression (fig. 4G) og omgivet af iøjnefaldende reaktiv stroma kendetegnet ved glatmuskelactin (SMA) ekspression (fig. 4H). Mens vi også observeret høje niveauer af COX2 i PanINs, sit udtryk var lav i de kræftceller, som er overraskende, som det er kendt for at være opreguleret i human PDAC (fig. 4I).

High-Grade læsioner vise microinvasion (A, pilespidser) og (B) som vist ved CK19 ekspression (tilstødende afsnit) i celler i det tilstødende stroma (C); (D) Lav forstørrelse viser lokal invasion af fedt og fiber væv (pile). (E) Kerner forstørres, er overfyldt og glandulær morfologi vedligeholdt. (F) Lav kvalitet PanINs (stjerner) er observeret i nærhed med adenocarcinom (pile). (G) adenokarcinomceller er yderst proliferative som vist ved Ki67-ekspression. De er omgivet af reaktiv stroma kendetegnet ved SMA-ekspression (H). COX2 udtryk mens højt i PanINs (pile) er fraværende fra adenokarcinom per se (pilespidser) (I). Scale bar: 20 pm

Nestin udtrykkes i mennesker og mus Panin

Efter AP, bugspytkirtlen undergår intens spredning og regeneration, og stigninger i Nestin udtryk er blevet observeret af forskellige. grupper [26], [27]. Det er uklart, hvis der opstår denne stigning via en udvidelse af et allerede eksisterende population af voksne Nestin-udtrykkende celler eller skyldes en forbigående ekspression af Nestin i dedifferentiating og prolifererende acinære celler. Vi viser nu ved immunhistokemi at Nestin konsekvent udtrykkes i mus Panin fra lav til høj kvalitet samt i menneskelige PanINs og PDAC (figur 5).

(A-D) Menneskelig Panin.; mus Panin i NK (E-G) og PK (I-K). Overlejringer af CK19 (grøn), Nestin (rød) og Hoescht (blå) viser klart coekspression af Nestin med CK19 i læsionerne (A, E, I). I modsætning hertil i normale kanaler, kun CK19 udtrykkes (pile) (H, L). (D) På humant væv, det sekundære antistof alene genererer høj baggrund i stroma, men ingen udtryk i Panin (pil). Målestok:. 20 pm

Diskussion

Vi viste tidligere, at N /K og P /K musemodeller udvikler lav lønklasse PanINs med lignende timing og effektivitet mellem 2 og 4 måneder af alder [6]. Disse data antydede, at PDAC initiering forekom hovedsageligt i Nestin cellelinie, som består i pancreas fra acinære celler og sjældne voksne pancreas nestin-udtrykkende celler. Stadig, den begrænsede overlevelse N /K mus forbi 6 måneder forhindrede os fra at forfølge sammenligningen til PDAC scenen. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at to nære episoder af caerulein-induceret AP hos 2 måneder gamle NK-mus ikke blot forårsage hurtig Panin progression fra lav- til høj kvalitet, men også med lav frekvens fører til PDAC. Progressionen effektivitet synes ligner igen til en observeret i P /K mus efter caerulein-induceret AP [14]. Disse data viser, at N /K-mus er en bona fide model af PDAC, og yderligere støtte, at den pankreatiske Nestin afstamning er den celle afstamning, der primært reagerer på Kras mutation i bugspytkirtlen.

Målretningen af ​​onkogene Kras til acinar rum, ved hjælp af forskellige acinære promotorer også fører til udvikling i voksne mus af PanINs [8], [9] og sjældent forekommende invasiv PDAC [7]. I N /K-mus, er Kras

G12D aktiveres i acinære celler såvel som hos voksne Nestin-udtrykkende celler. Disse senere celler udgør mindre end 0,1% af de samlede bugspytkirtlen, vises integreret i acinar struktur, men ikke vise differentiering markører (manuskript under udarbejdelse, CC og MK). På dette stadium, deres funktion er stadig ukendt. Det er vigtigt at bemærke, at de nestin regulatoriske elementer, der anvendes til disse eksperimenter målrette alle Nestin-udtrykkende celler i dyret [17]. Cre udtryk kan spores lejlighedsvis i endotelceller og mesenkymale celler, men der er ingen data i litteraturen tyder på, at kræft i bugspytkirtlen kunne indlede i ikke parenkymceller. Således tilsammen disse data giver stærke beviser for en ikke-duktalt celle oprindelse PDAC i det mindste i mus.

Progression fra Panin til kræft er markant accelereret når musene udsættes for miljømæssige fornærmelser såsom kronisk pancreatitis [7], [10]. Disse data korrelerer med humane epidemiologiske undersøgelser viser, at kronisk pankreatitis øger risikoen for at udvikle PDAC [13]. Vores data og andre viser, at caerulein-induceret AP fungerer som kræft promotor i PDAC musemodeller [14], [15], [16], hvilket tyder på, at AP, når der forekommer i en person, hvis bugspytkirtel rummer en Kras mutation, kunne potentielt øge PDAC risiko.

Ved hvilke mekanismer har AP påvirker kræft progression? Recovery fra AP i mennesker fører ikke nødvendigvis til uoprettelige skader, og kan være forbundet med bugspytkirtlen regenerering [28] som observeret i mus. I de første 3 dage efter caerulein behandling, musen pancreas udvikle rørformede strukturer i stedet for acini [23], og afstamningsceller opsporing forsøg under anvendelse af elastase promotoren antyder, at en del af disse rørformede strukturer er afledt af acinære celler, der synes at dedifferentiere, ved at gå gennem et duktalt-lignende metaplastisk mellemliggende tilstand før ind spredning [23], [29]. Nye acinære celler stammer derefter væsentligt fra allerede eksisterende acinære celler [22], [23], [29] og skal underkastes en sekundær ductal at acinære metaplasi (DAM), et vigtigt skridt for bugspytkirtlen regenerering [15]. Interessant, efter AP, acinære celler, der udtrykte oncogene Kras døde eller gennemgik ADM. Blandt de acinære strukturer undergår ADM, nogle syntes at give anledning til Panin, i det mindste i den korte periode, hvor musene blev analyseret [15]. Pancreas regenerering syntes også at være gået i stå tyder på, at Kras

G12D-udtrykkende celler, der undergik ADM ikke var i stand til at gennemgå den omvendte proces DAM til at generere nye acinarceller [15]. Vi observerede omfattende ADM /lav-grade Panin dannelse i både P /K og N /K pancreas i de 2-6 måneder efter AP skændes igen, at mange bugspytkirtlen celler reagerer på onkogen aktivering. Alligevel kan påvises kun få højere lønklasse læsioner. Det tyder på, at mens de fleste acinære celler reagerer i et vist omfang at onkogenisk Kras efter caerulein-induceret AP ved at gennemgå ADM, de ikke er kompetente til at gå videre til højere lønklasse læsioner og PDAC.

Nestin udtryk opreguleres i forskellige modeller af pancreas regenerering og Nestin er blevet foreslået som et forbigående markør af acinære dedifferentiation [26], [29]. Det er også kendt som en stamcelle markør under både embryogenese og voksenliv i forskellige organer. Man kunne så spekulere, at pancreas voksne Nestin-udtrykkende celler er i virkeligheden voksne acinare stamceller og at bugspytkirtlen regenerering efter AP sker delvis via en udvidelse af disse stamfædre. Som sådan ville voksne Nestin-udtrykkende celler potentielt være mere kompetent for kræft initiering og progression efter AP proliferation, som foreslået af ekspressionen af ​​Nestin i alle klassetrin læsioner i både mennesker og hos mus. Flere eksperimenter vil være forpligtet til at vurdere disse muligheder.

Nyt arbejde viste, at den inflammatoriske mediator Stat3 aktiveres i alle faser af bugspytkirtelkræft fra lav kvalitet Panin til PDAC og er nødvendig for kræft progression [25], [ ,,,0],30]. AP forårsager forbigående STAT3-aktivering i normale pancreas. I P /K-mus, caerulein-induceret AP fører til en større opregulering af phospho-Stat3 både i neoplastiske læsioner og den omgivende mikromiljø i 2-3 uger efter induktion. Faktisk blev phospho-Stat3 vist sig at være direkte ansvarlig for fremskyndet neoplastisk progression i P /K mus efter AP [16]. I vores model to måneder post AP, phospho-Stat3 blev kun sjældent påvises i PanINs. I modsætning hertil blev det hovedsageligt udtrykt i de omgivende inflammatoriske celler, og i ADM foci samt i små grupper af histologisk normale acinære celler. Disse observationer tyder på, at Stat3 aktivering kan være involveret i metaplastiske processer som den initiativtagende trin i neoplastisk transformation. Det faktum, at store områder af ADM stadig observeres efter 2 måneder antyder også, at andre begivenheder er nødvendige for ADM at komme videre til Panin. Øgede niveauer af Kras

G12D aktivitet kunne være en væsentlig bestanddel af denne progression [31], [32].

Nylige undersøgelser viste, at PDAC vokser langsomt over flere årtier og metastaserer kun i “sen” stadier [ ,,,0],33], [34]. Dette antyder, at tidlig opsporing og forebyggelse kunne være de mest værdifulde måder at konfrontere denne meget dødbringende kræft. Definition af celletyper, hvor kræft kan initiere samt at forstå de mekanismer, hvormed miljømæssige skader kan påvirke kræft progression er både afgørende for disse tilgange.

Materialer og metoder

Alle eksperimenter dyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Dartmouth College, protokol nummer:. 07-09-07

mus koloni generation

LSL-Kras

G12D (01XJ6-B6; 129 -Kras2

tm4Tyj) -mus blev dannet ved DA Tuveson og T. Jacks [35], og fås fra MMHCC, NCI. Nestin-Cre mus (B6.Cg-Tg (Nes-CRE) 1

Kln /J), der genereres af R. Klein [17] blev købt fra Jackson laboratoriet. Pdx1-Cre mus en gave fra G. Gu [35]. Alle genotype blev udført ved PCR efter betingelserne for udbyderne. To episoder med akut pancreatitis blev induceret ved en serie på syv time- intraperitoneale injektioner af caerulein afgivet på 2 på hinanden følgende dage, som beskrevet [14]. Caerulein (Sigma, St. Louis MO) blev fortyndet i PBS og injiceret i en dosis på 50 ug /kg legemsvægt. En anden gruppe af sammensatte mutante og kontroldyr fik injektioner af PBS alene. Alle dyr blev fastet i 12 timer før eksperimentet.

Histologi og immunhistokemi

Mus blev perfunderet med PBS derpå 10% formalin /PBS, og pancreas blev dissekeret. For βGalactosidase farvning blev vævene overført direkte efter perfusion i 30% saccharose ved 4 ° C, og 24 timer senere cryoembedded i OCT-forbindelse. Til histologi og mest immunfarvning blev pancreas fikseret natten over og behandles med henblik paraffinindlejring. Rutinemæssig Hematoxylin og eosin (H H & E og immunkemi billeder blev taget med indstillingerne Farve. Photoshop blev brugt til at behandle billederne.

Støtte Information

figur S1.

caerulein behandling fører til akut pancreatitis. H & E farvning af pancreas ubehandlede (A) og behandlet med caerulein (B, C). (B) 48 timer efter caerulein behandling (48 timer efter C), bugspytkirtlen viser omfattende ADM, exokrine atrofi og inflammatorisk infiltration. (C) ved 1 uge efter C, har bugspytkirtlen genvundet sin normale morfologi men høje niveauer af proliferation stadig observeres som vist ved Ki67-ekspression (D)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0027725.s001

(TIF)

Figur S2.

Morfometrisk analyser af P /K-mus, 6 måneder post caerulein-induceret AP. Dramatiske stigninger i antallet af dyr, der udviser omfattende ADM, høj kvalitet læsioner og PDAC /microinvasion områder er observeret, når sammenlignet med ubehandlede dyr

doi:. 10,1371 /journal.pone.0027725.s002

(TIF)

Figur S3.

Panin karakterisering i NK-mus. (A) Ki67 farvning viser en klar stigning i proliferation i lav og høj kvalitet læsioner. High-Grade PanINs udtrykker CK19 (B), MUC5A (C). Embryonale progenitorer markører reaktiveret (D, E). (F) Massons trichrom blåfarvning viser tilstedeværelse af kollagen omkring Panin læsioner. (G) Omfattende ADM er observeret som vist ved coekspression af CK19 (grøn, H) og amylase (rød, I) i de samme celler (hvide pilespidser). Scale bar: 20 pm

doi:. 10,1371 /journal.pone.0027725.s003

(TIF)