PLoS ONE: Genetiske varianter i TGF-β Pathway er forbundet med kræft i æggestokkene Risk

Abstrakt

transformerende vækstfaktor-β (TGF-β) signalvejen er involveret i en bred vifte af cellulære processer, der er ansvarlige for tumorigenese. I dette case-kontrol undersøgelse, vi anvendte en pathway tilgang til evaluering enkelt-nucleotid polymorfismer (SNP’er) i TGF-β-signalvejen som prædiktorer for ovariecancer risiko kræft. Vi systematisk genotypet 218 SNPs fra 21 gener i TGF-β-signalvejen i 417 æggestokkene kræfttilfælde og 417 matchede kontrolpersoner. Vi analyserede sammenslutninger af disse SNPs med ovariecancer risiko, udført haplotypeanalyse og identificerede potentielle kumulative virkninger af genetiske varianter. Vi udførte også analyse for at identificere højere orden gen-gen interaktioner påvirker æggestokkene kræftrisiko. Individuel SNP analyse viste, at den mest betydningsfulde SNP var

SMAD6

: rs4147407, med en justeret odds ratio (OR) på 1,60 (95% konfidensinterval [CI], 1,14-2,24,

P

= 0,0066). Kumulativ genotype-analyse af 13 SNPs med betydelige vigtigste effekter udstillet en klar dosis-respons tendens eskalerende risiko med stigende antal ugunstige genotyper. I gen-baseret analyse,

SMAD6

blev identificeret som den mest betydningsfulde gen forbundet med æggestokkene kræftrisiko. Haplotypeanalyse afslørede desuden, at to haplotype blokke inden

SMAD6

var signifikant forbundet med nedsat ovariecancer risiko, i forhold til den mest almindelige haplotype. Gene-gen interaktionsanalyse yderligere kategoriseret studiepopulationen i undergrupper med forskellige æggestokkene kræftrisiko. Vores resultater tyder på, at genetiske varianter i TGF-β-signalvejen er forbundet med æggestokkene kræftrisiko og kan lette identifikationen af ​​højrisiko undergrupper i den almindelige befolkning

Henvisning:. Yin J, Lu K, Lin J , Wu L, Hildebrandt MAT, Chang DW, et al. (2011) genetiske varianter i TGF-β Pathway er forbundet med kræft i æggestokkene Risk. PLoS ONE 6 (9): e25559. doi: 10,1371 /journal.pone.0025559

Redaktør: Reiner Albert Veitia, Institut Jacques Monod, Frankrig

Modtaget: 18 juni 2011; Accepteret: September 5, 2011; Udgivet den 30. september, 2011

Copyright: © 2011 Yin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev delvist understøttet af det amerikanske forsvarsministerium i æggestokkene Cancer Research Program under award nummer W81XWH-07-0449, og National Institutes of Health /National center for Forskning Resources /forskningscentre i Minority institutioner indrømmer 5G12RR003045-21. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den hyppigste årsag til død af gynækologisk kræft blandt kvinder i USA, med en anslået 21.880 nye tilfælde og 13,850 dødsfald i 2010 [1]. Da sygdommen er for det meste symptomfri i tidlige stadier, og der er i øjeblikket ingen effektive screeningsmetoder, 75% af kvinderne til stede med fremskreden-stadie sygdom (fase III eller IV). Det 5-års overlevelsesraten for avanceret stadie sygdommen er kun omkring 30% [2]. Ætiologien for ovariecancer forbliver stort set ukendt, selv om hormonale faktorer, inflammation og sårheling menes at spille vigtige roller [3].

Ovariecancer er en multifaktoriel sygdom og genetisk modtagelighed er blevet foreslået i tidligere undersøgelser. For eksempel mutationer i

BRCA1

,

BRCA2

,

MLH1

, og

MSH2

tegnede sig for ca. 50% af familiære æggestokkene kræftformer [ ,,,0],4], [5]. Men der er overbevisende beviser for, at de fælles genetiske varianter bidrager til kræft i æggestokkene modtagelighed, [6], [7]. For nylig har genom-dækkende forening undersøgelser (GWAs) identificeret flere fælles modtagelighed alleler i fire loci viser stærke foreninger, men som de fleste SNPs identificeret i GWAs, foreningerne er som regel lav i størrelsesorden med de fleste af disse regioner er mindre end 1,3 [8], [9], [10]. På grund af den heterogene og multigenic karakter af ovariecancer, er det usandsynligt, at en enkelt SNP vil være tilstrækkelig til at give risiko for sygdom. En omfattende vej-baseret analyse, der fokuserer på at vurdere de kumulative virkninger af et panel af SNPs ville være mere kraftfuld at lokalisere modtageligheden gener og polymorfier.

transformerende vækstfaktor-β (TGF-β) vej, herunder TGF-P’er, knoglemorfogenetiske proteiner (BMP’er), activiner, og beslægtede proteiner, er involveret i en bred vifte af cellulære processer, herunder celleproliferation, morfogenese, migration, ekstracellulær matrix produktion, og apoptose. Ændring af TGF-β superfamilien signalering er blevet impliceret i forskellige humane patologier, herunder cancer, udviklingsforstyrrelser, kardiovaskulære og autoimmune sygdomme [11], [12], [13]. Eksperimentelle data har vist, at mere end 75% af humane ovariecancere udvise resistens over for TGF-β-signalering [14], [15], hvilket antyder, at formindsket TGF-β reaktionsevne er en central begivenhed i denne sygdom. I normale ovariale overflade epitelceller, er autokrin vækstinhibering vedligeholdes af TGF-β [16], men tumorceller undslippe antiproliferative virkninger af TGF-β ved at erhverve mutationer i komponenterne i signalvejene eller ved selektivt at afbryde TGF-β. Mutationer og deletioner af Smad gener i TGF-β-signalvejen fører ofte til ustabile proteinprodukter, der hurtigt nedbrydes efter ubiquitinering og forskyde ligevægten af ​​signaleringskaskade resulterer i tumorigenese [11]. Undersøgelser har rapporteret tilstedeværelsen af ​​nogle almindelige genetiske variationer i TGF-β signalvejen at være relateret til æggestokkene carcinogenese, såsom

TGFB1

: rs56361919 i 23% af æggestokkene kræfttilfælde [17]. Desuden er mutationer og /eller ændringer i ekspressionen af ​​TGF-β-receptorer og tab af Smad4 ofte påvist i humane ovarietumorer [18].

I betragtning af den afgørende rolle, som TGF-β vej hos opretholde korrekt cellulær funktion og afbrydelse af denne vej hos ovariecancer, er det muligt, at almindelige genetiske variationer i denne pathway kan påvirke risikoen for ovariecancer. Så vidt vi ved, er der ikke udført molekylære epidemiologiske undersøgelser omfattende vurdere genetiske varianter i denne vej med æggestokkene kræftrisiko. I denne undersøgelse, vi havde til formål at teste hypotesen, at fælles germlinie genetiske varianter i TGF-β vej er forbundet med æggestokkene kræftrisiko.

Metoder

Study befolkning og dataindsamling

patientpopulation er tidligere [19] beskrevne. Kort fortalt 417 nydiagnosticerede og histologisk bekræftet æggestokkene kræftpatienter med primær malignitet blev rekrutteret på The University of Texas MD Anderson Cancer Center. Sager havde ikke modtaget nogen kemoterapi eller strålebehandling inden ansættelsen. Der var ingen begrænsninger for ansættelse i form af alder, etnicitet, eller klinisk stadium af sygdommen. De 417 kontroller var raske kvinder uden forudgående historie af kræft (bortset nonmelanoma hudkræft) og identificeret fra en stor pulje af kontrolpersonerne indskrevet i den igangværende case-kontrol studier af kræft. Controls forsøgspersoner individer ser en læge for rutinemæssige sundhed checkups eller rettet sundhedsmæssige betænkeligheder ved Kelsey-Seybold Clinic. Cases og kontroller blev modsvaret af alder (± 5 år) og etnicitet.

Demografiske karakteristika (alder og etnicitet), arbejdsforhold, rygning historie, sygehistorie, familie historie af kræft, og andre epidemiologiske data blev indsamlet for alle patienter og kontroller. For hver deltager blev en blodprøve opsamlet i hepariniserede rør til lymfocyt isolation og DNA-ekstraktion. For alle sager og kontroller blev en skriftligt informeret samtykke indhentes forud for deltagelse og donation af blodprøver. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Boards af MD Anderson og Kelsey Seybold Clinic.

SNP Valg og Genotypning

De procedurer, der anvendes til at vælge SNPs af TGF-β vej er blevet beskrevet tidligere [20 ]. Kort fortalt, vi kompilerede data fra Gene Ontology (https://www.geneontology.org) og en systematisk litteraturgennemgang at forfine gen listen i TGF-β-signalvejen. Tagging SNP’er blev identificeret fra HapMap databasen (https://www.hapmap.org) og selekteret under anvendelse LDSelect program (https://droog.gs.washington.edu/ldSelect.html) for at adskille SNP’er ind i beholdere på grundlag af bindingsuligevægt. Udvalgte tagging SNPs har en r

2 tærskel på 0,8, mindre allel frekvens (MAF) større end 0,01 i kaukasisk population og findes inden for 10 kb opstrøms for transskriptionsstartstedet og 10 kb nedstrøms for transkriptionel ende site. Potentielt funktionelle SNP’er (fx kodning SNP’er og SNP’er i uoversatte regioner, promotorer og splejsning sites) blev også inkluderet. Samlet set blev 218 SNP’er i 21 gener af TGF β pathway valgt sammen med SNPs fra andre cancer-beslægtede pathways. Komplet sæt SNPs blev sendt til Illumina teknisk support til brugerdefinerede iSelect, Infinium II BeadChip design ved hjælp af proprietære program udviklet af Illumina. Genomisk DNA blev isoleret fra perifere blodlymfocytter under anvendelse af QIAamp DNA Blood Maxi kit (Qiagen, Valencia, CA). Genotypebestemmelse fulgte standard protokol Illumina s Infinium iSelect HD Brugerdefineret Genotypning Beadchip fra Illumina (San Diego, CA). BeadStudio software blev anvendt til at kalde genotyper. Alle laboratoriepersonale blev blindet til case-kontrol status forsøgspersonerne.

Statistiske Analyser

Fordelingen af ​​kategoriske variable og kontinuerlige variabler mellem cases og kontrolpersoner blev sammenlignet af Pearsons χ

2 test og Students

t

test, hhv. For hver SNP i denne undersøgelse testede vi Hardy-Weinberg ligevægt ved anvendelse af goodness-of-fit χ

2 test til at sammenligne observeret med den forventede hyppighed af genotyper i kontrolindivider. For SNP-analyse, vi testede tre forskellige genetiske modeller, dominerende model, recessiv model og tilsætningsstof model til at identificere den bedst passer modellen med den mindste

P Drømmeholdet værdi. Hvis procentdelen af ​​de homozygote variant genotyper var mindre end fem i sager eller kontroller, vi kun betragtes som den dominerende model, som har den højeste statistiske styrke. Multipel logistisk regressionsanalyse blev brugt til at estimere odds ratio (OR) og 95% konfidensintervaller (CI), mens justering for alder og etnicitet eventuelt. Til intern validering blev en bootstrap resampling metode udført 100 gange på prøver tilfældigt trukket fra det oprindelige datasæt og en

P

værdier blev opnået for den bedste pasform model i hvert bootstrapped prøve. Kumulative effekter af SNPs blev vurderet som summen op de formodede ugunstige genotyper viser signifikant sammenhæng med risiko (P 0,05) i single SNP analyse og derefter inddelt i fire kategorier baseret på fordelingen af ​​yderste periferi. Et gen-baseret analyse blev anvendt til at undersøge sammenhængen mellem gener og ovariecancer risiko ved anvendelse sandsynligheden-kvotientkriteriet (LRT) som tidligere [21] beskrevne. Klassifikation og regression træ (CART) analyse blev anvendt til at udforske højere orden gen-gen interaktioner ved anvendelse Forventningen-Haplotype analyse blev udført under anvendelse maksimering algoritme, der implementeres i HelixTree software (Golden Helix, Bozeman, MT). Vi udførte også 10.000 bootstrap løber at konstruere 95% CIs for den yderste periferi i kumulativ genotype analyse og CART analyse. Alle statistiske analyser blev justeret for alder, etnicitet. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af STATA 10.0 (College Station, TX).

Resultater

Emne egenskaber

I denne undersøgelse var der 417 tilfælde og 417 alders- og ethnicity- matchede kontrolpersoner. Gennemsnitsalderen var 60,73 (SD: 10,36) i de tilfælde og 60,30 (SD: 10,71) i kontrolgruppen (

P

= 0,554). Størstedelen af ​​tilfældene (n = 339, 81,29%) og kontroller (n = 349, 83,69%) var kaukasiere. Af de sager, er de fleste diagnosticeret i stadie III (66,5%), hvis tumorer er af den serøs undertype (61,3%) (tabel S1).

associering mellem individuel SNP og risiko

i alt 218 SNPs fra 21 gener i TGF-β-vejen blev analyseret (tabel S2). Tyve-tre SNPs fra ti gener viste signifikante associationer med æggestokkene kræftrisiko ved

P

0,05 (tabel 1). Intern validering af bootstrapping metode identificeret 13 SNPs fra otte gener viser konsistente foreninger (dvs.

P

0,05 i 80 eller mere blandt 100 bootstrapped prøver). Den mest markante SNP var

SMAD6

: rs4147407 med emner med mindst én variant allel udviser en 1,60-fold øget risiko (95% CI, 1,14-2,24). For en anden SNP i

SMAD6

, varianten allel af rs4075546 blev forbundet med nedsat risiko (OR, 0,77; 95% CI, 0,63-0,94,

P

= 0,0099)

Vi nærmere de kumulative virkninger af disse 13 betydelige genetiske varianter i TGF-β vej på æggestokkene kræftrisiko. Sammenlignet med dem, der foretog færre end 4 ugunstige genotyper, fag bærer 5-7, viste 8-10 og 11-13 ugunstige genotyper en signifikant øget risiko med yderste periferi af 2,45 (95% CI, 1,12-5,33;

P

= 0,024), 4,42 (95% CI, 2,04-9,57;

P

= 0,00017), og 6,75 (95% CI, 2,83-16,12;

P

= 0,68 × 10

-5), henholdsvis (

P

for trend = 1,67 × 10

-8;. tabel 2)

Gene baseret analyse for kræft i æggestokkene risiko

Gene-baseret analyse identificeret

SMAD6

TGFB1 Hotel (

P

0,05 for alle SNPs undersøges i hvert gen ved hjælp af den dominerende eller additive model; tabel 3 ) som gener associeret med ovarie risiko kræft.

SMAD6

viste den mest signifikant association (

P

= 0,034), hvilket antyder, at af de undersøgte genetiske variationer i dette gen gener havde den stærkeste indflydelse på æggestokkene kræftrisiko ..

haplotypeanalyse af SMAD6 SNP’er

Som flere SNPs i

SMAD6

gen viste signifikante sammenhænge, ​​vi udførte haplotypeanalyse for de 29 SNPs genotypede i

SMAD6

. Fem haplotype blokke blev defineret af lokal bindingsuligevægt (LD) ifølge HaploView [22] (figur 1, tabel 4). Definitionen af ​​”blokke” er tidligere blevet beskrevet af Gabriel et al. [23] Vi observerede signifikante sammenhænge mellem

SMAD6

haplotyper og risiko for kræft i æggestokkene i to LD blokke, blok 1 i 5 ‘flankerende region og blokerer 2 i intron 5 region (figur 1 og tabel 4). Haplotypen H2 af blok 1 blev sammensat af SNP’er rs11857194-rs1470123-rs2053424, og fag der bærer kun én variant allel af rs1470123 viste et signifikant fald i forbindelse med kræft i æggestokkene risiko (OR, 0,72; 95% CI, 0,55-0,95;

P

= 0,018) sammenlignet med dem, der bærer den mest almindelige haplotype af kun en variant allel af rs205342. Haplotypen H1 af blok 2 består af SNP’er rs16953584-rs7182227, og fag der bærer kun én variant allel af rs16953584 viste en signifikant reduktion på 36% i risiko (OR, 0,64; 95% CI, fra 0,44 til 0,92;

P

= 0,016) i forhold til de mest almindelige haplotype af to vildtype alleler (tabel 4)

højere-ordens-gen-gen interaktioner

CART analyse blev anvendt til at udforske de højere ordens interaktioner mellem de 13 signifikante SNPs. Som vist i figur 2, træet model resulterede i fire terminale knuder med forskellige risici for ovariecancer. Den oprindelige opdeling blev defineret af

INHBC

: rs2228225, hvilket indikerer, at denne SNP er den primære faktor, der bidrager til variationer i æggestokkene kræftrisiko i studiepopulationen. Henvisningen node i træstrukturen var sammensat af

INHBC

: rs2228225 AA,

SMAD6

: rs4147407 CC, og

BMP-2

: rs235757 AA + AG genotyper. Emner i denne node viste den laveste risiko for kræft i æggestokkene. Den høje knude var sammensat af

INHBC

: rs2228225 AA og

SMAD6

: rs4147407 CT + TT og angivet den højeste risiko for kræft i æggestokkene, med en OR på 6,33 (95% CI, 2.32- 17.28;

P

= 0,0003), hvilket tyder på, at den genetiske variant af

SMAD6

: rs4147407 var en afgørende faktor for at skifte tendensen til laveste risiko for størst risiko for kræft i æggestokkene (figur 2 og tabel 5).

yderste periferi og 95% CIS (i parentes) er præsenteret under hver terminal node.

diskussion

i denne undersøgelse, vi systematisk evalueret foreningerne imellem et omfattende panel af genetiske varianter i TGF-β pathway gener og kræft i æggestokkene risiko. Vores resultater antydede, at flere SNP’er i reaktionsvejen var forbundet med ovariecancer risiko kræft. Især SNPs i

SMAD6

viste de væsentligste foreninger i enkelt SNP og haplotype analyser. Endvidere var der en kumulativ effekt af SNPs i vejen, der er tillagt en signifikant dosis-respons trend med emner, der bærer det højeste antal ugunstige genotyper udviser den største risiko. Resultater fra CART analyse foreslog højere orden gen-gen interaktioner, der yderligere definerede høj vs. risiko undergrupper i undersøgelsen befolkning lave.

En af de vigtigste resultater var signifikant sammenhæng af

SMAD6

polymorfier med æggestokkene kræftrisiko.

SMAD6

koder for et protein, der er lokaliseret i begge kerner og cytoplasma [24] og fungerer som en hæmmende Smad induceret af BMP’er og TGF-p signaler for en auto-inhiberende feedback-mekanisme i TGF-β pathway [25 ], [26].

SMAD6

gen udtrykkes i de fleste humane væv, herunder æggestokkene (figur S1). Desuden

SMAD6

blev rapporteret at være overudtrykt i æggestokkene adenocarcinom i sammenligning med normale ovarievæv [27], og ekspression af BMP-2-protein er blevet vist at inducere

SMAD6

ekspression i ovariecancerceller og var forbundet med dårlig prognose [28]. Funktionen af ​​

SMAD6

i tumorigenese er ikke veletableret. Men mutationer i

SMAD6

er blevet rapporteret, i human ovariecancer [29]. Da TGF-beta-signaler kan fungere i potent tumor undertrykkelse i normale epitelceller og i den tidlige fase tumorer [11], vi spekuleret på, at genetiske variationer i

SMAD6 kan

resultere i ændret genekspression eller regulering af signalfunktioner. I denne undersøgelse, fire polymorfier (rs4147407, rs4075546, rs16953584, og rs4776318) i

SMAD6

viste sig at være signifikant associeret med æggestokkene kræftrisiko. Blandt disse polymorfier blev rs4147407 forbundet med øget risiko, mens rs4075546, rs16953584, og rs4776318 var forbundet med nedsat risiko. Haplotypeanalyse yderligere identificeret to kandidat-loci af

SMAD6

. Haplotype blokke der er placeret i den 5′-flankerende region og intron 5 i

SMAD6

gen henholdsvis blev begge forbundet med nedsat risiko i denne undersøgelse. Men ingen af ​​disse SNPs er placeret i den kodende region af

SMAD6

, der tyder på, at disse betydelige SNPs eller de identificerede loci ikke direkte kan ændre

SMAD6

funktion, men kan ændre niveauet for gen udtryk gennem at blive placeret i regulatoriske områder eller blive knyttet til andre kausale SNPs at påvirke geners aktivitet. Yderligere

in vitro

in vivo

er brug funktionelle undersøgelser for at karakterisere den funktionelle betydning af

SMAD6

SNP’er identificeret.

CART analyse viste gene- gen samspil mellem

INHBC

,

SMAD6

, og

BMP-2

. I træet model,

INHBC

: rs2228225 var i den indledende split, hvilket tyder på, at denne variant fungerer som den primære risikofaktor for kræft i æggestokkene.

SMAD6

: rs4147407 var placeret i det andet niveau i træstrukturen og blev vist til at interagere med

INHBC

: rs2228225 at påvirke risikoen for kræft. Konkret blev variant alleler af rs4147407 forbundet med en 6-dobling i risiko sammen med almindelige allel af

INHBC

: rs2228225. Faktisk

INHBC

er blevet identificeret som beta C-kæden af ​​inhibin, et hormon, der kan regulere cellevækst og differentiering [30]. Resultatet af CART analyse yderligere styrket den afgørende rolle

SMAD6

påvirke risikoen for kræft i æggestokkene i undersøgelsespopulationen.

Vores undersøgelse har nogle begrænsninger. Chance resultater er mulig på grund af lille prøvestørrelse af undergrupper. Men vi brugte forskellige statistiske metoder til at kontrollere for falske positiver. For eksempel, vi udførte bootstrapping analyse for intern validering af de betydelige SNPs. Andre potentielle begrænsninger nævnes, at ikke-målte æggestokkene kræft risikofaktorer i denne undersøgelse (fx hormonbehandling brug) kan forvirre den samlede forening. I betragtning af, at vi testede en genetisk drevet hypotese snarere end en miljømæssig drevet hypotese, kan denne begrænsning være mindre bekymrende. Som med alle case-kontrol studier kan selektionsbias også forvirre de identificerede foreninger. Ikke desto mindre, MD Anderson fungerer som en henvisning center for mange kræftpatienter fra Kelsey Seybold Klinikker i Houston hovedstadsområdet; derfor vores kontrol er sandsynligvis repræsentere udgangspopulationen, der giver anledning til kræfttilfælde.

Som konklusion vores undersøgelse er den første undersøgelse at anvende en pathway tilgang til evaluering germlinie genetiske variationer i TGF-β-vejen og deres organisationer med æggestokkene kræftrisiko. Vi har identificeret 13 polymorfier i TGF-β pathway signifikant associeret med ovarie risiko kræft. Især SNPs i

SMAD6

viste de væsentligste foreninger. Vores data foreslog også en kumulativ effekt af SNPs i vejen, der i fællesskab påvirket æggestokkene kræftrisiko, og identificeret højere orden interaktioner, der yderligere definerer høj vs. risiko undergrupper lavt studiepopulationen. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at karakterisere funktionelle betydning af de genetiske varianter, vi har identificeret, samt at bekræfte eller eksternt validere foreninger uafhængige populationer.

Støtte Information

Figur S1.

Angivelse af

SMAD6

afskrift i humane celler og væv.

SMAD6

væv ekspression blev refereret i T1Dbase databasen en webbaseret kilde til genetisk og genomisk information om type I-diabetes (www.t1dbase.org). I denne ressource, blev humane væv og celler-type specifik genekspression data indhentet fra Novartis GNF SymAtlas database. Udtrykket data blev genereret på Affymetrix HGU133A chip og en brugerdefineret microarray

doi:. 10,1371 /journal.pone.0025559.s001

(DOC)

tabel S1.

Host Kendetegn

Doi:. 10,1371 /journal.pone.0025559.s002

(DOC)

tabel S2.

associering mellem mærkede SNPs i TGF-β vej og æggestokkene kræftrisiko

doi:. 10,1371 /journal.pone.0025559.s003

(DOC)