PLoS ONE: HSP90 Hæmning Forbedrer antimitotisk Drug-induceret mitosestandsning og celledød i prækliniske modeller af ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

HSP90 hæmmere undergår i øjeblikket klinisk evaluering i kombination med antimitotiske lægemidler i ikke- småcellet lungekræft (NSCLC), men lidt er kendt om de cellulære virkninger af denne hidtil ukendte kombination lægemiddel. Derfor undersøgte vi den molekylære virkningsmekanisme af IPI-504 (retaspimycin HCI), en potent og selektiv inhibitor af HSP90 i kombination med mikrotubulus målsøgende middel (MTA) docetaxel, i prækliniske modeller for NSCLC. Vi identificerede en delmængde af NSCLC cellelinjer, hvor disse stoffer virker i synergi for at forbedre celledød. Xenograftmodeller af NSCLC demonstrerede tumorvækstinhibering, og i nogle tilfælde, regression som respons på kombinationsbehandling. Behandling med IPI-504 forbedret de antimitotiske virkninger af docetaxel, der fører til den hypotese, at den mitotiske checkpoint er nødvendig for respons på kombinationen stof. Støtte denne hypotese, tvingende kontrolposten med en Aurora kinase inhibitor mindsket celledød synergi af IPI-504 og docetaxel. For at undersøge den molekylære basis for synergi, en neutral stabil isotop mærkning af aminosyrer i cellekultur (SILAC) proteomisk fremgangsmåde blev anvendt. Adskillige mitotiske regulatorer, herunder komponenter i ubiquitinligase, anafase-promoverende kompleks (APC /C), blev specifikt nedreguleres som respons på kombinationsbehandling. Tab af APC /C ved RNAi sensibiliserede celler til docetaxel og forbedret sine antimitotiske virkninger. Behandling med en PLK1 inhibitor (BI2536) også sensibiliserede celler til IPI-504, hvilket indikerer, at kombinationseffekter kan være bredt anvendelig til andre klasser af mitose inhibitorer. Vores data giver et præklinisk rationale for at teste kombinationen af ​​IPI-504 og docetaxel i NSCLC

Henvisning:. O’Connell BC, O’Callaghan K, Tillotson B, Douglas M, Hafeez N, West KA, et al. (2014) HSP90 Hæmning Forbedrer antimitotisk Drug-induceret mitosestandsning og celledød i prækliniske modeller af ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 9 (12): e115228. doi: 10,1371 /journal.pone.0115228

Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: 23, 2014 Accepteret: 20. november 2014 Udgivet: 26 December, 2014

Copyright: © 2014 O’Connell et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser: Forfatterne vil yderligere gerne præcisere, at på tid arbejdet blev udført forfatterne var medarbejdere og aktionærer i Infinity Pharmaceuticals, Inc. Dette ændrer ikke deres tilslutning til PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

mitotiske, eller spindel samling checkpoint bidrager til at opretholde genomisk integritet ved at forhindre missegregation af kromosomer. Et stærkt orkestreret overvågningssystem bestående af talrige proteiner registrerer separate kinetochores eller mangel på ordentlig spænding tværs mitosespindelen, udløser den såkaldte “checkpoint respons”, som fører til mitosestandsning. Normal celledeling kræver en vellykket passage gennem mitotiske checkpoint. Iagttages checkpoint krav inden for en relativt kort tidsramme (1-2 dage) kan resultere i aneuploidi, mitotisk katastrofe eller mitotisk skridning efterfulgt af en række celleskæbner herunder celledød, aldring eller endoreduplikation [1]. Mens de mekanismer, som forlængede mitose fører til celledød er uklare, en rolle for de anti-apoptotiske BCL2 familiemedlemmer er blevet rapporteret [2]. Under langvarig mitosestandsning, cyclin-cyclin afhængig kinase (CDK) proteiner phosphorylerer

BCL2

familiemedlemmer, herunder BCL2, BCL-XL, og MCL1. Phosphorylering af BCL2 og BCL-XL resulterer i frigivelse af pro-apoptotiske proteiner BAX /BAK; henviser phosphorylering af MCL1 skaber et genkendelsessite for E3 ligase, APC /CDC20, målrette den til proteasomalaktivitet nedbrydning. Funktionel redundans sandsynligvis findes blandt de

BCL2

familiemedlemmer i mediere celledød respons på langvarig mitose.

antimitotiske lægemidler rettet mod mikrotubulusdynamik (MTA’er) er meget udbredt i klinikken til at behandle en bred vifte af cancere. Disse omfatter mikrotubulus stabiliseringsmidler, (taxaner, herunder docetaxel og paclitaxel, og epothiloner) og mikrotubulus destabiliserende midler (herunder vincaalkaloider såsom vincristin og vinblastin) [3]. Desuden Maytansines (DM1, DM4) og auristatiner (MMAE, MMAF) interagere med vinca bindingssted på tubulin og anvendes almindeligvis som toksinet bundet til antistof medikamentkonjugater [4]. Mens delende tumorceller er modtagelige for MTA’er, er andre mikrotubulus-afhængige cellulære processer, såsom vesikeltrafik, neuronal transport og cytoskelet integritet også forstyrret, hvilket fører til uønskede bivirkninger, herunder neurotoksicitet og myeloid toksicitet [5]. I et forsøg på at overvinde disse bivirkninger, antimitotiske lægemidler, der er målrettet de spindel motor proteiner (KSP, EG5) eller mitotiske kinaser (PLK1, Aurora kinase A, Aurora kinase B) er under udvikling, men har haft begrænset succes hidtil i klinik [6]. HSP90 er en molekylær anstandsdame, der er ansvarlig for den korrekte foldning af talrige klient proteiner, herunder mange onkogener og muterede tumorsuppressorer [7]. Den HSP90 inhibitor IPI-504 har vist antineoplastisk aktivitet i flere prækliniske modeller af kræft, der giver begrundelse for den videre kliniske udvikling [7], [8], [9], [10], [11]. Interessant, har synergistisk aktivitet mellem HSP90 hæmning og taxaner blevet observeret i prækliniske modeller af NSCLC [12] og HSP90 hæmmere er blevet evalueret i kombination med docetaxel i kliniske undersøgelser af NSCLC (NCT01646125, NCT01348126, NCT01798485, NCT01362400). Vi identificerede en delmængde af NSCLC-cellelinier, hvori IPI-504 og docetaxel er i synergi for at forbedre celledød in vitro og inhiberer tumorvækst in vivo. Fordi den præcise molekylære grundlag for denne synergi ikke er blevet bestemt, undersøgte vi den molekylære virkningsmekanisme (MOA) af IPI-504 i kombination med docetaxel og andre mitosehæmmende lægemidler. Vores undersøgelser afslørede en MOA involverer en checkpoint afhængig forlængelse af mitose. Endvidere identificerede vi APC /C-komponenter som potentielle nye HSP90 klient proteiner, delvist ansvarlige for stoffet synergi.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr trykt af National Research Council for National Akademikere. Protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Infinity Pharmaceuticals blev Inc. Dyr aflivet ved CO

2 indånding i henhold til IACUC retningslinjer. Alle bestræbelser var at minimere dyrenes lidelser.

Cellelinjer

Menneskelig NSCLC cellelinjer H292, A549, H522, H1993, H1793 fås fra American Type Culture Collection blev opretholdt i flere passager under 5% CO

2 ved 37 ° C i RPMI 1640-medier suppleret med 10% føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich).

dyrestudier

fem- til seks uger gammel mand NCR nu /nu atymiske mus blev indkøbt fra Taconic Farms. Xenotransplantater blev genereret ved subkutan implantation af 1 til 5 × 10

6 celler i den højre flanke af mus, og behandling blev initieret, når tumorerne nåede en gennemsnitlig volumen på 120 til 300 mm

3. IPI-504 blev administreret intraperitonealt to gange om ugen i en dosis på 50 mg /kg. Docetaxel (McKeeson Pharmaceuticals) blev doseret en gang om ugen med 15 mg /kg (H1993, A549 og H292 xenograftmodeller) eller 5 mg /kg (H292 xenograftmodel) ved intraperitoneal injektion.

Tumorer blev målt tre gange om uge ved hjælp af digitale skydelærer og tumor volumen blev beregnet ved hjælp af formlen: (længde x bredde

2) /2. Resultaterne præsenteres som gennemsnit tumorvolumen ± standardfejl på middelværdien (SEM).

Celleproliferation

Celler blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 5000 celler /brønd 24 timer før til behandling med kombinationer af IPI-504 og docetaxel som angivet. Celleproliferation blev målt ved Alamar Blå (Life Technologies) eller celle Titer Glo (Promega). Celledød blev målt ved procentdelen af ​​7AAD positive celler (Guava Viacount Flex) eller ved procentdelen af ​​spaltede caspase 3 positive celler i en luminescens baseret assay (Promega; Caspase-Glo3 /7)

Synergy undersøgelser

Kombi indekser (CI) blev bestemt ved metoden ifølge Chou og Talalay [13] ved hjælp af faste og ikke-faste stof nøgletal og CalcuSyn software (Biosoft). CI værdier 1 indikerer synergi, med værdier. 0,5 indikerer robust synergi

Immunoblotting /Immunopræcipitering

For immunblotting blev celler lyseret i RIPA-lysepuffer (Sigma-Aldrich) suppleret med protease hæmmere (Roche) og phosphataseinhibitorer (stå; Thermo Fisher Scientific). For HSP90 immunpræcipiteringer blev cellepellets høstet efter lægemiddelbehandling i ikke-detergent lysis buffer (50 mM Tris pH 7,4, 20 mM NaCl, 2 mM MgC

2, 1 mM EDTA, 10% glycerol, proteaseinhibitortablet (Roche) og phosphataseinhibitorer (Thermo Fisher Scientific)) efterfulgt af tre sekventielle fryse optøningscykler til lysering. Immunopræcipitationer blev udført natten over ved 4 ° C ved anvendelse af HSP90 monoklonalt antistof (Santa Cruz) og Sepharose GammaBind G beads (GE Healthcare).

mærkning med stabile isotoper af aminosyrer i kultur (SILAC) mærkning og massespektrometri

Metabolisk mærkning af H292-celler blev udført med normale arginin og lysin eller tungere isotopiske varianter af de to aminosyrer L-lysin-HCI [

13C

6], L-arginin-HCI [

13C

6,

15N

4] ved hjælp Invitrogens SILAC-Flex Media kit og tung arginin købt hos Thermo Fisher Scientific. For at formindske prøve kompleksitet blev HSP90 immunopræcipitationer udført på lægemiddelbehandlede celler og proteiner blev separeret ved 1D-SDS-PAGE. Proteiner fra gelskiver blev spaltet under anvendelse af porcint trypsin og analyseret ved LC-MS /MS. Peptider blev renset op og koncentreret hjælp C18 stage tips (Proxeon) og adskilt ved hjælp af online C18 omvendt fase nanoskala væskekromatografi tandem massespektrometri på en Surveyor MS pumpe tilsluttet en LTQ-Orbitrap XL (Thermo Fischer Scientific) ved hjælp af en 2 timer lineær gradient . Fragmentering af de øverste 10 peptider i hver prøve blev udført ved kollision-induceret dissociation. Rå MS-filer fra LTQ-orbitrap blev analyseret ved anvendelse MaxQuant (version 1.2.2.4) [14]. MS /MS-spektre blev søgt mod lokkedue IPI-menneskelige database-version 3.68 ved hjælp af Andromeda søgemaskine. En falsk opdagelse på 0,01 blev anvendt på både peptid- og protein niveauer.

RNAi undersøgelser

H292-celler blev transficeret med 30 nM siRNA hjælp RNAimax (Invitrogen). siRNA’er blev købt fra Thermo Fisher Scientific som ON-TARGET plus SMART puljer (blanding af 4 individuelle siRNA’er per gen). SMART pool siRNA sekvenser er: ikke-targeting (krypteret) kontrol: UGGUUUACAUGUCGACUAA, UGGUUUACAUGUUGUGUGA, UGGUUUACAUGUUUUCUGA, UGGUUUACAUGUUUUCCUA; ANAPC3: GGAAAUAGCCGAGAGGUAA, CAAAAGAGCCUUAGUUUAA, AAUGAUAGCCUGGAAAUUA, GCAUAUAGACUCUUGAAAG; og ANAPC4: GCCAGAAAGUUUACUCAUA, GAUGAACAGUGUAGUGCUA, ACACGUAGAUUGUUCAAAU, CGCUUUAGCUCCAGAGAUA. Fire timer efter transfektion blev celler udsået i plader med 96 brønde, behandlet med en dosistitrering af docetaxel og høstet til flowcytometri (pH 3) eller celleproliferation (7AAD) 30 timer eller 72 timer efter lægemiddelbehandling, henholdsvis.

Flowcytometri

Cellepellets blev opsamlet ved trypsinering, fikseret i 4% paraformaldehyd ved 37 ° C i 15 minutter, anbragt på is i 5 minutter, og derefter pelleteret og resuspenderet i iskold methanol i 30 min på is. Derefter blev cellepellets vasket i 1% bovint albumin serum (BSA) i PBS to gange efterfulgt af inkubation med et FITC-konjugeret pH 3-antistof i 2 timer RT. Cellepellets blev vasket to gange med 1% BSA /PBS og resuspenderes i 2 pg /ml Hoechst (Molecular Probes) /PBS ved 37 ° C i 15 minutter. Farvede celler blev analyseret ved anvendelse af en BD LSRII Fortessa flowcytometer. FITC positive celler blev målt ved en bølgelængde på 488 nm, og DNA-indhold blev målt ved Hoechst-farvning ved anvendelse af en UV-laser. Dataanalyse blev udført ved hjælp af FlowJo software (V7.6.3).

Mikroskopi

Fase kontrast blev taget med et Nikon Eclipse TE2000-S mikroskop og Spot-software til billedoptagelse (V4.7) .

Mitotisk ryste-off

mitotiske celler blev høstet ved manuel aflytning af kolben at løsne mitotiske celler i suspension. Mitotiske celler blev isoleret fra mediet ved centrifugering (1500 rpm, 5 min), lyseret i RIPA-buffer og inkuberet i nærvær eller fravær af alkalisk phosphatase (Sigma-Aldrich).

Antistoffer og reagenser

Antistoffer for HSP90 (Santa Cruz), HSP70 (Santa Cruz), cyklin B (BD Biosciences), Securin (Abcam), ANAPC3 (Bethyl Laboratories), ANAPC4 (Bethyl Laboratories), Aurora kinase B (Bethyl Laboratories), MCL1 ( Cell Signaling Technology), GAPDH (Cell Signaling Technology), glukokortikoidreceptor (Cell Signaling Technology), og FITC-S10 phospho-histon H3 (Cell Signaling Technology) blev anvendt til immunpræcipitation, immunoblotting og flowcytometri. Aurora A /B-hæmmer (ZM447439) blev købt fra EMD Millipore og PLK1 inhibitor (BI2536) blev købt fra SelleckChem. IPI-504 blev syntetiseret ved Infinity Pharmaceuticals, Inc.

Resultater

IPI-504 og docetaxel i kombination undertrykke tumorvækst i NSCLC tumor xenograftmodeller

For at identificere NSCLC cellelinjer demonstrerer in vivo følsomhed over for kombinationen af ​​IPI-504 og docetaxel, mus bærende xenotransplantattumorer (H1993, A549, H522 og H292) blev behandlet med vehikel, 50 mg /kg IPI-504 alene, 5 eller 15 mg /kg docetaxel alene, eller en kombination af 50 mg /kg IPI-504 og 5 eller 15 mg /kg docetaxel. Behandling med IPI-504 alene hæmmede tumorvækst i forhold til køretøjet i H1993, A549, og H292 xenografter (22-48%), men havde ingen aktivitet i H522 xenotransplantater (fig. 1). Single-agent-aktivitet blev observeret efter behandling med docetaxel, hvilket resulterer i væksthæmning sammenlignet med bærer i H1993, A549 og H292 xenotransplantater (56-69%) (fig. 1A-C). I modsætning til den single-agent-aktivitet blev tumorregression observeret som reaktion på kombineret IPI-504 og docetaxel i H1993 og A549 xenograftmodeller (Fig.s. 1A og B). Tumorvækstinhibering blev styrket ved kombinationen sammenlignet med enten en enkelt middel alene i H292 xenotransplantattumorer (fig. 1C). På grund af den stærke single-agent aktivitet i H522 xenograft model, blev docetaxel-dosis reduceret fra 15 til 5 mg /kg for kombinationen undersøgelsen. Kombinationen af ​​5 mg /kg docetaxel og 50 mg /kg IPI-504 resulterede i 71% hæmning af tumorvækst sammenlignet med vehikel (fig. 1D). Disse data indikerer potentielle synergistiske virkninger af IPI-504 og docetaxel på vækstinhibering i prækliniske modeller for NSCLC.

NCR nu /nu homozygote hanmus blev subkutant implanteret med (A) H1993, (B) A549, (C ) H292 og (D) H522-celler og behandlet med DMSO-vehikel (sorte cirkler), IPI-504 (grønne firkanter), DTX (blå diamanter), eller kombinationen af ​​IPI-504 og DTX (røde trekanter). IPI-504 blev administreret ved IP-injektion i en dosis på 50 mg /kg, to gange om ugen i i alt 6 doser. DTX blev indgivet ved 5 mg /kg (H522) eller 15 mg /kg (H1993, A549, H292) ved IP-injektion, ugentligt i i alt 3 doser. Numre på grafer repræsenterer gennemsnitlig procent tumorvækst hæmning i forhold til køretøjet behandlede arm. Hvor angivet, * betegner statistisk signifikans (p 0,05) mellem kombinationsbehandling og DTX behandlingsgrupper målt på dag 30 (H1993, H549, H522) ved hjælp af t-test

IPI-504 og docetaxel. i kombination show in vitro synergi i NSCLC cellelinjer

for at undersøge MOA af et forstærket in vivo tumor hæmning med kombineret IPI-504 og docetaxel blev virkningen af ​​kombinationen på celledød og celledeling in vitro. For celledød studier i H292 celler blev kombination indekser beregnet ved anvendelse af ikke-faste stof forholdet metode Chou og Talalay, med Cl-værdier 1,0 indikerer synergi [13]. Doser af IPI-504 (75 til 125 nM) effektiv til vækstinhibering (S1A fig.) Var stort set ineffektiv til opnåelse af en cytotoksisk reaktion over kontrol i H292-celler (fig. 2A, venstre panel). Men der kombinerer IPI-504 (75-125 nM) med 50 nM docetaxel øgede H292 celledød fra 24% (docetaxel alene) til 61-68% (kombination) med CI-værdier indikerer stærk synergi (CI 0,2). Tilsvarende kombinere docetaxel (1 til 4 nM) med 2 pM IPI-504 forøgede H292 celledød fra 37% (IPI-504 alene) til 63 til 71% (kombination) med Cl-værdier indikerer synergi (CI 0,5) ( fig. 2A, højre panel).

(A) Celledød blev målt 48 timer efter behandling med ikke-fast stof forholdet kombinationer af IPI-504 og docetaxel (DTX) ved 7AAD i H292 celler. Kombination indeks (CI) blev beregnet ved hjælp af CalcuSyn software (Biosoft) med værdier 0,5 indikerer stærk synergi. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse (n = 4). Værdier for alle kombinationsbehandlinger var statistisk signifikant sammenlignet med behandlinger enkelt middel som bestemt ved t-test (p 0,01). (B) Celledød blev målt 30 timer efter lægemiddelbehandling i H1993-celler ved anvendelse af Caspase-Glo3 /7 luminescens-assay. Repræsentative data er vist (n = 2). (C) Celler blev behandlet med faste stof forhold af IPI-504 og DTX i 72 timer; celleproliferation blev målt med Alamar Blå. Vist er normaliserede isobologrammer. D = dosis, ED

50 = dosis, der kræves for at opnå 50% væksthæmning. Punkter på grafen refererer til forholdet mellem D /ED

50 for DTX på x-aksen vs D /ED

50 for IPI-504 på y-aksen. Datapunkter, der falder på diagonalen repræsenterer additivitet; over diagonalen, antagonisme; under diagonalen, synergi. (D) Behandling med PLK1 hæmmer (BI2436) sensibiliserer H292 celler til IPI-504. H292-celler blev behandlet i 72 timer med en dosistitrering af IPI-504 alene (blå diamanter) eller i kombination med 5 nM BI2536 (røde firkanter) efterfulgt af celledød assay (7AAD). Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse (n = 2).

I H1993 celler, kombinationer af lav (2 nM) eller høje (20 nm) doser af docetaxel med doser af IPI-504 repræsenterer EF

20 (14 nM), EF

50 (59 nM) eller EF

80 (255 nM) til væksthæmning (S1A fig.) blev undersøgt for celledød under anvendelse af en Caspase-Glo3 /7 assay. Stigninger på 2- til 4-fold i caspaseaktivitet blev observeret med lægemiddelkombinationen forhold til enkelte reaktioner agent for alle undtagen den laveste dosis kombination af 14 nM IPI-504 og 2 nM docetaxel (fig. 2B).

i celleproliferation studier blev et panel af cellelinier behandlet med faste forhold drug. En synergistisk reaktion på kombinationen lægemiddel blev observeret i alle fire cellelinjer for som tidligere blev observeret kombinationseffekter in vivo (figur 2C,. A549, H1993, H292, og H522). Der var ingen tegn på en synergistisk virkning af kombinationen lægemidlet i H1793-celler, hvilket antyder, at visse cellelinier ikke kan reagere på denne specifikke kombination (fig. 2C). Desværre bekræftende xenografundersøgelser ikke var muligt med H1793, da cellerne ikke voksede i enten immunkompromitterede NCR nu /nu eller NOD /SCID-mus. H292-celler blev valgt til størstedelen af ​​de efterfølgende mekanistiske undersøgelser, idet de udviste den stærkeste og mest konsekvente synergistisk respons på lægemiddelkombination in vitro, men andre cellelinier blev også undersøgt i specifikke tilfælde. Samlet set har disse resultater viser, at nogle NSCLC cellelinjer viser markante fald i celledeling og stigninger i apoptotisk celledød med kombineret IPI-504 og docetaxel behandling i forhold til de enkelte midler alene.

inhibitorer designet til at målrette mitotiske kinaser, såsom PLK1, repræsenterer en alternativ klasse af mitosehæmmende lægemidler til MTA’er. PLK1 er en vigtig regulator af mitose og en kendt HSP90 interagerende protein [15]. En PLK inhibitor (BI2536) udviser 10 gange større selektivitet for PLK1 sammenlignet med PLK2 eller PLK3 blev anvendt til at undersøge kombinationseffekter med IPI-504. Behandling af H292 celler med et EF

50 dosis af IPI-504 for væksthæmning (175 nM) øget celledød fra 24%, når det kombineres med køretøj til 45%, når det kombineres med et EF

50 dosis BI2536 for vækst inhibering (5 nM) (fig. 2D og S1B fig.). Disse data er i overensstemmelse med den hypotese, at IPI-504 kombinerer med forskellige klasser af mitosehæmmende lægemidler til at fremme celledød af uafhængige mekanismer.

IPI-504 og docetaxel kombinationsbehandling resulterer i ophobning af mitotiske celler

Da de antimitotiske virkninger af docetaxel er den molekylære basis for sin giftighed, testede vi den forudsigelse, at IPI-504 øger antimitotiske virkninger af docetaxel. Den mitotiske befolkning, også kendt som mitoseindeks, blev målt i H292-celler behandlet på forskellige tidspunkter og dosiskombinationer af IPI-504 og docetaxel. Kombinationen af ​​lav dosis (2 nM) docetaxel med IPI-504 resulterede i en forbigående stigning i mitotisk indeks (10% ved 8 timer til 26% ved 30 h) før vender tilbage til basale niveauer (4% ved 48 timer) (fig. 3A). I modsætning hertil Mitoseindeks ikke stige over baseline under hele forsøget i celler behandlet med enten IPI-504 eller docetaxel som enkelte midler (fig. 3A). En tilsvarende forbigående stigning i mitoseindeks efterfulgt af et fald blev observeret ved behandling H292 celler med en høj dosis af docetaxel (20 nM) som et enkelt middel (fig. 3B, venstre panel). Tilsætning af IPI-504 til højdosis docetaxel forøgede amplituden og varigheden af ​​mitosestandsning (fig. 3B, venstre panel). I modsætning til H292-celler, blev en stigning i mitotisk indeks ikke observeret ved behandling af A549-celler med den lave dosis (2 nM) docetaxel og IPI-504 kombination (data ikke vist), hvilket indikerer, at reaktionen på denne lægemiddelkombination kan være celle skrive specifikke. Imidlertid blev en stigning i amplituden og varigheden af ​​mitosestandsning observeret i A549-celler behandlet med den høje dosis docetaxel (20 nM) og IPI-504 kombination i forhold til docetaxel alene, sammenlignelig med det observerede i H292 celler (fig. 3B, højre panel). Da de mitotiske virkninger observeret i kombination med IPI-504 var i overensstemmelse på tværs af flere celletyper, blev højdosis docetaxel valgt til efterfølgende MOA studier.

EF

50 doser til IPI-504 blev bestemt ved 72 timer Cell Titer Glo (S1A fig.). H292 (A, B, venstre panel) og A549 (B, højre panel) celler blev behandlet med DMSO (blå diamanter), IPI-504 (røde firkanter), DTX (grønne trekanter) eller IPI-504 /DTX kombination (lilla cirkler) og høstet ved de angivne tidspunkter for tilstedeværelse af det mitotiske markering, pH 3. Repræsentative data er vist (n = 2).

Den mitotiske checkpoint er delvist ansvarlig for celledød virkninger af IPI-504 og docetaxel

mitosestandsning forud celledød i IPI -504 og docetaxel-behandlede celler antydede, at aktivering af det mitotiske kontrolpunkt er en vigtig determinant for celledød respons. For at teste denne hypotese blev en selektiv Aurora A /Aurora B kinase inhibitor (ZM447439) bruges til at tilsidesætte den mitotiske checkpoint i H292-celler behandlet med IPI-504 og docetaxel kombination. Behandling af H292 celler med ZM447439 resulterede i ophævelsen af ​​IPI-504 og docetaxel-induceret mitotisk checkpoint standsning som bestemt ved et markant fald i mitotiske indeks (fig. 4A, venstre panel). Fase kontrast billede visuel bekræftelse af afrundet (mitotiske) celler, fremtrædende fremhævede i kulturer fra IPI-504 og docetaxel behandlede celler sammenlignet med den mere udfladet morfologi IPI-504, docetaxel, og ZM447439 behandlede celler (fig. 4A, lige panel). For at evaluere effekten af ​​mitotisk checkpoint override blev celledød målt efter behandling af H292-celler med IPI-504 og docetaxel i nærvær eller fravær af ZM447439 (fig. 4B). Mens virkningerne af Aurora kinase hæmning på celledød viste variable virkninger, når de kombineres med enten IPI-504 eller docetaxel som enkelte midler (S2 fig.), Behandling med ZM447439 delvist reddet celledød synergi af IPI-504 og docetaxel, begrænse den procentdel af døde celler fra 40% til 22% (fig. 4B). Dette er konsistent med den hypotese, at den mitotiske kontrolpunkt er delvist ansvarlig for denne synergistiske effekt.

H292-celler blev behandlet i 30 timer (A, C) eller 48 timer (B) med angivne dosiskombinationer af IPI-504 (175 nM), DTX (20 nM) og Aurora kinase inhibitor ZM447439 (9 uM). Celler blev høstet for (A) flowcytometri (pH 3) og fasekontrast billeddannelse, (B) celledød (7AAD), og (C) immunoblotanalyse. En pil angiver en langsom migrerende, phosphorylerede form af Securin. Fejl barer for mitoseindeks og celledød repræsenterer standardafvigelsen af ​​gentagelser fra to uafhængige forsøg.

Samtidig med mitosestandsning, IPI-504 og kombinationer docetaxel-dosis førte til en ophobning af de mitotiske proteiner Securin, Cyclin B, og AURKB (fig. 4C). Fremkomsten af ​​en langsom migrerende form af Securin, menes at repræsentere den aktive, phosphorylerede form [16] blev observeret specifikt i celler behandlet med IPI-504 og docetaxel kombination (fig. 4C, pil). Den langsomme migrerende formular blev omdannet til hurtigt migrerende form efter phosphatase behandling, hvilket bekræfter, at den langsomme migrerende formen repræsenterer phosphorylerede form (S3 Fig.). Ophævelse af IPI-504 og docetaxel induceret opregulering af mitotiske proteiner Securin, cyklin B, og AURKB blev observeret ved co-behandling med ZM447439 (fig. 4C). I modsætning hertil samtidig behandling med ZM447439 ikke ophæver IPI-504 inducerede opregulering af HSP70, en surrogatmarkør for HSP90 inhibition [17], hvilket indikerer, at IPI-504 er stadig aktiv i disse celler.

Det er blevet rapporteret, at under langvarig mitosestandsning, phosphorylering af anti-apoptotisk protein MCL1 af cyklin B-CDK1 iværksætter sine APC /C-afhængige ødelæggelse, hvilket fører til celledød under mitose [18]. Interessant nok blev nedregulering af MCL1 protein observeret specifikt i H292-celler behandlet med IPI-504 og docetaxel kombination, en effekt, der blev ophævet ved samtidig behandling med Aurora kinase inhibitor (fig. 4C).

anafase-promoverende kompleks (APC /C) komponenter er specielt udtømt fra HSP90 interactome i IPI-504 og docetaxel behandlede celler

Ved hæmning af HSP90, fejlfoldede klient proteiner dissocierer fra HSP90 og efterfølgende målrettet til proteasom-medieret nedbrydning [19]. For at identificere potentielle klient proteiner, der bidrager til synergi IPI-504 og docetaxel, blev SILAC udført og HSP90 interagerende proteiner, der omfatter “interactome” blev identificeret under forhold med medicinsk behandling ved massespektrometri. Den HSP90 interactome for den forreste eksperiment, hvor H292 celler mærket med tunge isotoper af lysin og arginin blev behandlet med kombinationen af ​​IPI-504 og docetaxel og H292-celler mærket med normal lysin og arginin blev behandlet med vehikel alene blev undersøgt og sammenlignet med data opnået fra den omvendte eksperiment, hvor H292 celler mærket med de tunge isotoper blev behandlet med bærer alene og H292 celler mærket med de normale isotoper blev behandlet med kombinationen af ​​IPI-504 og docetaxel (fig. 5A). Som forventet, Hsp70 var stærkt opreguleret i HSP90 interactome på IPI-504 og docetaxel behandling (fig. 5B) [17]. Ligeledes Glucocortocoid Receptor (GR), en kendt HSP90 klient protein, var kraftigt nedreguleret fra hsp90 interactome ved kombinationsbehandlingen (fig. 5B) [20]. Flere potentielle roman HSP90 klient proteiner blev identificeret, som blev nedreguleret som respons på kombinationen, hvoraf en række spiller en rolle i den mitotiske checkpoint respons (S1 tabel). Disse omfattede to komponenter af APC /C, ANAPC3 og ANAPC4 (fig. 5B). For at bekræfte de SILAC data blev protein overflod bestemt ved Western blot-analyse af lysater indsamlet fra H292-celler behandlet med IPI-504 og docetaxel i kombination (Fig 5C;.. S4 Fig). Svarende til GR, nedregulering af både ANAPC3 og ANAPC4 blev observeret ved behandling af H292 med kombinationen af ​​IPI-504 og docetaxel sammenlignet med bærer (fig. 5C). Opreguleringen af ​​Hsp70 blev bekræftet ved behandling med IPI-504 alene eller i kombination med docetaxel (fig. 5C) .Den bidrag APC /C til celledød synergi med kombinationen af ​​IPI-504 og docetaxel blev vurderet ved at undersøge, om tab af APC /C-komponenter kunne erstatte IPI-504 i sensibiliserende celler til docetaxel. APC /C komponenter ANAPC3 og ANAPC4 blev slået ned med siRNA enkeltvis eller i kombination, og virkningerne på celleproliferation blev målt efter docetaxel-behandling. Ved koncentrationer på docetaxel større end 5 nM, plateauet af celledød steget fra 63% i den krypterede siRNA kontrol, til 73% ved ANAPC4 knockdown, og 80% ved ANAPC3 knockdown alene eller i kombination med ANAPC4 knockdown (Fig. 5D, venstre panel). Tab af APC /C-komponenter forbedret de antimitotiske virkninger af docetaxel, øger det mitotiske indeks fra 17% med docetaxel (10 nM) alene til 33%, når de kombineres med ANAPC3 /ANAPC4 tab (Fig. 5D, højre panel). Western blot-analyse bekræftede effektiv knockdown af APC /C-komponenter (fig. 5e).

(A) mærkning med stabile isotoper af aminosyrer i kultur (SILAC) skematisk. Metabolisk mærket H292-celler blev behandlet i 24 timer med kombinationen af ​​300 nM IPI-504 og 10 nM DTX eller vehikel (DMSO), efterfulgt af identifikation af HSP90 interactome ved massespektrometri. (B) Rådata fra SILAC undersøgelsen. Datapunkter i den øverste højre og nederste venstre kvadranter repræsenterer proteiner, der op-regulerede og ned-regulerede, henholdsvis i HSP90 interactome ved behandling med kombinationen i forhold til køretøjet. De to pile i øverste højre kvadrant repræsenterer uafhængige peptidfragmenter med unikke sekvenser rettet mod HSP70. (C) Immunoblotanalyse verificerer udtømning af ANAPC3 og ANAPC4 på 24 timer behandling af H292-celler med 300 nM IPI-504 og 10 nM DTX kombination. GR = glukokortikoidreceptor. (D) Tab af APC /C-komponenter af RNAi sensibiliserer H292 celler til DTX medieret celledød (72 h, 7AAD) (venstre felt) og øger det mitotiske indeks (30 h, pH 3) (højre panel). H292-celler blev transficeret med nontargeting scrambled siRNA (blå diamanter) eller siRNA målretning ANAPC3 (røde firkanter), ANAPC4 (grønne trekanter), eller ANAPC3 /ANAPC4 kombination (lilla cirkler). (E) Immunblotanalyse viser knockdown effektivitet. Repræsentative data er vist (n = 2).

Diskussion

MTA’erne der forstyrrer mikrotubulusdynamik er blandt de mest effektive antimitotiske behandlinger for en bred vifte af cancerformer. Desværre, MTA-relaterede toksiciteter og lægemiddelresistens fortsat store udfordringer.