PLoS ONE: nedregulering af mir-221 og mir-222 Begrænse prostatakræft Cell Proliferation og migration, der delvist medieret ved aktivering af SIRT1

Abstrakt

Undersøgelser har vist, at miR-221 og miR-222 er dereguleret i mange kræftformer, herunder prostatakræft. Alligevel er den biologiske rolle og de underliggende mekanismer af MIR-221 og MIR-222 i patogenesen af ​​androgen-uafhængig prostatacancer er stadig ikke klarlagt. Spredningen, apoptose, cellecyklus skelnen, og migration kapacitet prostata celler blev bestemt følgende transfektion af miR-221 eller miR-222-hæmmer. Den biologiske effekt og regulering af SIRT1 om prostatacancerceller blev undersøgt. MIR-221 og MIR-222 blev højt udtrykt i PC-3-celler sammenlignet med i LNCaP-celler. Efter miR-221 eller miR-222-ekspression blev hæmmet, spredning og migration satser af PC-3 celler faldt, og apoptose steg. Desuden SIRT1 protein blev opreguleret i celler efter at de var transficeret med MIR-221 eller MIR-222-inhibitor. Celler transficeret med siSIRT1 viste øget migration og en nedsat apoptose hastighed, men der var ingen signifikant virkning på celleproliferation sammenlignet med kontrollerne. Der var en negativ korrelation mellem miR-221 eller miR-222 og SIRT1, men ingen direkte mål forholdet blev identificeret. Disse data viser, at MIR-221 og MIR-222 er højt udtrykt i PC-3-celler. Deres hæmning medfører reduceret celleproliferation og migration og øget apoptose i prostata kræftceller. Disse effekter er potentielt medieret af opregulering af SIRT1

Henvisning:. Yang X, Yang Y, Gan R, Zhao L, Li W, Zhou H, et al. (2014) nedregulering af mir-221 og mir-222 Begrænse prostatakræft Cell Proliferation og migration, der delvist medieret ved aktivering af SIRT1. PLoS ONE 9 (6): e98833. doi: 10,1371 /journal.pone.0098833

Redaktør: George Calin, University of Texas, MD Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: Februar 25, 2014 Accepteret: 7 maj 2014; Udgivet: 3 juni 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China og Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (81170257 og Y2110513). Denne undersøgelse blev også delvist støttet af MD Anderson Cancer Center Startup Fund. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er en af ​​de mest almindelige maligne lidelser og den anden hyppigste årsag til kræft død for mænd i den vestlige verden. Ca. 238.590 nye tilfælde blev diagnosticeret i 2013 [1]. De fleste PSA vokser langsomt og er afhængige af androgen til vækst; derfor, de reagerer på androgen deprivation behandling (ADT). ADT er effektiv, men de fleste patienters sygdom vil i sidste ende blive ildfast og fremskridt fra androgen-afhængige PCa til androgen-uafhængig (kastrationsresistent) PCa, som bragte store udfordringer til behandling af PCa [2]. Således identificerer en ny og effektiv terapeutisk tilgang er blevet fokus i kampen mod PSA.

MikroRNA’er (miRNA) er små (ca. 21-23 nukleotider), ikke-protein-kodende RNA’er, der fungerer som post- transkriptionelle regulatorer af målgener. Disse molekyler er hovedsageligt findes i eukaryoter og er fuldt eller delvist integreret, som supplement, med mål mRNA 3’UTR, hvilket resulterer i nedbrydning eller oversættelse hæmning af target mRNA. miRNA funktioner i transkriptionel og post-transkriptionel regulering af genekspression, som påvirker mange cellulære biologiske processer [3]. miRNA er involveret i flere celledifferentiering, spredning, og apoptose processer, der er tæt knyttet til tumorigenese [3]. For nylig blev nogle udtrykkes afvigende miRNA opdaget i PCa og andre kræftformer, hvilket indikerer, at de spiller en kritisk rolle i den molekylære mekanisme for kræft patogenese og progression [2], [4] – [8]. Desuden har undersøgelser vist, at MIR-221 og MIR-222 er dereguleret i mange cancertyper, herunder PCa [9] – [14], og de to miRNA spiller en vigtig rolle i tumorigenese og progression fra androgenafhængig PCa til androgen-uafhængig PCa [15] – [17]. Alligevel er resultaterne er inkonsekvente og endog kontroversielt og de underliggende mekanismer er stadig ikke klarlagt.

I pattedyr, tavse oplysninger regulator 1 (SIRT1) er et medlem af sirtuin familie og har vist sig at være meget homologe med SIRT2 i gær [18]. SIRT1 er også kendt som NAD-afhængig histon deacetylase og er involveret i reguleringen af ​​mange fysiologiske processer, såsom celleproliferation, det inflammatoriske respons, cellecyklussen, og cellevandring [19]. Det er imidlertid uvist, om SIRT1 virker som en promotor-gen eller suppressor gen på grund af dens kompleksitet [20] – [23]. Dens rolle i kræft er ikke veldefineret. For eksempel viste SIRT1 anti-onkogen virkning og dets ekspressionsniveau var forbundet med prognosen hos tyktarmskræft [24], [25]. Alligevel anses det et onkogen i brystcancer [26]. I PCa er dog stadig rolle SIRT1 kontroversielle [27], [28].

I denne undersøgelse undersøgte vi deres regulerende rolle miR-221 og miR-222 og deres potentielle molekylære mekanismer PCa ved transfektion miR-221 eller miR-222-hæmmer i PCA celler.

Materialer og metoder

Cell kultur og plasmid transfektion

Menneskelig PCa PC-3 celler (androgen-uafhængig ) og LNCap celler (androgen-afhængige) blev købt fra Institut for Biokemi og Cellebiologi, Chinese Academy of Sciences. Celler blev holdt i F12 (Gibco, Carlsbad, CA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære.

pcDNA3.1- tom vektor (pEX-5), pcDNA3.1-HSA-MIR-221 inhibitor svampe (miR-221-hæmmer), pcDNA3.1-HSA-miR-222 inhibitor svampe (miR-222-hæmmer), pGPU6-tom (pGPU6) og pGPU6-siSIRT1 (siSIRT1) blev syntetiseret ved GenePharma (Shanghai, Kina). Den vildtype SIRT1 3’UTR region blev bygget i psiCHECK-2 ved GenePharma (Shanghai, Kina). PC-3-celler blev dyrket til 80% -90% konfluens og transficeret med plasmider ved anvendelse af Lipofectamine 2000 (DNA /Lipofectamine 2000 = 1/2) ifølge producentens instruktioner. Fire timer efter transfektion blev dyrkningsmediet erstattet med frisk F12 indeholdende 10% FBS. En stabil transfektion ekspression af cellelinier blev etableret efter cellerne var blevet inkuberet i komplet F12 medium med G418 (1000 ug /ml) i 15 dage. Vi verificerede klonerne anvendelse af Western-blot og real time PCR, og pooles de udvalgte kloner for eksperimenterne. Resultaterne af kontrollen af ​​western blot er vist i figur S1. Desuden blev alle forsøgene også bekræftet ved transient transfektion.

Celleproliferation og cellecyklus assay

I den celleproliferationsassay, vi podet PC-3-celler med etableret stabil ekspression (pEX- 5, mIR-221-inhibitor, mIR-222-inhibitor, pGPU6 eller siSIRT1) i 96-brønds mikroplader med en tæthed på 2 x 10

3 brønd og inkuberet dem for forskellige tidsrum (1 til 7d). Efter dette, 10 pi Cell Counter Kit-8 (CCK-8) reagens til hver brønd og inkuberede celler ved 37 ° C i 1,5 timer. Absorbans blev målt ved 450 nm med en elektroluminescens immunsorbentassay (ELISA) læser.

I cellecyklus assay transficerede celler blev podet i 12-brønds plade i 48 timer. Cellerne i hver brønd blev opsamlet og fikseret med 70% iskold ethanol i 24 timer ved -20 ° C. Efter at være blevet vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) tre gange, blev de inkuberet med RNase i 1 time på is og farvet med propidiumiodid i 15 minutter på is. DNA fordeling blev målt ved flowcytometri i 4 timer.

Apoptose assay

Stabilt transficerede celler blev podet i 12-brønds plader og dyrket i 48 timer. Celler blev derefter høstet og opsamlet ved centrifugering ved 2000 rpm. Efter at være blevet vasket med PBS tre gange, blev de farvet med Annexin V-forstærket grønt fluorescerende protein (FITC) og propidiumiodid (PI) i 15 min, beskyttet mod lys. Celleapoptosen blev bestemt ved flowcytometri i 1 time.

Sårheling assay og transwell migration assay

En sårheling assay blev udført for at efterligne cellemigrering [26]. Kort fortalt blev transficerede celler udpladet i en seks-brønds plade ved en tæthed på 1 x 10

6 celler pr. Cellerne blev dyrket til 80% konfluens og flere oprullede linjer blev ridset vertikalt til bunden med en 200- pi pipettespids. Efter at være blevet vasket med PBS tre gange blev cellerne inkuberet i vækstmedium indeholdende 1,5% serum. Såret bredde blev bestemt hver 24 timer over en periode på 72 timer ved × 100 under et Nikon Eclipse TS100 mikroskop (Nikon, Japan). Værdier blev udtrykt som procentdelen af ​​sår lukning, der blev beregnet som følger: procentdel af sårlukning = 1- (bredde

t-service /bredde

0

) × 100 %.

i cellen transwell migration assay blev cellerne udsultet i 24 timer, resuspenderet med serumfrit F12-medium og podet (5 x 10

4 celler) i en 24-brønds Transwell med en 8- um pore membran indsats (Corning, USA). F12-medium, suppleret med 10% FBS, blev anbragt i det nedre kammer som en kemoattraktant. Cellerne blev inkuberet i 72 timer. Celler, som trængte membranen blev fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter, farvet med krystalviolet i 30 minutter ved omgivelsestemperatur, og fotograferet under et mikroskop (Nikon, Japan). Invaderede celler blev elueret ned med eddikesyre. Absorbans blev målt ved 590 nm i en ELISA-læser.

revers transkription og tidstro polymerasekædereaktion

Otteogfyrre timer efter transfektion, totalt RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler under anvendelse af TRIzol (Invitrogen , USA) i overensstemmelse med producentens protokoller. For miRNA og SIRT1 revers transkription, blev 500 ng af total RNA revers transkriberet til cDNA med miRNA-specifikke RT primere (RiboBio, Kina) og tilfældig primer (Takara, Japan), hhv. Genekspression blev målt ved real-time kvantitativ polymerase-kædereaktion (PCR) under anvendelse af et Applied Biosystems 7500 Fast Sequence Detection System og SYBR Green PCR-kittet (QIAGEN, Tyskland) under de følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 10 sek og annealing og forlængelse ved 60 ° C i 30 sek. De relative miRNA og mRNA ekspressionsniveauer blev normaliseret ved U6 og β-actin henholdsvis.

Western blot-analyse

Tooghalvfjerds timer efter transfektion, cellerne blev høstet og lyseret i nærvær af en proteaseinhibitorcocktail og centrifugeret ved 12.500 rpm i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatantfraktionen blev opsamlet, og proteinkoncentrationen blev målt ved anvendelse af en bicinchoninsyre proteinassaykit (Shenggong Bio-Tech Co., Ltd., Shanghai, Kina). En portion på 80 ug denatureret protein fra hver prøve blev påført på 10% natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese og overført til nitrocellulosemembraner. Membraner blev blokeret med 5% skummetmælk i 2 timer ved omgivelsestemperatur, efterfulgt af inkubation med primært antistof (1:2000 fortynding Abcam, USA) ved 4 ° C natten over og peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (1:1000 fortynding Abcam , USA) i 1 time ved omgivelsernes temperatur. Blottene blev derefter inkuberet med forøget kemiluminescens i 2 min. Signalerne blev detekteret og kvantificeret ved densitometri under anvendelse Mængde One-software. β-actin blev anvendt som en endogen kontrol til normaliserede udtryk data

SIRT1 mål forudsigelse og luciferaseaktivitet assay

miRNA mål blev forudsagt ved hjælp Miranda database (http:. //www.microrna. org /). For luciferaseaktiviteten assay 2341 nukleotider til 2731 (det komplette forudsagte MIR-221 og MIR-222 målsted af SIRT1-3’UTR) blev indsat nedstrøms for Renilla luciferase gen i en Renilla /ildflueluciferase reporterplasmid, psiCHECK- 2 (GenePharma, Shanghai, Kina). PC-3-celler blev transficeret med 0,5 ug af reporterplasmider per brønd plus MIR-221 eller MIR-222 inhibitorplasmid. Otteogfyrre timer efter transfektion, Renilla /ildflueluciferase blev målt ved dobbelt luciferase reporter assay (Promega, USA) i et automatisk mikropladelæser (Thermo, USA).

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS softwareversion 17,0 (Chicago, Illinois, USA). Data blev udtrykt som middelværdien ± SEM. Statistisk signifikans blev bestemt ved en analyse af varians eller to-halet t-test. En p-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle forsøg blev udført mindst tre gange.

Resultater

Angivelse af mir-221 og mir-222 i PCA celler

MIR-221 blev stærkt udtrykt i PC-3 celler sammenlignet med LNCaP (P 0,05) (figur 1A). Tilsvarende blev MIR-222 også markant forøget i PC-3-celler sammenlignet med LNCaP (P 0,01) (figur 1B). Transfektion med MIR-221 inhibitor dramatisk undertrykt ekspression af MIR-221 i PC-3-celler (P 0,05) (figur 1C). Ligeledes blev MIR-222-ekspression faldt betydeligt efter transfektion af MIR-222-inhibitor (P 0,01). (Figur 1D) Salg

(A) MIR-221 niveauer i PC-3 og LNCaP-celler. (B) MIR-222 niveauer i PC-3 og LNCaP-celler. (C) MIR-221 niveauer i PC-3-celler efter transfektion med PEX-5 (tom vektor plasmid) eller MIR-221-inhibitor. (D) MIR-222 niveauer i PC-3-celler efter transfektion med PEX-5 eller MIR-222-inhibitor. Dataene repræsenterer middelværdien ± SEM fra tre separate forsøg.

* P 0,05,

** P. 0,01

Virkninger af mir-221-hæmmer og mir-222 inhibitor på celleproliferation, cellecyklus distribution og apoptose i PC 3-celler Salg

Som vist i figur 2, sammenlignet med celler transficeret med tom vektor (pEX-5), celler transficeret med mIR-221 inhibitor eller mIR-222-inhibitor, viste signifikant reduceret proliferation på femte, sjette, og syvende dage (P 0,05 vs PEX-5,

**, ## P 0,01 vs PEX-5

En flowcytometri analyse viste, at 70,2 ± 1,8% af. celler transficeret med pEX-5 var i G0 /G1 faser, hvorimod 87,1 ± 2,0% og 81,9 ± 0,9% af cellerne transficeret med mIR-221 inhibitor og mIR-222-inhibitor var i G0 /G1, henholdsvis (P 0,01) ( figurerne 3 A og B). Transfektion med MIR-221 inhibitor eller MIR-222-inhibitor resulterede i en meget lavere procentdel af celler i S-fase sammenlignet med dem transficeret med PEX-5 (4,9 ± 1,9% eller 9,9 ± 1,1% vs. 21,9 ± 1,7%, P 0,01 ). Der var ingen signifikante forskelle i celler i G2 /M faser blandt grupperne.

(A) Cell DNA-indhold uddeling i hver fase. (B) Procentdel af celler, der distribueres i hver fase af cellecyklussen. **,

## P 0,01 vs PEX-5

De apoptose satser for PC-3-celler transficeret med miR-221-hæmmer eller miR-222-inhibitor blev forøget med 2,8 gange. og 2,6 gange, sammenlignet med dem, transficeret med pEX-5 (P 0,05). (figur 4A og B)

(A) den apoptotiske celle distribution af PC-3-celler transficeret med pEX-5 miR -221 inhibitor eller mIR-222-inhibitor ved flowcytometri. (B) Relativ apoptose på hver gruppe. Dataene repræsenterer middelværdien ± SEM fra tre separate forsøg (

*, # P. 0,05 vs PEX-5

Virkninger af mir-221-hæmmer og mir-222-hæmmer på PC. 3 cellemigration

som vist i figur 5A og B, lukning satserne for miR-221-hæmmer og miR-222 inhibitor grupper var lavere end var, at PEX-5 gruppe. for eksempel er de lukning satser var 25 ± 1,5% og 34 ± 2,9% for mIR-221 og mIR-222 inhibitorer, henholdsvis mod 57 ± 7% for pEX-5 (P 0,01).. efter 72 timer Lignende resultater for hæmning af migration blev observeret under anvendelse af et transwell assay Som vist i figur 5C og D, blev cellemigration faldt betydeligt efter transfektion med mIR-221 inhibitor eller mIR-222 inhibitor sammenlignet med i celler transficeret med pEX-5 (P 0,01).

(A) Sårheling assay viser lukning satser celler transficeret med pEX-5 (tom vektor plasmid), miR-221-hæmmer, eller mIR-222-inhibitor. (B) Kvantificering af sårlukning satser på forskellige tidspunkter. (C) Transwell assay viser, at cellerne gennemtrængt indsatsen membran. (D) Kvantificering af antallet af celler, der trængte insertet membran. Dataene repræsenterer middelværdien ± SEM fra tre separate forsøg.

*, # P 0,05 vs PEX-5,

**, ## P 0,01 vs PEX-55)

Hæmning af mir-221 og mir-222 stigning. SIRT1 proteinekspression

Western blot-analyse viste, at SIRT1 proteinniveauer af celler transficeret med mIR-221 inhibitor og mIR-222-inhibitor blev markant forøget sammenlignet med dem for celler transficeret med pEX-5 (P 0,05 og P 0,05 vs PEX-5,

## P. 0,01 vs PEX-5

Effekter af SIRT1 på proliferation, apoptose og migration i pc-3 celler

SIRT1 ekspression blev signifikant undertrykt i celler transficeret med siSIRT1 sammenlignet med dem transficeret med pGPU6 som en kontrol (figur 7A). Der var ingen signifikante forskelle i celleproliferation mellem celler transficeret med siSIRT1 og pGPU6 (Figur 7B). Celler, der var transficeret med siSIRT1 resulterede i en to-fold reduktion i apoptose rate sammenlignet med i celler transficeret med pGPU6 (P 0,01) (figur 8A og B). Interessant migreringen af ​​celler transficeret med siSIRT1 blev signifikant forøget sammenlignet med den for celler transficeret med pGPU6 (P 0,05). (Figur 9A og B)

(A) SIRT1 proteinniveauer i PC-3-celler transficeret med pGPU6 (tom vektor plasmid) eller siSIRT1 (pGPU6-si-SIRT1) ved Western blot analyse. (B) Celleproliferation blev kvantificeret ved anvendelse af en CCK-8 assay. Der var ingen signifikante forskelle mellem de to grupper (P 0,05). Dataene repræsenterer middelværdien ± SEM fra tre separate forsøg.

(A) Apoptose blev målt ved flowcytometri INPC-3-celler transficeret med pGPU6 eller pGPU6-siSIRT1. (B) Relativ apoptose på hver gruppe. Dataene repræsenterer middelværdien ± SEM fra tre separate forsøg.

** P. 0,01 vs pGPU6

(A) En transwell assay blev anvendt til at måle migreringen af ​​celler transficeret med pGPU6 eller pGPU6-siSIRT1. (B) Antallet af celler trængte insertet membran. Dataene repræsenterer middelværdien ± SEM fra tre separate forsøg.

* P. 0,05 vs pGPU6

SIRT1 er ikke et direkte mål for mir-221 og mir-222

Som Miranda data viser, miR-221 og miR -222 bundet til en af ​​de target sekvenser lokaliseret i 3′-UTR af SIRT1 mRNA (figur 10A). For at sikre den direkte interaktion mellem miR-221 eller miR-222 og SIRT1 mRNA-3’UTR blev luciferaseaktivitet assay udført. Imidlertid luciferaseaktiviteter viste ingen statistisk signifikante forskelle i MIR-221 eller MIR-222 niveau i PC-3-celler cotransficeret med SIRT1-3’UTR bindende sekvens reporterplasmidet sammenlignet med kontrollen (figur 10B). Med andre ord havde MIR-221 og MIR-222 ikke binde til SIRT1 sekvensen direkte og ikke udøvede en direkte biologisk interaktion.

(A) De komplementære bindingssteder af MIR-221 og MIR-222 på SIRT1-3’UTR forudsagt af miranda database. (B) Luciferase aktivitet blev udført for at kontrollere bindingen og interaktionen af ​​miR-221 og miR-222 med SIRT1. Der var ingen forskel i luciferaseaktivitet blandt grupperne (P 0,05). Dataene repræsenterer middelværdien ± SEM fra tre separate forsøg.

Diskussion

Flere undersøgelser har vist, at MIR-221 og MIR-222 er opreguleret i forskellige cancerformer og er således velovervejede onkogener [9], [13], [29]. Faktisk har undersøgelser vist, at miRNA påvirke en række biologiske processer gennem komplementær binding til et eller flere målgener. For eksempel, p27, TRPS1, PTEN, Arhi, TIMP3, HECTD2 og RAB1A var målet gener af miR-221 og miR-222 [10], [11] ,. Disse resultater antyder, at disse miRNA er et terapeutisk mål. Vi har vist, at niveauerne af miR-221 og miR-222 blev forøget betydeligt i PC-3 celler sammenlignet med i LNCap celler, hvilket er i overensstemmelse med andre fund [34]. Nedregulering af miR-221 eller miR-222 udtryk hæmmede celle proliferation og migration og øget apoptose i PC-3 celler. Endvidere effektiv transfektion af MIR-221 inhibitor eller MIR-222-inhibitor resulterede i en højere procentdel af celler i G0 /G1 faser og en lavere procentdel af celler i S-fase. Disse resultater indikerer, at hæmning af miR-221 eller miR-222 udtryk udøver vigtige biologiske effekter på celleproliferation, apoptose, celle migration, cellecyklus distribution og celle overgang i PC-3 celler. Udtrykket af SIRT1 blev øget i PC-3 celler efter miR-221 og miR-222 var nedreguleret. Dette fund tyder på, at SIRT1 spiller en suppressiv rolle mod det tumor-fremmende virkning af MIR-221 og MIR-222. SIRT1 er blevet rapporteret at begrænse LNCaP-proliferation [35]. Wang et al. demonstreret reduceret SIRT1 udtryk i PCa væv sammenlignet med i benign prostatahyperplasi væv [27]. SIRT1 kan tjene som en tumor promotor eller tumor-suppressor, afhængigt af den onkogene pathway specifikke for bestemte tumorer [19], [22], [24]. SIRT1 kan virke som et onkogen ved at inhibere tumorsuppressorgener, såsom p53 [36], og kan virke som et anti-onkogen ved at undertrykke adskillige onkogener eller oncoproteiner såsom β-catenin og survivin [37], [38].

i vores undersøgelse vælte SIRT1 i PC-3-celler førte til øget cellemigrering og en nedsat apoptose hastighed, men ingen signifikant forskel blev observeret i celleproliferation. Disse resultater tyder på, at SIRT1 deltager i migration undertrykkelse og apoptose fremme i PC-3 celler, men har ringe rolle i reguleringen af ​​cellernes levedygtighed. Inhibering MIR-221 og MIR-222-ekspression forstærket SIRT1 ekspression, hvilket antyder, at den observerede øgede apoptose og nedsat migration efter transfektion med MIR-221 eller MIR-222 inhibitor reguleres af SIRT1 aktivering. Disse celler ‘spredning-undertrykkelse kapacitet efter miR-221 og miR-222 nedregulering kan moduleres gennem andre molekylære veje, såsom p27 [31] eller Arhi [39]. Selv SIRT1-3’UTR eksisterer i de bindende steder af miR-221 og miR-222, har en luciferase reporter assay ikke identificere et direkte bindende forhold mellem SIRT1 og miR-221 eller miR-222. Dette antyder, at MIR-221 og MIR-222 indirekte begrænse ekspressionen af ​​SIRT1 gennem andre molekylære veje. er behov for yderligere undersøgelser for at belyse de mekanismer og molekylære veje for miR-221, miR-222, og SIRT1 der er involveret i PCA patogenesen ved overekspression de to microRNA og modulere ekspressionen af ​​SIRT1 i forskellige cellelinier. Det bør også overvejes undersøgelse af de biologiske funktioner af MFI-221/222 og SIRT1 og deres forhold in vivo ved anvendelse dyremodel.

Sammenfattende er MIR-221 og MIR-222 stærkt udtrykt i PC-3-celler . Hæmning af miR-221 eller miR-222 udtryk reducerer celle proliferation og migration og øger apoptose i PCA celler. SIRT1 protein opreguleres i celler efter transfektion af MIR-221 eller MIR-222-inhibitor. Celler transficeret med siSIRT1 viser øget migration og en nedsat apoptose sats, men ingen effekt på celleproliferation. Disse data indikerer, at de biologiske virkninger af MIR-221 og MIR-222 på prostatacancerceller er forbundet med SIRT1. Modulation af ekspression af disse molekyler kan påvirke tumorigenese af prostatacancer. Disse resultater kan give en potentiel terapeutisk tilgang til prostatakræft.

Støtte Information

figur S1. Autentificering af celler transficeret med MIR-221 eller MIR-222-inhibitor ved Western blot. 1-8: nummererede kloner. Succesfulde kloner angivet med pile blev samlet sammen for at kontrollere de biologiske eksperimenter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0098833.s001

(TIF)

Figur S2. Ekspression af SIRT1 mRNA. Real time PCR blev udført for at måle SIRT1 mRNA ændringer i PC-3-celler transficeret med PEX-5, MIR-221 inhibitor eller MIR-222-inhibitor. Der var ingen statistisk forskel mellem grupper

doi:. 10,1371 /journal.pone.0098833.s002

(TIF)