PLoS ONE: Avanceret Intestinale Kræft ofte Oprethold en Multi-Ancestral Architecture

Abstrakt

En bredt accepteret paradigme inden for kræft biologi er, at solide tumorer er uni-forfædres er afledt af et enkelt grundlægger og dens efterkommere . Imidlertid har data været støt tilfalder der indikerer tidlige tumorer i mus og mennesker kan have en multi-forfædres oprindelse, hvor en indledt primogenitor letter omdannelsen af ​​nabolandet co-genitors. Vi har udviklet en ny musemodel, der tillader bestemmelse af klonal arkitektur af intestinale tumorer

in vivo

ex vivo

, har valideret denne model, og derefter bruges det til at vurdere klonale arkitektur adenomer , intramucosal carcinomer og invasive adenocarcinomer i tarmen. Andelen af ​​multi-forfædres tumorer ikke signifikant ændre sig som tumorer skred fra adenomer med lav-grade dysplasi [40/65 (62%)], at adenomer med high-grade dysplasi [21/37 (57%)], at intramucosal karcinomer [10/23 (43%]), til invasive adenocarcinomer [13/19 (68%)], hvilket indikerer, at klonen følge af primogenitor fortsætter med at sameksistere med kloner, der følger af co-genitors. Desuden har endog været observeret neoplastiske celler fra forskellige kloner inden for en multi-nedarvet adenocarcinom til samtidigt invadere ind i den underliggende muskulatur [2/15 (13%)]. Således intratumoral heterogenitet opstår tidligt i tumordannelse fortsætter hele tumorigenese

Henvisning:. Zahm CD, Szulczewski JM, Leystra AA, Paul Olson TJ, Clipson L, Albrecht DM, et al. (2016) Avanceret Intestinale Kræft ofte Oprethold en Multi-Ancestral Architecture. PLoS ONE 11 (2): e0150170. doi: 10,1371 /journal.pone.0150170

Redaktør: Kwong-Kwok Wong, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, UNITED STATES

Modtaget: Oktober 6, 2015; Accepteret: 10. februar, 2016 Publiceret: 26 feb 2016

Copyright: © 2016 Zahm et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/) af National Institutes of Health (R01 CA123438 til RBH, P30 CA014520 til University of Wisconsin Carbone Cancer center, P30 DK058404, Prækliniske modeller af Digestive Diseases Core, Vanderbilt Digestive Diseases Research center, P50 CA095013, Translationel Patologi og Imaging Core, Vanderbilt GI SPOREs, K08 CA84146 til ATT, T32 CA009135 til CDZ og AAL, og T32 CA090217 til TJPO) og nystartede midler fra University of Wisconsin-Madison Division of Gastroenterology og Hepatology, Institut for Medicin og School of Medicine og folkesundhed til RBH

Konkurrerende interesser.: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

heterogenitet af tumorer er blevet anerkendt i årtier. Neoplastiske celler i en enkelt tumor varierer i adskillige skelnelige egenskaber, herunder differentiering tilstand, proliferationshastighed, metastatisk potentiale, og terapeutisk respons. Historisk set blev to modeller til at forklare intratumoral heterogenitet foreslået. Den klonale evolution model hævder, at forskellige subkloner udspringer fra en enkelt progenitor som følge af molekylære ændringer efterfulgt af selektion for uens mikromiljøer inden for en tumor [1]. I modsætning hertil cancer stamceller model anført, at en lille population af stamceller der stammer fra en enkelt stamfader er ansvarlig for tumor vedligeholdelse, men afkommet kan differentiere i adskillige forskellige måder [1]. I begge modeller, to centrale antagelser er, at tumorer er uni-forfædres, stammer fra en enkelt grundlægger, og at en subklon i sidste ende vil akkumulere mutationer, der drev metastaser til andre organer.

Data er støt tilfalder for en tredje model af intratumoral heterogenitet: faste tumorer kan have en multi-nedarvet arkitektur [2]. Vi har vist, at arvelige og carcinogent-induceret intestinale tumorer i laboratoriet mus kan stamme fra flere grundlæggere [3, 4]. Vores resultater er i overensstemmelse med de andet laboratorium viser, at arvelige og sporadiske kolorektale tumorer hos mennesker kan være multi-fædrene i arkitektur [5, 6]. I modsætning til en bredt accepteret paradigme inden for kræft biologi, kan solide tumorer har en multi-forfædres oprindelse og dermed være heterogen, selvom de bare begynder at danne.

De indledende undersøgelser med dyremodeller primært påberåbt på aggregeringskimærer. Sådanne mus blev dannet ved at sammensmelte tidlige embryoner. Typisk ét embryon bar Rosa26 afstamning markør, der udtrykker p-galactosidase således at celler fra denne embryo farves blå i nærvær af 5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid, hvorimod celler fra den anden embryo forblive hvid. Tumorer, der er heterotypisk, der består af blå og hvide neoplastiske celler, har en multi-forfædres oprindelse. Brugen af ​​aggregeringskimærer har givet nye indsigt i de tidlige stadier af tumorigenese. Desværre er dette kraftfulde eksperimentelle værktøj har nogle væsentlige begrænsninger. Dannelsen af ​​aggregeringskimærer er meget tidskrævende og dyrt, så antallet af dyr analyseret ofte er lav. Den klonale arkitektur enhver tumoren kan kun bestemmes efter en langvarig farvningsprocedure, der omfatter to fiksering trin og inkubation natten over ved 37 ° C. Farvningen er ofte ufuldstændige, eftersom underlaget skal diffundere ind i tumoren; derfor ikke alle tumorer kan scores. Desuden er de barske vilkår forbyde enhver efterfølgende molekylær analyse.

I denne undersøgelse har vi udviklet en ny mus model, der gør det muligt at klonal arkitektur af intestinale tumorer skal bestemmes

in vivo

ex vivo

, valideret denne model, og derefter bruges det til at bestemme den klonale arkitektur tarm kræft. Resultaterne understøtter konceptet, at adenomer har en multi-fædrene oprindelse, og at dette tidlige mangfoldighed fortsætter som tumorer overgang fra en godartet til malign tilstand.

Metoder

Mus stammer og generering af mosaik mus

Dyreforsøg blev gennemført under protokoller godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Wisconsin i overensstemmelse med politikker, der er af Office of Laboratory Animal Welfare ved National Institutes of Health. C57BL /6J (B6), FVB /NJ (FVB), ​​B6.Apc

Min /J-mus, der var heterozygote for

Min

allel af

adenomatøs polypose coli-gen

(

Apc

Min /+), og B6.129 (CG) -GT (ROSA) 26Sor

TM4 (ACTB-tdTomato, -EGFP) Luo /J-mus, der var hemizygote for mT /mg reporter blev opnået fra The Jackson Laboratory. FVB /N-Tg

(Fabp1-Cre) 1Jig mus hemizygote for Fabp1-Cre transgen, hvori promotoren fra rat fedtsyrebindende protein er fusioneret til det gen, der koder for Cre-rekombinase, resulterer i mosaik ekspression af Cre før færdiggørelsen af ​​tarm morfogenese, blev opnået fra National Cancer Institute Mouse Repository på Frederik. Lagre af disse stammer blev opretholdt ved søskende kors og tilbagekrydsning med B6 eller FVB mus, der blev importeret hver femte generation. Afkom blev genotypet hjælp DNA isoleret fra tå klip til PCR som beskrevet af leverandørerne af dyrene.

En mus bærer

Min

allel af

Apc

blev identificeret i laboratoriet Dr. William F. Dove ved University of Wisconsin efter mutagenese med ethylnitrosourinstof [7, 8]. Grundlæggeren og dens afkom præsenteret med blege fødder på grund af blodtab fra tumorer i tarmen [7]. Tumor mangfoldighed, vækst og progression i

Apc

Min /+ mus er afhængig af genetiske baggrund. B6

Apc

Min /+ mus udvikler i gennemsnit 100 tarm tumorer og typisk dø ved 150 dage gamle [7]. Tumorer er indledt efter tabet af APC-aktivitet i intestinale epitelceller hurtigt efter fødslen, og de er næsten altid godartede adenomer [9-13]. Derimod (SWRxB6) F1

Apc

Min /+ hybrider udvikle nogle tumorer og typisk lever et år eller mere [14]. Tumorerne i disse mus er ofte invasive cancere, der lejlighedsvis metastaserer til regionale lymfeknuder, formentlig på grund af den længere levetid [14].

Eksperimentelle mus blev dannet ved første passage B6

mT /mG

hunner til B6

Apc

Min /+ mænd til at generere B6

Apc

Min /+;

mT /Mg

mus, blev derefter krydsede til FVB

Fabp1-Cre

mus til at generere (FVBxB6) F1

Apc

Min /+;

Fabp1-Cre

;

mT /Mg

hybrider. Eksperimentelle F1 hybrider fik lov at ældes til 150 dage eller indtil moribunde at vurdere den klonale arkitektur af tumorer på forskellige stadier.

Fluorescens endoskopi

Fluorescens endoskopi blev udført under anvendelse af en modificeret Karl Storz Coloview systemet som beskrevet tidligere [15, 16]. Kort beskrevet blev mus bedøvet med isofluran og givet et lavement af varm PBS for at fjerne enhver fækale materiale. Endoskopet blev indsat cirka fire centimeter og derefter langsomt trukket tilbage under anvendelse af et Optotronics diode-pumpet solid-state laser indstillet til 437nm ved en effekt på 100 mW som lyskilde. Video blev indsamlet under hele proceduren og stillbilleder blev taget til fange af hver tumor. Mus fik lov til at vågne op efter indgrebet.

Videoer og stillbilleder blev behandlet med Fiji pakke af ImageJ at visualisere normale og dysplastiske krypter udtrykker grønt fluorescerende protein.

Imaging af hele mounts

tarmkanalerne blev fjernet intakt ved obduktion, åbnet på langs, skyllet med PBS, fikseret i 4% paraformaldehyd i 4 timer og opbevaret ved 4 ° C i 70% ethanol. Tyndtarmen, coecum, colon og blev monteret i 0,4% agarose i PBS og afbildes at indfange røde fluorescens (mT tdTomato) og grøn fluorescens (mg; EGFP) under anvendelse af enten et Zeiss mikroskop ved 12,5X og eller Nikon mikroskop ved 20x forstørrelse (se S1 fil for yderligere detaljer).

Hele-mount billeder, der anvendes til statistisk analyse blev opnået på Zeiss mikroskop og behandles ved hjælp af Fiji billedbehandling pakke af ImageJ [17]. En makro blev brugt til at sikre sammenhæng mellem billeder. Kort fortalt makroen søgte en mappe til Zeiss billedfiler (Zvi) og konverterede dem til Open Mikroskopi Miljøs (OME) tiff (TIFF) ved hjælp af LOCI Bio-formater Importør /eksportør at bevare metadata [18]. Det afsluttede derefter følgende sæt af funktioner med indstillinger baseret på hvilken protein blev afbildet (tdTomato eller EGFP): trækkes baggrund, øget lokal kontrast (CLAHE), sæt autothreshold, og konverteret til binær. En gang i binær, blev de områder af billedet, der ikke indeholder væv fyldt med gult. Resultatet var et binært billede, hvor hvid repræsenterer væv udtrykker tdTomato og sort repræsenterer væv udtrykker EGFP (S1 Fig).

Patch størrelse analyse

For at vurdere forholdet mellem mosaicisme og klonal arkitektur, rød og grønne pletter af tarmepitelet i eksperimentelle mus blev analyseret under anvendelse distance kort, som tidligere beskrevet for aggregeringskimærer [3, 4]. Kort fortalt blev flade binære billeder af hver tarm sektion konverteret til distancere kort billeder, som viser, for hver position den euklidiske afstand til nærmeste modsatte farve, ved hjælp af EBImage softwarepakken [19]. Den gennemsnitlige minimale afstand til den modsatte farve foranstaltninger mosaik patch størrelse, som blev sammenlignet med patch størrelser fra aggregeringskimærer (S2 Fig).

3D rekonstruktion af tumorer

Nogle adenomer fra mus aflivet på 150 dage gamle, blev udskåret og optisk blokerede anvendelse af 2,2-thiodiethanol (TDE) som tidligere beskrevet [20]. Ryddet adenomer blev monteret

en bloc

i 97% TDE og multifotonexcitation imaging blev udført på en Prairie Technologies Ultima IV Imaging system på loci.

Billede stakke fra Ultima IV blev syet sammen ved hjælp af standardindstillinger i Grid /Collection Stitching plug-in til ImageJ, der distribueres som en del af Fiji-projektet [21]. Baggrund subtraktion blev udført på begge kanaler ved hjælp af ImageJ subtrahere baggrund funktion med en rullende kugle radius på 40 pixels. Når kun viser EGFP blev en tærskelværdi, der anvendes til at fjerne væv autofluorescens. Tærsklen blev anvendt ligeligt på alle områder af alle billeder, der blev anvendt i forbindelse med genopbygningen. Billeder blev derefter åbnes ved hjælp af ImageJ 3D-fremviseren plug-in (Vis som: Volumen, Farve: Ingen; Threshold: 0, Resampling faktor: 1) til at generere høj kvalitet 3D-gengivelser af OME datasæt

Immunhistokemi

Alle udskårne tumorer blev enten indlejret i FSC 22 (Surgipath) og flash fryses eller anbringes i formalin, behandlet og indlejret i paraffin. Blokke blev serielt sektioneret og klædt som to 5 um sektioner pr dias. Hver tiende slide blev farvet med hæmatoxylin og eosin. For mere fuldstændig analyse blev objektglassene af interesse farves ved immunhistokemi for CTNNB1 (1: 200 Oprenset muse-anti-β-catenin antistof, BD Transduction Laboratories) under anvendelse af HistoMouse Max Kit (Invitrogen) eller ved immunofluorescens for grønt fluorescerende protein (EGFP) eller rødt fluorescerende protein (tdTomato) (primær- 1: 1000 Living Colors EGFP monoklonalt antistof, Clontech, og secondary- 1: 1000 gede-anti-muse Alexa Fluor 488, Invitrogen, og /eller primær- 1: 200 anti-tdTomato, Rockland og secondary- 1: 1000 gede-anti-kanin-Alexa Fluor 568, Invitrogen) og 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) ved at anvende forlænge guld med DAPI montering medier (Molecular Probes). Bemærk at farvning for EGFP og tdTomato var nødvendig, fordi fiksering slukker det fluorescerende signal

Immunofluorescens

Histologiske snit farvet ved immunofluorescens blev afbildet som beskrevet i hel-mount billeddannelse sektion.; Den eneste ændring var brugen af ​​4x, 5x, 10x eller 20x objektivlinser. Efterbehandling af billeddannelse ikke var nødvendig. Histologiske snit farvet ved immunohistokemi eller hematoxylin og eosin (H S1 Table) af muse

Apc

gen, da forekommer de fleste mutationer i disse to regioner [8, 22]. PCR blev udført i 35 cykler. Hver cyklus bestod af 30 sekunder ved 94 ° C, 30 sekunder ved 55 ° C, og 1 minut ved 72 ° C. Alle amplifikationsprocedurer inkluderet DNA-free kontroller med amplifikation cocktail og nuklease-frit vand (Promega) i stedet for template-DNA. PCR-primere blev derefter anvendt til sekventering. Mutation opdagelse og analyse blev udført ved hjælp af mSeq 6.0.1 (Norman Drinkwater, McArdle Laboratorium for Cancer Research, Onkologisk Afdeling, School of Medicine og folkesundhed, University of Wisconsin-Madison) og Mutation Surveyor (Softgenetics) programmer.

Resultater

for at undersøge klonale arkitektur af intestinale tumorer, genereret vi mus, der bærer tre genetiske elementer. De to første var transgener, der er nødvendige for at etablere et mønster af mosaicisme i tarmen. Et transgen består af rotte fedtsyrebindende protein 1 promotoren fusioneret til genet kodende Cre-rekombinase og den anden har den

mT /Mg

reporter. I celler, som undlod at udtrykke Cre, blev rødt fluorescerende protein (tdTomato) udelukkende er fremstillet af journalisten selv under tarm tumorigenese; i celler, der udtrykker Cre begyndende på dag E13.5 (forud for afslutningen af ​​intestinal morfogenese og før min tumordannelse), grønt fluorescerende protein (EGFP) blev fremstillet udelukkende som det gen, der koder for tdTomato blev slettet efter rekombination. Således er disse to elementer skabt en broget mønster af celler, der udtrykker rød eller grøn fluorescerende proteiner i den distale tyndtarm, coecum og colon (S3 Fig). Dette mønster var stabil på alle tidspunkter vurderet (S5 Fig). Det tredje element var en enkelt kopi af

Min

allel af

adenomatøs polypose coli

(

Apc

) genet [8]. Denne mutation prædisponeret musene til den spontane udvikling af tumorer i hele tyndtarmen og colon. Da reporter status er fastlagt forud for tumorer formgivning og Cre udtryk er stabil under tumorigenese, tumorer, der består af en blanding af røde og grønne neoplastiske celler har en multi-fædrene arkitektur.

For at karakterisere tarm tumorigenese i denne model, en kohorte af 20 mus blev genereret og aflivet ved 150 dage gamle. Forekomsten af ​​intestinale tumorer var 100% med et gennemsnit mangfoldighed af 11 ± 5. En lav tumorbyrde blev forventet på grund af den homogene F1 genetisk baggrund og var ønskelig, da det begrænsede muligheden for to uafhængigt indledt tumorer vokse sammen som følge af nærhed [23]. Alle tumorer fra denne gruppe mus, der blev analyseret var adenomer med lav kvalitet dysplasi.

Mange af adenomer i disse mus havde en multi-nedarvet arkitektur. Sammensætningen af ​​kolon tumorer var tydelig

in vivo

ved fluorescens endoskopi (Fig 1A) og

ex vivo

med fluorescerende mikroskopi (Fig 1B). Af de 63 tumorer i den distale tyndtarm og tyktarm blev 32 (51%) bekræftede at være sammensat af røde og grønne neoplastiske celler ved histologi (tabel 1 og fig 1C-1F). Funktioner af transformation fra normal slimhinde til neoplasi /dysplasi var tab af krypt arkitektur, udtynding af overfladen mucin, og øget mitose samt tilhørende nukleare ændringer, herunder fortrængning, lagdeling, forlængelse og hyperchromasia. Desuden er de dysplastiske røde og grønne celler havde et forhøjet niveau af CTNNB1 (β-catenin) og ofte dette protein blev lokaliseret til kernen bekræfter, at cellerne i begge linjer var neoplastiske (Fig 1C-1F). Endelig røde og grønne neoplastiske kloner gennemføres ofte unikke mutationer i

Apc

(tabel 2 og S4 Fig), hvilket yderligere indikerer, at disse kloner er afledt af forskellige stifterne. Således er denne innovative musemodel er ganske velegnet til at studere den klonale arkitektur af intestinale tumorer. Desuden er en vigtig fordel ved denne model er, at visualisering af forskellige afstamninger ikke hæmmer molekylære analyser herunder immunhistokemi og DNA-sekventering.

klonale arkitektur colontumorer er synlig

in vivo

anvendelse af fluorescens endoskopi. Tarmepitelet er et enkelt lag af celler, der udskiftes hver tre til fem dage. Nye celler produceres fra stamceller liggende nær bunden af ​​hver krypt. I vores model, krypter er homotypisk rød eller homotypisk grøn med sidstnævnte er særlig tydeligt under fluorescens endoskopi, som hver krypt vises som en diskret grøn cirkel (A). Tumorer kan være sammensat af kun røde krypter (venstre panel), en blanding af røde og grønne krypter (midterste panel), eller kun grønne krypter (højre panel). Tumorerne skitseret i hvidt. Den høje variabilitet i klonal arkitektur er også tydeligt i hele underlag (B). Tumorer var homotypisk rød (venstre panel), heterotypisk (midterste tre paneler), eller homotypisk grøn (højre panel). Blandingen af ​​røde og grønne krypter varierer blandt multi-ancestral tumorer, hvor nogle skal primært sammensat af enten røde eller grønne krypter krypter, mens andre er omtrent lige mange af begge typer. Histologi er nødvendigt at fastlægge arkitekturen, som tumorer kan forekomme heterotypisk med neoplastiske krypter af en farve blandet med normale krypter af den anden farve. Den klonale arkitektur af tumorer er scoret på histologiske snit. Neoplastiske celler blev visualiseret efter H størrelse bar = 1 mm. Paneler C og E er vist med samme forstørrelse; størrelse bar = 500 um. Panel D viser en 4x forstørrelse i et tilstødende afsnit af det skitserede område i panel C. Panel F viser en 4x forstørrelse af det område, der er skitseret i Panel E. Vejviser

Den procentdel af multi-ancestral tumorer i mosaikker var sammenlignelig med andelen observeret i tidligere undersøgelser med aggregeringskimærer (S2 fig; 40-52% i mosaikker versus 22-47% i aggregeringskimærer). Dette fund sandsynligvis afspejler, at de mange og uensartede røde og grønne celler i den distale tyndtarm og tyktarmen af ​​vores mosaik mus var sammenlignelig med de mange og uensartede blå og hvide celler observeret i aggregeringskimærer i tidligere studier (S2 Fig). Alle 165 tumorer i den proximale tyndtarm var homotypisk rød (tabel 1), rotte-fedtsyrebindende protein 1 promotor næppe udtrykkes i denne region af tarmkanalen (S3 Fig). Denne observation indikerer, at ekspression af fluorescerende proteiner fra reporteren er stabil under tumorigenese. Fordi tumorigenese ikke fører til aktivering af Cre eller mutationer i reporter, kan heterotypiske tumorer præcist være fast besluttet på at have en multi-forfædres oprindelse. Denne fremgangsmåde kan generelt anvendes til at studere den klonale arkitektur af tumorer i andre væv, som kun kræver anvendelse af en anden transgen udtrykker Cre-rekombinase.

Den multi-nedarvede arkitektur af tumorer blev yderligere bekræftet via billeddannelse. I alt fem multi-nedarvede adenomer blev isoleret, suspenderet i TDE som monteringsmedium at reducere spredning fra lipider, og afbildes med en multifoton mikroskop. For hver adenom, blev de opsamlede billeder, syet sammen for at generere en tredimensionel rekonstruktion. Disse data indikerer, at nogle tumorer kan være mere kompliceret end blot biclonal; antallet af diskrete farvede regioner varierede fra to til fire (S2 tabel). I en overvejende rødt adenom, kunne tre separate grønne områder ses, hvilket indikerer, at denne svulst kan udledes fire stiftere, hvis hver klon opstod fra en unik initierende begivenhed (figur 2). Men forberedelsen til billedbehandling forhindret os i at være i stand til at udføre de sekventering undersøgelser, som ville tillade os at afgøre, om de separate grønne pletter havde forskellige mutation profiler, som vil give yderligere bevis på deres oprindelse.

udtryk for fluorescerende proteiner letter brugen af ​​multifotonexcitation imaging at rekonstruere tumoren i tre dimensioner rekonstruktioner tillade udforskning af strukturen under overfladen af ​​tumorerne (A, overflade, B, set fra siden) uden forvridninger og artefakter, der opstår, når billeddannelse flere histologiske snit. Fire forskellige farvede områder var tydelig i en tumor. Tre diskrete grønne områder var tydeligt, når den røde blev subtraheret (C). Disse områder af grønt blev adskilt med mindst 100 mikron, hvilket svarer til diameteren på 1 til 2 krypter.

Den multi-nedarvede arkitektur fortsætter som tumorer udvikles fra godartede til ondartede tilstande. En anden gruppe mus blev genereret og henstod til ældning indtil døende. Den gennemsnitlige alder ved død var 494 ± 93 dage. Forekomsten af ​​intestinale tumorer var 100% med et gennemsnit mangfoldighed af 15 ± 5, hvilket var lidt højere end den observeret i mus aflivet ved 150 dage gamle (p = 0,04; Wilcoxon Rank Sum, dobbeltsidet). I de døende mus, 16% af tumorerne i den distale tyndtarm og tyktarm var intramucosal carcinomer og 13% var invasive adenocarcinomer (tabel 3). Svarende til den observeret i humane colorektale læsioner, intramucosal carcinomer udviser neoplastisk celle invasion ind i enten lamina propria eller muscularis mucosa og kan være forbundet med en desmoplastiske respons (figur 3). Bemærk, at en tidligere undersøgelse viste at langlivede Min-mus udvikler fremskreden sygdom, selvom tumorerne udviste lidt genetisk ustabilitet [14]. For en læsion, der skal betragtes som en invasiv adenokarcinom der skulle være invasion af neoplastiske celler uden muscularis mucosa mindst til den submucosa. De neoplastiske celler var ofte søjleformet i udseende med prominente nucleoli, havde en cribriform arkitektur med back-to-back kirtler uden mellemliggende stroma, granulær eosinofil karyorrhectic debris stede i lumenet af kirtlen, øget mitotisk aktivitet og forbundet med et desmoplastiske respons. En multi-fædrene arkitektur blev observeret i 62% af adenomer med lav kvalitet dysplasi, 57% af adenomer med high-grade dysplasi, 43% af intramucosal carcinomer, og 68% af invasive adenokarcinomer (tabel 3).

I mus, der fik lov til alder indtil døende, nogle svulster var adenomer med high-grade dysplasi (A og B), mens andre var intramucosal karcinomer (CF). De neoplastiske celler identificeret på H størrelse bar = 1 mm. Paneler C og E er samme forstørrelse; størrelse bar = 1 mm. Paneler D og F er 4x udvidelser af området skitseret i C.

Maligne celler invaderer submucosa og muscularis propria kan endda være afledt af forskellige grundlæggere. blev analyseret i alt 15 invasive adenokarcinomer fra 10 mus. Samtidig invasion af røde og grønne neoplastiske celler blev observeret i 13%. Denne observation viser, at samspil mellem kloner kan fortsætter selv som tumorer begynder at invadere fra submucosa i muscularis propria.

Diskussion

Vi genererede en ny musemodel af kolorektal cancer, udført valideringsundersøgelser til sammenligne vores resultater med tidligere eksperimentelle modeller, og anvendes derefter modellen til at studere den klonale arkitektur af maligne cancere i tarmen. Resultaterne ikke kun angiver, at cancere er sammensat af celler afledt fra flere grundlæggere men at celler fra forskellige oprindelser samtidigt kan invadere ind i colon væg muskulatur. Denne opdagelse er i strid med den opfattelse, at alle faste tumorer er uni-forfædres og at en enkelt sub-klon til sidst får en selektiv fordel gennem epigenetiske ændringer eller mutationer og dermed metastaserer fra den primære tumor til fjerne steder.

Vores model var valideret ved hjælp af flere forskellige fremgangsmåder. Den Fabp1-Cre transgen blev valgt, fordi det er stabilt udtrykt i den distale tyndtarm, coecum, colon og under embryogenese [24, 25], og før tumorigenese sker i Min-mus. I overensstemmelse med denne påstand, krypterne inden for normalområdet tarmen var enten helt rød i fravær af Cre-ekspression eller helt grøn i nærvær af Cre-ekspression. Endvidere mønstret for mosaicisme ligner i mus aflivet ved 150 dage gamle og de dræbte når døende, hvilket indikerer, at det mønster etableret tidligt under embryogenese er stabilt i voksne mus (S5 Fig, S6 Fig, og S3 Table). Hvis Cre spontant blev aktiveret i forskellige celler, ville tarmen gradvist vende mere grøn som mus alder, fordi grønne celler ikke kan konverteres tilbage til rød. I begge grupper mus, den proximale halvdel af tarmkanalen var næsten helt rød, mens den distale halvdel var en blanding af rød og grøn med colon er sammensat af 37,6% grønne celler i mus aflivet på 150 dage og 38,1% grønne celler i mus aflivet, når døende (p = 0,46, t-test). Alle 165 tumorer, der er dannet i den proximale halvdel af tyndtarmen og 24 af 63 tumorer i tyktarmen og den distale halvdel af tyndtarmen var homotypisk rød (tabel 1). Denne observation indikerer, at Fabp1-Cre transgen ikke aberrerende aktiveret som følge af neoplastisk transformation. Andre tumorer i den distale halvdel af tarmkanalen var homotypisk grøn eller heterotypisk. Procentdelen af ​​heterotypiske eller åbenlyst multi-forfædres, tumorer svarede til observeret i tidligere undersøgelser, hvor aggregeringskimærer var ansat (S2 Fig). Mønstret af røde og grønne neoplastiske kloner inden for en enkelt tumor varierer dramatisk med rødt og grønt bliver stærkt sammenblandet i nogle tumorer (Fig 1B). Sådanne komplekse blandinger ville være vanskeligt at forklare ved ubestemt ekspression af Fabp1-Cre transgen i en enkelt klon.