PLoS ONE: Epigenetisk hierarki inden for MAGEA1 Cancer-Kimcellelinje Gene: Promotor DNA-methylering dikterer Lokale Histon Ændringer

Abstrakt

Gene

MAGEA1

tilhører en gruppe af human kimlinje-specifikke gener, der er afhængige af DNA methylering for undertrykkelse i somatiske væv. Mange af disse gener, betegnet cancer-kimlinie (CG) gener, bliver demethyleres og aktiveres i en lang række tumorer, hvor de koder for tumorspecifikke antigener. Den proces, der fører til DNA demethylering af CG-gener i tumorer er fortsat uklart. Tidligere data antydet, at histonacetylering kan være involveret. Her undersøgte vi det relative bidrag af DNA methylering og histonacetylering i epigenetiske regulering af gen

MAGEA1

. Vi viser, at

MAGEA1

DNA hypometylering udtrykke melanom celler faktisk korreleret med lokale stigninger i histon H3 acetylering (H3ac). Men når

MAGEA1

-negative celler blev udsat for en histondeacetylaseinhibitor (TSA), observerede vi kun kortvarig aktivering af genet og detekteret nogen demethylering af dets promotor. Som en mere følsom analyse, anvendte vi en celleklon, der huser et methyleret

MAGEA1 /HPH

konstruere, som giver resistens over for hygromycin på stabil genaktivering. TSA inducerede kun forbigående de-undertrykkelse af transgenet, og førte ikke til fremkomsten af ​​hygromycinresistente celler. I slående kontrast, forbigående udtynding af DNA-methyltransferase-1 i reporter celle-klon gav anledning til en hygromycin-resistent population, hvor re-aktiverede

MAGEA1 /HPH

transgen de viste ikke kun markeret DNA hypometylering, men også betydelig tilbageførsel af histon mærker, herunder gevinster i H3ac og H3K4me2, og tab af H3K9me2. Kollektivt, vores resultater viser, at DNA-methylering har en dominerende rolle i den epigenetiske hierarki regulerer

MAGEA1

udtryk

Henvisning:. Cannuyer J, Loriot A, Parvizi GK, De Smet C (2013) Epigenetisk Hierarkiet i

MAGEA1

Kræft-Kimcellelinje Gene: Promotor DNA Methylering dikterer Local histon Ændringer. PLoS ONE 8 (3): e58743. doi: 10,1371 /journal.pone.0058743

Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina

Modtaget: November 30, 2012; Accepteret: 5 feb 2013; Udgivet: 5 mar 2013

Copyright: © 2013 Cannuyer et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. JC er modtageren af ​​en FSR-FNRS-Télévie tilskud (https://www2.frs-fnrs.be/). GKP modtog et stipendium fra FSR-FNRS-Fria (https://www2.frs-fnrs.be/). Dette arbejde blev støttet af en FRSM bevilling fra FSR-FNRS (ref. 3.4563.11, https://www2.frs-fnrs.be/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

DNA-methylering, der forekommer hovedsagelig på CpG-dinukleotider, er en potent mekanisme genrepression i pattedyrceller [1]. Vævsspecifikke mønstre af CpG methylering, der er etableret under embryo udvikling, er generelt godt bevaret i voksne celler, men bliver dybt ændret i cancerceller [2]. Begge gevinster (hypermethyleringsassocierede) og tab (hypometylering) af DNA methylering kan påvises i den samme tumor celle. Afvigende hypermethylering i kræft ofte påvirker promotor af tumor-suppressor gener, og er derfor blevet forbundet med tab af tumor undertrykkende funktioner [3]. DNA hypometylering, på den anden side, er blevet detekteret på en række forskellige sekvenser i cancer genomer, herunder repetitive sekvenser [4], og blev vist at bidrage til at fremme af genomisk ustabilitet [5]. Overraskende har DNA hypometylering i tumorer blevet forbundet med transkriptionel aktivering af kun et begrænset antal gener, hvoraf de fleste har deres normale sted for ekspression begrænset til kønscellerne [6]. Denne særlige gruppe af gener blev betegnet cancer-kimcellelinje (CG) gener [7]. I humant, CG-gener omfatter omkring 50 gener eller genfamilier bevirke et række cellulære [8] funktioner. Aktivering af disse gener er blevet rapporteret i en lang række tumortyper, herunder lungecancer, hoved- og halscancer, blærecancer, og melanom. En vigtig konsekvens af aktiveringen af ​​CG-gener i tumorer er produktion af tumorspecifikke antigener, som kan genkendes af cytolytiske T-lymfocytter [9]. Kliniske forsøg med anti-cancer vaccination rettet mod sådanne antigener er undervejs [10]. Tænkes, at forstå de mekanismer, der bidrager til CG genregulering kan lette udviklingen af ​​gen-induktion strategier, som ville gøre tumorceller mere sårbare over for immunterapi.

proces, der fører til DNA hypometylering og efterfølgende aktivering af CG gener i tumorer stadig uklar [11]. En mulighed er, at DNA demethylering på CG-gener er en konsekvens af ændringer i niveauet histon proteiner, de centrale komponenter i kromatin. Specifikke rester i histon haler gennemgå en række kemiske modifikationer, herunder acetylering og methylering, som har indflydelse på kromatin struktur og transskription [12]. Adskillige histon modifikationer synes også at regulere DNA methylering [13]. Undertrykkende histon mærker, såsom methylering af histon H3 lysin 9 eller 27 (H3K9 eller H3K27), viste sig at diktere aflejring af DNA methylering ved specifikke loci, ved at begunstige den lokale rekruttering af DNA methyltransferaser [14], [15]. På den anden side, aktiverende histon modifikationer, såsom histonacetylering eller methylering af histon H3 lysin 4 (H3K4) synes at udelukke DNA methylering maskiner [16], [17]. Derfor blev det fristende at foreslå, at DNA demethylering på CG-gener kan være en konsekvens af ændringer i niveauet histon modifikationer.

Tidligere undersøgelser viste, at CG genpromotorer ofte er forbundet med H3K9 og H3K27 methylering i ikke- udtrykkende celler. Disse undertrykkende modifikationer er generelt tabt ved aktivering af CG gener i tumorceller, og erstattet af aktive histon mærker, såsom histonacetylering og H3K4 methylering [18], [19]. Et afgørende spørgsmål er, om ændringer på niveauet af histon ændringer er en årsag eller en konsekvens af CG gen promoter DNA demethylering i tumorceller. Undersøgelser med hæmmere af H3K9 og H3K27 methyltransferaser viste, at disse var på deres egne i stand til at inducere signifikant DNA demethylering og aktivering af CG gener [18], [19]. Lignende resultater blev opnået følgende hæmning af H3K4 demethylases [19]. I modsætning hertil rapporterede flere undersøgelser, at CG-genekspression kunne induceres i celler behandlet med en inhibitor af histondeacetylaser [20] – [22]. I én rapport [20], men ikke i de andre, var det vist at inducere DNA demethylering af en CG genpromotor behandling. Disse observationer rejst derfor den mulighed, at vinder i histonacetylering kan være en tilstrækkelig trigger til at inducere DNA demethylering og aktivering af CG gener i tumorceller.

I den foreliggende undersøgelse vurderede vi potentiale histonacetylering at inducere DNA demethylering og aktivering af gen

MAGEA1

, en velkarakteriseret medlem af CG gruppe af gener. Dette blev vurderet ved at teste virkningen af ​​Trichostatin A (TSA), en histondeacetylaseinhibitor, i ikke-udtrykkende melanomceller og i en celleklon, der huser en methyleret

MAGEA1 /HPH

-konstruktionen, der muliggør selektion (hygromycinresistens ) af celler, hvor aktivering af transgenet opstod. Desuden blev dette følsomme reporter celle, der anvendes i en omvendt eksperiment, hvor vi evaluerede evnen af ​​en inhibitor af DNA-methylering at fremkalde ændringer af histon varemærker i den

MAGEA1

promotor.

Resultater

histon ændringer i forbindelse med

MAGEA1

aktivering i melanom cellelinjer

for at identificere histon modifikation ændringer i forbindelse med

MAGEA1

aktivering, vi gennemførte kromatin immunopræcipitationsanalyser (chip) -forsøg i ikke-udtrykkende og udtrykkende cellelinier. Eksperimenter blev udført på immortaliseret human forhudsfibroblaster (HFF2-hTERT) og to melanomcellelinier, som ikke udtrykker

MAGEA1

(SK-MEL-23 og EB16-MEL), samt på tre melanoma cellelinier, do udtrykker

MAGEA1

(MZ2-MEL3.1, BB74-MEL og Mi13443-MEL). Som forventet, evaluering af

MAGEA1

promotor-DNA methylering niveauer ved kvantitativ MS-PCR i disse cellelinier, viste høje methylering niveauer i ikke-udtrykkende celler, og lav-methylering i udtrykkende celler (fig. 1A). CHIP eksperimenter, undersøge

MAGEA1

5′-region, afslørede fortrinsret berigelse af dimethylerede H3K9 (H3K9me2) i

MAGEA1

ekskluderet versus

MAGEA1

-positive cellelinjer (Fig . 1B). I slående kontrast, acetylering af histon H3 (H3ac) og dimethylering af H3K4 (H3K4me2) inden for

MAGEA1

5′-regionen viste en markant stigning i de tre udtrykkende cellelinjer, sammenlignet med de ikke-udtrykkende celler (fig. 1B). Betydelig berigelse af trimethyleret H3K27 (H3K27me3) inden for

MAGEA1

5′-region blev observeret i HFF2-hTERT-celler, men ikke i nogen af ​​de andre cellelinjer. Sammen vores resultater antydede, at DNA demethylering og aktivering af

MAGEA1

i melanomceller er forbundet med tab af H3K9me2, og gevinster på H3ac og H3K4me2 i 5′-regionen af ​​genet. Dette var i overensstemmelse med en potentiel rolle histonacetylering i epigenetiske aktivering af

MAGEA1

i tumorceller.

En

,

MAGEA1

mRNA-ekspressionsniveauer (øvre panel) og 5′-region DNA methylering niveauer (nedre panel) blev evalueret i tre ikke-udtrykkende cellelinier (HFF2-hTERT, SK-MEL-23 og EB16-MEL) samt i tre udtrykkende cellelinier (MZ2 -MEL3.1, BB74-MEL og Mi13443-MEL). Værdier repræsenterer middel (± sem) af to uafhængige QRT-PCR eller QMS-PCR-forsøg, hver i to eksemplarer.

B

, chip-kvantitativ PCR blev anvendt til de samme cellelinjer at evaluere berigelse af de angivne histon modifikationer inden for enten den

MAGEA1

5′-region eller

GAPDH

promotoren (der repræsenterer en ubikvitært aktiv promotor). Dataene stammer fra mindst to uafhængige chip eksperimenter med to dobbelte qPCR foranstaltninger i hvert tilfælde.

TSA inducerer forbigående aktivering af

MAGEA1

i melanom celler

I for at vurdere bidraget af histonacetylering i epigenetisk regulering af

MAGEA1

, vi udsat SK-MEL-23 og EB16-MEL-cellelinier til histon deacetylase (HDAC) -hæmmer TSA og undersøgt dens virkning på transkriptions- og DNA methylering niveauer af genet. I SK-MEL-23 celler, blev udsat for TSA forbundet med en 3,3 gange stigning i

MAGEA1

mRNA-niveau, når det vurderes én dag efter behandlingen. Imidlertid blev denne virkning tabt på dag 4 og 7 efter behandling (fig. 2A). I EB16-MEL, vi var ude af stand til at opdage nogen væsentlig aktivering af

MAGEA1

efter TSA (fig. 2A), der var i overensstemmelse med tidligere data, der viser, at effekten af ​​TSA på

MAGEA1

aktivering er celletype afhængig [22]. Til sammenligning blev begge cellelinier behandlet med DNA-methyleringsinhibitor 5-aza-2′-deoxycytidin (5-azadC). Fordi dette stof inducerer replikation-afhængige DNA demethylering, blev behandlingen opretholdt under fire dage før analyse. Kvantitative RT-PCR-forsøg viste, at 5-azadC (1 uM) inducerede signifikant

MAGEA1

ekspression i begge cellelinier. I SK-MEL-23-celler, niveauet af

MAGEA1

mRNA observeret efter 4 dage af 5-azadC behandling var 135 gange højere end observeret efter én dags TSA behandling. Endvidere i begge cellelinier, 5-azadC-induceret aktivering af

MAGEA1

blev stadig detekteret på dag 3 og 6 efter fjernelse af lægemidlet (fig. 2B).

SK-MEL -23 og EB16-MEL-cellelinier blev udsat for enten 300 nM TSA under 24h (

A

), eller 1 pM 5-azadC under 96h (

B

), og RNA blev ekstraheret fra cellerne ved dag 1, 4 og 7 efter TSA behandling eller på dag 4, 7, 10 efter 5-azadC behandling.

MAGEA1

ekspressionsniveauer blev bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Værdier, som stammer fra tre uafhængige forsøg, blev normaliseret ved

ACTINB

udtryk niveau, og er udtrykt i forhold til de niveauer, der findes i ikke-behandlede celler (Ctrl). *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001.

C

, Effekten af ​​TSA og 5-azadC på

MAGEA1

5′-region DNA demethylering blev vurderet ved anvendelse af MS-PCR til DNA-prøver udvundet 10 dage efter begyndelsen af ​​behandlingerne. Data (fold demethylering) svarer til den relative mængde af ikke-methylerede sekvenser i behandlede celler rapporteret som hos ubehandlede celler (CTRL). Værdier repræsenterer middel (± sem) af tre uafhængige QMS-PCR-forsøg. *

P

0,05, **

P

. 0,01

I overensstemmelse med vores udtryk undersøgelser, afslørede kvantitative MS-PCR resultater, TSA inducerede ikke signifikant fald i

MAGEA1

promotor methylering niveau, i enten SK-MEL-23 eller EB16-MEL-cellelinier (fig. 2C). Betydelig demethylering af

MAGEA1

promotor blev i stedet observeret i begge cellelinier efter 5-azadC behandling (Fig. 2C).

Alt i alt, disse resultater antydede, at mens TSA kan fremkalde forbigående de-repression af

MAGEA1

i oprindeligt ikke-udtrykkende celler, betyder det ikke fører til DNA-demethylering og langsigtet transkriptionsaktivering af genet.

histon ændringer i forbindelse med en

in vitro

methylerede

MAGEA1

transgen

Vores manglende evne til at detektere TSA-induceret demethylering og langsigtet aktivering af gen

MAGEA1

, som rapporteret her ovenfor, kunne skyldes eksperimentelle begrænsninger . Det er muligt eller endog, at den epigenetiske virkninger af TSA på

MAGEA1

opstod i kun en lille del af cellerne, hvilket gør det meget vanskeligt at konstatere væsentlige genaktivering og DNA methylering ændringer i den behandlede cellepopulation. Desuden åbenlys epigenetisk aktivering af

MAGEA1

af TSA kan kræve tilstedeværelsen af ​​passende transkriptionsfaktorer, som ikke kan være til stede i SK-MEL-23 eller EB16-MEL-cellelinier. Vi har vist, ja, at langvarig aktivering af

MAGEA1

kræver ikke blot en DNA demethylering proces, men også tilstedeværelsen af ​​transskriptionelle aktivatorer for at forhindre efterfølgende remethyleringen af ​​promotoren [23].

Vi besluttede derfor at re-vurdere virkningen af ​​TSA på en tidligere etableret celle-system (MZ2-MEL.TrHM), der indeholder en valgbar

MAGEA1

konstruere [24]. MZ2-MEL.TrHM celler indeholder et transgen (

MAGEA1 /hph

) omfattende en stor del af

MAGEA1

locus (herunder promotorregionen) efterfulgt af den sekvens, der koder resistens over for hygromycin (

HPH

;. figur 3A). Den transgen blev methylerede

in vitro

før transfektion, og forbliver methylerede og tavs i MZ2-MEL.TrHM celler, som derfor følsomme over for hygromycin. viste dog, at hygromycinresistente (Hygro

r) celle kloner frem, når den

MAGEA1 /HPH

transgen bliver stabilt aktiveret, for eksempel efter forbigående behandling med 5-azadC [24]. Vigtigere, blev MZ2-MEL.TrHM celler afledt af en

MAGEA1

udtrykkende melanom cellelinie. Disse celler indeholder derfor alle nødvendige transkriptionsfaktorer at sikre langsigtet aktivering af genpromotoren, som vist ved tilstedeværelsen af ​​en aktiv og ikke-methyleret endogene

MAGEA1

gen.

A

, Skematisk fremstilling af status strukturen og DNA methylering af de aktive umethylerede (tomme cirkler)

MAGEA1

gen og inaktive methylerede (udfyldte cirkler)

MAGEA1 /HPH

transgen i MZ2-MEL .TrHM celler. Sorte kasser svarer til de

MAGEA1

exons, den mørke grå boks i

MAGEA1 /HPH

transgen repræsenterer den

HPH

transskription enhed, og stjerne (*) er den site, hvor en 12-bp tag-sekvens (bærer en

Xba

I restriktionssted) blev indsat. Den nedre panel er en forstørrelse af amplikonet blev amplificeret i CHIP eksperimenter, og angiver de forventede fragmentstørrelser følgende

Xba

fordøjelse.

B

, CHIP eksperimenter blev anvendt på MZ2-MEL.TrHM. Det resulterende

MAGEA1

amplikoner blev spaltet med

Xba

I og separeret på agarose geler og derved afsløre relative berigelse af de angivne histon modifikationer inden for enten den

MAGEA1

gen (øvre bånd ) eller

MAGEA1 /HPH

transgen (nedre bånd).

C

, Relativ berigelse af histon mærker på transgen blev udledt ved at kvantificere band intensiteter i gel elektroforese billeder (ImageJ software), og beregningen af ​​den nedre /øvre forhold. Data som blev normaliseret ved den nedre /øvre forholdet i input prøver, stammer fra mindst to uafhængige chip eksperimenter med to PCR /XbaI /elektroforese analyser i hvert enkelt tilfælde. *

P

0,05, ***

P

. 0,001

Vi først gennemført CHIP eksperimenter for at identificere histon ændringer i forbindelse med den tavse

MAGEA1 /HPH

transgen i MZ2-MEL.TrHM celler. Tilstedeværelsen af ​​en tag-sekvens i

MAGEA1 /HPH

transgen, indsat i position +158 i forhold til transkriptionsstartsitet og indeholdende en

Xba

-I restriktionssted, tilladt os at skelne

MAGEA1

ampliconer oprindelse fra enten exogene transgen eller det endogene gen. Således MZ2-MEL.TrHM kromatin-afledte

MAGEA1

amplikoner blev spaltet med

Xba

-I, hvorved der opnås en øvre bånd (330 bp) afledt af den endogene

MAGEA1

gen og et nedre bånd (269 bp) afledt af

MAGEA1 /hph

transgen efter elektroforese i agarose (fig. 3A, B). Ved at anvende denne procedure til analyse af chip-afledt kromatin prøver, fandt vi, at H3ac og H3K4me2 histon mærker var stærkt forarmet i

MAGEA1 /HPH

transgen, i forhold til det endogene

MAGEA1

gen. I modsætning hertil optrådte den undertrykkende H3K9me2 varemærket overvejende beriget i transgenet (fig. 3B, C). Disse resultater indikerer, at efter integration i MZ2-MEL.TrHM genom,

in vitro

methylerede

MAGEA1 /HPH

transgen vedtaget histon mærker typisk er forbundet med den undertrykte tilstand

MAGEA1

gen i ikke-udtrykkende celler.

Mangel på langsigtet aktivering af

MAGEA1 /HPH

efter TSA behandling

Som vi fundet lav histonacetylering inden for tavse

MAGEA1 /HPH

transgen, testede vi evnen hos TSA at inducere stabil aktivering af transgenet, og dermed fremkomsten af ​​hygro

r kloner blandt de behandlede MZ2-MEL.TrHM cellepopulation. Ud over den konventionelle 24h TSA behandling blev en 72 timer lang TSA eksponering påført MZ2-MEL.TrHM celler, som det blev rapporteret, at langvarig behandling med HDAC-inhibitorer kan i nogle tilfælde være nødvendigt at inducere lokaliseret DNA demethylering [25]. Koncentrationen af ​​TSA i 72 h behandling blev reduceret til 80 nM, fordi højere doser viste sig at dræbe de fleste celler i denne periode. Udover TSA-behandlede celler, analyserede vi også celler behandlet med en suboptimal dosis af 5-azadC (20 nM;. Figur 4A). 5-azadC ved denne dosis blev fundet at fremkalde

MAGEA1 /HPH

mRNA-ekspression på et niveau, der kan sammenlignes med observeret på dag 1 efter 24 TSA behandling (fig. 4B). Behandling med det suboptimale dosis på 5-azadC tilladt os at kontrollere, om vores hygromycinselektion procedure stadig var effektiv til betingelser, hvor kun lavt niveau aktivering af transgenet indtraf.

A

, principskitse af eksperimentet. MZ2-MEL.TrHM celler blev behandlet eller ikke (kontrol) med 300 nM TSA i 24 h, 80 nM TSA i 72 timer, eller med 20 nM 5-azadC i 72 timer. Efter tre dage blev 10

6 celler fra hver gruppe overført til to kolber (75 cm

2) og blev udvalgt i et medium indeholdende hygromycin (180 ug /ml) i løbet af 13 dage.

B

, Niveauet af ekspression af det

MAGEA1 /HPH

transgen blev kvantificeret ved QRT-PCR på det angivne tidspunkt (d1 eller d3) i hver gruppe af celler. Dataene repræsenterer gennemsnittet (± sem) af al mindst tre uafhængige forsøg. ***

P

0,001.

C

, Niveauet af DNA demethylering af

MAGEA1 /hph

5′-region i de forskellige grupper af celler blev vurderet ved kvantitativ MS-PCR under anvendelse af primere, der specifikt amplificerer den mærkede transgen sekvens. Dataene (fold DNA demethylering) blev beregnet som i fig 2C, og svarer til middelværdien (± SEM) af mindst tre uafhængige forsøg. *

P

0,05.

D

, Antallet af kloner, som overlevede hygromycinselektion blev talt på dag 16 i de tre grupper af celler. Dataene stammer fra mindst to uafhængige forsøg, hver i to eksemplarer.

Kvantitativ RT-PCR-forsøg viste, at mens lav men signifikant

MAGEA1 /HPH

mRNA induktion blev observeret på dag 1 efter den 24 TSA behandling, denne induktion blev allerede mistet to dage senere (fig. 4B). MZ2-MEL.TrHM celler, der var blevet udsat for 72 timer TSA behandling viste en meget beskeden stigning i

MAGEA1 /HPH

mRNA-ekspression (ikke signifikant,

p = 0,1428

) sammenlignet med kontrolceller (fig. 4B). Denne lave induktion var formentlig tilskrives den reducerede koncentration af TSA i denne tilstand. Desuden kvantitativ MS-PCR rettet specifikt mod den transgene

MAGEA1

5′-region, afslørede ingen demethylering af denne DNA-sekvens i en af ​​TSA-behandlede cellepopulationer sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 4C) . I modsætning hertil celler behandlet med suboptimal dosis på 5-azadC viste moderat, om end betydelig, DNA demethylering af

MAGEA1 /HPH

transgen.

For at opdage sjældne celler, hvor

MAGEA1 /HPH

transgen aktivering kunne have fundet sted, og som kan være forblevet usynlige i vores RT-PCR og MS-PCR-analyser, vi forelagde de forskelligt behandlede MZ2-MEL.TrHM cellepopulationer til valg i hygromycin. Efter 13 dages selektion blev hygro

r kolonier tælles. Den gennemsnitlige hyppighed af hygro

r kloner opnået efter enten 24 eller 72 timer TSA behandling (6 × 10

-6 og 5,5 × 10

-6, henholdsvis) var ikke højere end observeret for ubehandlet kontrol celler (9,5 x 10

-6), og modsvarer således baggrundsniveauet for spontant hygro

r tilbagemuterede celler (fig. 4D). Til sammenligning behandling med suboptimal dosis på 5-azadC resulterede i fremkomsten af ​​et langt højere antal hygro

r kloner ( 3 × 10

-4). Tilsammen indikerer disse resultater, at TSA ikke inducerer DNA demethylering og stabil aktivering af

MAGEA1 /HPH

transgen, ikke engang i en lille del af de behandlede MZ2-MEL.TrHM celler.

DNA demethylering inducerer tilbageførsel af histon mærker i

MAGEA1 /HPH

i betragtning af tidligere undersøgelser af andre [18], [19] og de observationer, vi beskrev her ovenfor, forekommer det usandsynligt, at ændringer på niveau med histon kan modifikationer på egen hånd være en tilstrækkelig trigger til at forårsage DNA demethylering og langsigtet aktivering af

MAGEA1

gen. Det var derfor rimeligt at foreslå, at tilbageførsel af histon mærker forbundet med

MAGEA1

aktivering er i stedet en konsekvens af DNA demethylering. For at teste denne hypotese, vi tyede til en tidligere etableret hygro

r delpopulation af MZ2-MEL.TrHM celler (H

r population, fig. 5A og [24]), som var blevet opnået efter forbigående eksponering af cellerne til antisense-oligonukleotider rettet mod

DNMT1

, det fremherskende DNA methyltransferase i disse celler [24]. Vi besluttede at foretage CHIP eksperimenter på H

r befolkning for at fastslå virkningen af ​​DNA demethylering på H3ac, H3K4me2 og H3K9me2 histon mærker inden for

MAGEA1 /HPH

transgen. Analyser blev også udført på en celleklon (H

r klon 1), som var blevet isoleret fra H

r population (fig. 5A). Kvantitativ RT-PCR og natriumbisulfit sekventering bekræftede robust transkriptionel aktivering og DNA demethylering af

MAGEA1 /hph

transgen i H

r befolkning og H

r klon 1 (fig. 5B).

En

, Skematisk oversigt over udledningen af ​​H

r befolkning og H

r klon 1 fra MZ2-MEL.TrHM celler (se reference [24] for detaljer) . MZ2-MEL.TrHM celler blev gentagne gange transficeres med antisense-oligonukleotider rettet mod

DNMT1

(

DNMT1-AS

) i løbet af 7 dage, og blev derefter overført til medium, der indeholder hygromycin. Efter 9 dages hygromycinselektion, en resistent population opstået (H

r befolkning), og en klon (H

r klon 1) blev isoleret fra denne population ved begrænsende fortynding. H

r befolkning og H

r klon 1 blev efterfølgende dyrket uden hygromycinselektion.

B

, mRNA udtryk niveau (forholdet til 10

4

ACTINB

) og DNA methylering status 5′-region (% denatureret CpG’er) i

MAGEA1 /HPH

transgen blev bestemt i MZ2-MEL.TrHM celler, H

r befolkning og H

r klon 1 ved QRT-PCR og bisulfit sekventering, hhv.

C

, chip-qPCR blev anvendt til at evaluere berigelse af H3K9me2 inden for

MAGEA1 /HPH

transgen i de tre grupper af celler (se tekst for detaljer). Fold berigelse niveauer blev opnået ved at rapportere de

MAGEA1

5′-region berigelse værdier til den for

GAPDH

5′-region i den samme prøve. Dataene repræsenterer gennemsnittet (± sem) af to til tre CHIP eksperimenter med to dobbelte qPCR målinger i hvert enkelt tilfælde. ***

P

0,001.

D

, chippen /PCR /

Xba

jeg procedure (se fig. 3A, B) blev anvendt til at evaluere berigelse af H3ac og H3K4me2 inden 5′-regionen af ​​

MAGEA1 /HPH

transgen i de tre gruppe af celler.

E

, ImageJ analyser af gel elektroforese billeder blev anvendt til at kvantificere

MAGEA1

5′-region transgen /gen-forholdet. Dataene repræsenterer gennemsnittet (± sem) af to uafhængige chip eksperimenter med to PCR /Xbal /elektroforese analyser i hvert tilfælde. **

P

0,01, ***

P

. 0,001

Til analysen af ​​H3K9me2 blev chip prøver indsendt til kvantitativ PCR med primere ikke at skelne mellem endogen og transgene

MAGEA1

sekvenser. Manglende H3K9me2 inden den endogene aktive

MAGEA1

gen i MZ2-MEL.TrHM celler (se fig. 3B, C) underforstået dog, at de fleste chip-afledte amplikoner ville stamme fra

MAGEA1 /HPH

transgen. Resultaterne, der er afbildet i figur 5C, var i overensstemmelse med en nedsat berigelse af H3K9me2 inden 5′-området af

MAGEA1 /hph

i H

r befolkning og i H

r klon 1 i forhold til kontrol MZ2-MEL.TrHM celler. Til analyse af H3ac og H3K4me2, vi tyede til chippen-PCR-

Xba

jeg beskrevet ovenfor (fig. 3A). Resultaterne viste, at mens

MAGEA /HPH

transgen var ikke forbundet med H3ac og H3K4me2 i MZ2-MEL.TrHM kontrol celler, det viste betydelig berigelse af disse to aktivering mærker i H

r befolkning og i H

r klon 1 (fig. 5D, E). Tilsammen indikerer disse resultater, at forbigående udtømning af DNMT1 i MZ2-MEL.TrHM celler, resulterede i fremkomsten af ​​hygro

r celler, hvor re-aktiverede

MAGEA1 /HPH

locus de viste ikke kun markeret DNA hypometylering, men også betydelig tilbageførsel af sin histon modifikation profil mod en aktiv konfiguration.

diskussion

genom hypometylering ofte observeret i tumorceller, og er blevet forbundet med malign progression. Men mekanismerne bag denne epigenetiske ændringer er stadig ukendt. I betragtning af den tætte sammenhæng, der eksisterer mellem DNA methylering og histon ændringer, var det rimeligt at foreslå, at DNA hypometylering i tumorer kan være en konsekvens af ændringer, der forekommer på niveau med histon mærker. Ændringer af histon modifikation profiler er faktisk blevet observeret i forskellige tumortyper, og har i nogle tilfælde været forbundet med mutationer i histon modificerende enzymer [26].

I den foreliggende undersøgelse, vi analyserede forholdet mellem DNA methylering og histon modifikationer inden for

MAGEA1

gen, da det hører til den unikke gruppe af CG-gener, for hvilken promotor hypometylering blev ofte observeret i en række tumorer og konsekvent forbundet med transkriptionel aktivering [11]. Det er tidligere blevet rapporteret, at demethylering og aktivering af CG-gener i tumorer generelt er forbundet med tab af repressive histon mærker, og gevinster ved aktivering histon varemærker [18], [19]. En sådan forening blev bekræftet i vores nuværende undersøgelse, som vi fandt, at

MAGEA1

demethylering og aktivering i melanom celler korrelerede med tab H3K9me2 og gevinster i H3ac og H3K4me2. Tidligere undersøgelser viste imidlertid, at ekspressionen af ​​

MAGEA1

kunne ikke aktiveres ved blot at modulere H3K9me2 eller H3K4me2 niveauer, hvilket antyder, at disse to histon modifikationer spiller kun en underordnet rolle i epigenetisk regulering af dette gen [18], [19]. Hæmmere af histondeacetylaser, herunder TSA, blev i stedet fundet at fremkalde aktivering af

MAGEA1

, hvilket indebærer, at histonacetylering kan bidrage mere aktivt til epigenetisk regulering af dette gen [22], [27]. Vores nuværende data viser dog, at TSA behandling fører til kun forbigående aktivering af

MAGEA1

og ikke medfører DNA demethylering i genet promotoren.

Vores undersøgelse giver en dybtgående analyse af effekten af TSA på

MAGEA1

aktivering, da vi testede dens indvirkning ikke kun i ikke-udtrykkende cellelinjer, men også i MZ2-MEL.TrHM celle-klon, som indeholder en

in vitro

methylerede transgen, der omfatter 5′-delen af ​​

MAGEA1

efterfulgt af sekvensen kodende resistens over for hygromycin. Denne celle system giver høj følsomhed, da det tillader selektion af celler (selv om de er sjældne), hvori aktivering af

MAGEA1

promotor forekom. Desuden, fordi cellerne udtrykker endogene

MAGEA1

gen, de tydeligvis indeholder alle nødvendige faktorer for at sikre transkriptionel aktivering af transgene

MAGEA1

promotor, når den er sluppet løs fra kromatin begrænsninger. Vigtigt er det, vi viste, at i modsætning til den endogene

MAGEA1

gen promoter, den exogene

MAGEA1

transgen promotor i MZ2-MEL.TrHM celler var forbundet med høje niveauer af H3K9me2 og lave niveauer af H3ac og H3K4me2. Dette tyder på, at efter dets integration i værten kromatin,

in vitro

methylerede

MAGEA1

transgen vedtog undertrykkende histon modifikation profil typisk er forbundet med den

MAGEA1

gen i konstitutivt