PLoS ONE: Konvertering Redox Signaling til Apoptotiske Aktiviteter af stress-Responsive Regulators HSF1 og Nrf2 i Fenretinid Behandlet Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Farmakologisk intervention redox balance i cancerceller resulterer ofte i oxidativ stress-medieret apoptose, tiltrækker meget opmærksomhed til udvikling af en ny generation af målrettet terapi i kræft. Men lidt om mekanismerne bag konverteringen fra oxidative signalering til downstream-aktiviteter, der fører celler ihjel.

Metodologi /vigtigste resultater

Vi her rapporterer en systematisk registrering af transkriptom ændringer som reaktion på oxidativ signaler genereret i leukæmiceller upon fenretinid behandling, implicerer forekomsten af ​​talrige stress-responsive begivenheder i fenretinid apoptose, såsom redox reaktion, endoplasmatisk reticulum stress /udfoldet protein reaktion, translationel undertrykkelse og proteasom-aktivering. Desuden er konfigurationen af ​​disse relevante begivenheder primært orkestreret af stress responsive transkriptionsfaktorer, som typisk fremhævet af NF-E2-relateret faktor-2 (Nrf2) og varme chok faktor 1 (HSF1). Flere linjer af beviser tyder på, at en koordineret regulering af disse transkriptionsfaktorer og dermed deres downstream gener er involveret i at konvertere oxidative signalering til downstream stress-responsive begivenheder regulerer pro-apoptotiske og apoptotiske aktiviteter på de tidsmæssige og rumlige niveauer, typifying oxidativ stress-medieret programmeret døden snarere end overlevelse i kræftceller.

konklusioner /betydning

Denne undersøgelse giver en køreplan for forståelse oxidativ stress-medieret apoptose i kræftceller, som kan videreudvikles til mere avancerede terapeutiske protokoller, som impliceret ved synergistisk induktion af celle apoptose ved hjælp Proteasominhibitorerne med fenretinid

Henvisning:. Wang K, Fang H, Xiao D, Zhu X, han M, Pan X, et al. (2009) Konvertering Redox Signaling til Apoptotiske Aktiviteter af stress-Responsive Regulators HSF1 og Nrf2 i Fenretinid Behandlede kræftceller. PLoS ONE 4 (10): e7538. doi: 10,1371 /journal.pone.0007538

Redaktør: Maurizio C. Capogrossi, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Italien

Modtaget: 31. maj 2009; Accepteret: September 30, 2009; Udgivet 21. oktober, 2009

Copyright: © 2009 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af Knowledge Innovation Program for kinesiske videnskabsakademi (KSCX2-YW-R-19, KSCX1-YW-22-01), Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina Tilskud (2006CB910405, 2006CB910700, 2007AA02Z335 og 2009CB825607), national Natural Science Foundation Tilskud (30.730.033, 30.670.436 og 30.600.260), Shanghai Postdoc Scientific Program (09R21414900). LTR er en del af TB-VIR netværk (European Community Grants of FP7, 200973). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

udviklingen af ​​behandlinger mod kræft kan drage fordel af den akkumulerede viden i kræft biologi, især med hensyn til kræft kendetegnende såsom selvforsyning i vækstsignaler, unddragelse af programmeret celledød og metastase [1]. Seneste eksperimentelle og kliniske data giver overbevisende dokumentation for, at reduktionen /oxidation (redox) signalveje kan spille en væsentlig rolle i carcinogenese og ondartet progression [2]. Generelt maligne celler er uløseligt under pro-oxidant mikromiljø, med øgede steady state niveauer af reaktive ilt arter (ROS) [3], der repræsenterer en anden lovende komponent af biologiske forskelle mellem kræft og normale celler. For nylig er nye terapeutiske interventionsstrategier producerer en tilstand af selektiv oxidativt stress i cancerceller fået større betydning [4].

Redox regulering har vist sig at være en vigtig mekanisme af malign celle overlevelse. Shifting det cellulære redox balance gennem farmakologisk manipulation til fordel for øget intracellulær ROS kan føre til oxidativ stress og efterfølgende induktion af apoptose i kræftceller. Indgrebet af apoptose i cancerceller induceret af ROS-genererende midler er formentlig ledsaget af aktivering af endoplasmatisk reticulum (ER) stress. Apoptose kan udløses af dødsreceptorer stimulerer ydre vej, eller ved perturbation af intracellulær homeostase involverer mitokondrier-associerede indre vej og ER stress-medieret vej. Disse initierende pro-apoptotiske signaler endelig konvergere på centrale bøddel af apoptose ved afbrydelse af mitokondrielle transmembranpotentiale (MMP) i mitokondrier samt aktiveringen af ​​caspase kaskader. Nå niveauet i et omfang overstiger den endurable redox tærskel, kan ROS fungere som specifikke signaler stimulerende ER stress-medieret apoptose specifikt i cancerceller. Som svar på forskellige stimuli, herunder oxidative stressfaktorer [5], til [6], har ER udviklet udfoldet protein respons (UPR) modulering flere transkriptionsfaktorer (fx ATF6, XBP1 og CHOP) i et forsøg tilpasse for overlevelse eller på anden måde gennemgå apoptose vender langvarig UPR. Men der er begrænset viden om mekanismerne bag konverteringen fra oxidativ signalering til nedstrøms stress begivenheder, der førte celler ihjel. Med tilgængeligheden af ​​passende terapeutiske ROS-generering agenter, systematisk karakterisering af genekspression og den underliggende transkriptionelle forordning vil være nøglen til opklaringen af ​​en sådan konvertering.

Med udviklingen af ​​ROS-genererende midler såsom arsentrioxid (ATO) til behandling af akut promyelocytisk leukæmi (APL) [7], muligheden for at udnytte selektiv oxidativt stress som apoptoseinducerende cancerterapi er fremstår som en lovende terapeutisk mulighed. Eksperimentelle data har vist, at den terapeutiske effektivitet af ATO medieres af ROS intracellulær produktion og efterfølgende apoptose [8]. Selvom ROS-inducerende midler som ATO har vist store potentialer i behandlingen af ​​maligne celler, forbliver bivirkningerne at være fuldt evalueret [9]. Der er stor interesse i at designe de mest rationale redox-aktive strategier med minimale

in vivo

bivirkninger. I dette aspekt N- (4-hydroxyphenyl) retinamid (fenretinid), et syntetisk retinoid med flere kliniske langtidsforsøg, fortjener yderligere undersøgelse [10]. I modsætning til sådanne naturlige retinoider som

all-trans

retinsyre (ATRA), fenretinid udøver forskellige biologiske virkninger, fortrinsvis engagere apoptosecyklus i mange tumorceller rettet mod ROS samtidig bevare sin minimale

in vivo

cytotoksicitet for normale celler [11], [12]. Mekanismer for fenretinid apoptose er blevet intensivt undersøgt [13] – [15]. De seneste data tyder på, at denne ROS frembringende middel kan forstyrre cellulære homeostase og modulere de forskellige stress-relaterede gener, implicerer, at inddragelsen af ​​ROS-afhængige ER stress kan gøre modtagelighed af kræftceller til fenretinid-induceret apoptose [16]. Imidlertid er de mekanismer, ved hvilke ROS-dannelse fører til ER stress og kræft celle apoptose er langt fra klare. Detaljeret belysning af disse mekanistiske links kan give indsigt i oxidativ stress-medieret apoptose i cancerceller og tillade optimering af kræft-specifikke målretning behandlingsformer.

Vi spekulere at kræftceller med disposition af redox signalering er mest sandsynligt følsomme over for oxidative stimuli fra ROS-genererende stoffer såsom fenretinid, gennemgår oxidativ stress-medieret apoptose. For præcist afdække reguleringsmekanismer ligger til grund for konvertering fra oxidative signalering til nedstrøms stress begivenheder udøvet på ER og i sidste ende til døden resultater snarere end overlevelse fordele, vi ansat integrative metoder til avanceret data mining med microarray teknologi til at profilere transkriptom ændringer i en fenretinid-følsom cellelinie og fundet talrige tidsmæssige-rumlige forhold mellem stress-responsive begivenheder. Desuden stress-responsive transkriptionsfaktorer, som fremhævet af NF-E2-relateret faktor-2 (Nrf2) og varme chok faktor 1 (HSF1), spille fremtrædende roller i konfigurationen af ​​disse relevante begivenheder. Valideringer gennem immunofluorescene og kromatin immunopræcipitationsanalyser og stress-relaterede transkriptom sammenligninger yderligere bevis for, at disse stress-responsive regulatorer og dermed deres mål gener er involveret i at konvertere oxidative signalering til downstream stress aktiviteter, herunder redox reaktion, ER stress /UPR og proteasom aktivering, der repræsenterer typiske begivenheder af oxidativt stress medieret apoptose i Fenretinid-behandlede maligne celler.

Resultater

Fenretinid inducerer intracellulær produktion af ROS og således apoptose i en række forskellige maligniteter, herunder leukæmi [10]. Vi analyserede de antiproliferative og apoptotiske virkninger af fenretinid på leukæmi-afledt cellelinier NB4, U937, og HL60, og fundet, at disse cellelinjer undergik vækstinhibering og apoptose i respons til 1-2 uM fenretinid, og at deres modtagelighed syntes at være korreleret med niveauer af ROS (Supplerende figur S1). Baseret på dets relativt høj følsomhed for lægemiddelinduceret ROS-generering og apoptose blev NB4 valgt som en prototype cellelinie til cellulære og molekylære Vurdering inden detaljeret transkriptom analyse. Som vist i figur 1A, blev NB4 cellevækst inhiberet af fenretinid behandling på en dosis-afhængig måde. Behandling med en lav dosis (1 uM), i fenretinid syntes at være tilstrækkelig til at inducere apoptose i NB4-celler inden for 72 timer, som det fremgår af mitokondrie membranpotentiale og annexin V-assays (figur 1B og 1C). Gennemgået yderligere intracellulære ROS skifter i løbet af denne tidsforløbet. Overraskende fandt vi, at ROS ændringer var mere kompleks end tidligere indregnet, viser venstre skæv klokke-form kurve (Figur 1D). Som forventet, ROS akkumuleret kraftigt og nåede en fire-dobling i forhold til de basale niveauer inden for 6 timer efter behandling, mens det uventet faldt gradvist derefter til et niveau, der svarer nogenlunde til det dobbelte af basale niveauer af ubehandlede celler. Disse data antyder inddragelsen af ​​redox signalering i NB4 celler efter fenretinid behandling. Fenretinid stimulering forårsager en hurtig ophobning af intracellulær ROS, som igen kan aktivere cellulære mekanismer til nedbringelse ROS-niveauer. Desuden er de moderate niveauer af intracellulære ROS sandsynligvis kræves til fenretinid-induceret apoptose.

(A) Cellelevedygtighed blev evalueret under anvendelse af et MTT-assay efter forskellige doser af fenretinid i 48 timer. (B) Tab af mitokondrie membranpotentiale Δ

Ψm med 1 pM fenretinid behandling, som bestemt ved rhodamin 123 og propidiumiodid (PI) dobbelt farvning, og efterfulgt af flowcytometri analyse. (C) Apoptose efter 1 pM fenretinid behandling blev vurderet ved annexin V-specifikt antistof og PI dobbelt-farvning og flowcytometri-analyse. (D) Dynamiske ændringer af ROS, som evalueret i celler farvet med DCFH-DA og efterfulgt af flowcytometri analyse. Middelværdier ± SD plottes fra tre uafhængige forsøg.

Robust transkriptom profilering af fenretinid-induceret apoptose

Time-serien microarray hybridisering, gen-valg, og identifikation af transkriptom funktioner.

for at analysere de detaljerede mekanismer bag fenretinid-induceret apoptose, vi udførte transkriptom profilering på prøver af Fenretinid-behandlede NB4 celler, som blev indsamlet på 19 tidspunkter og ubehandlede celleprøver på 4 tidspunkter. Efter microarray hybridisering og dataopsamling blev genekspression data først udsat for en topologi-bevarelse udvælgelsesprocedure gen gennem selvorganiserende kortet (SOM) integreret ental værdi dekomposition (SVD). Ved at følge proceduren er baseret på falske opdagelse sats (FDR) statistisk inferens, blev udvalgt i alt 3.345 regulerede gener med karakteristiske mønstre (se metoder) og analyseres yderligere af komponent fly præsentation (CPP) integreret SOM [17] – [19]. Som vist i figur 2A, hver præsentation illustrerer et tidspunkterne-specifik transkriptom kort, tillader direkte sammenligninger af transkriptom ændringer inden /mellem kontrolgruppen og fenretinid-behandlede serie. Sammenligning af kontrol og behandling serie, de observerede transkriptom ændringer før den 6-timers behandling (betegnet den tidlige fase) er for det meste på grund af kultur varighed, hvilket indebærer, at den tidlige fase effekt induceret af fenretinid er primært biokemiske, med begrænsede virkninger på transkriptionel regulering. Men fremtrædende transkriptom ændringer blive synlige efter 8 timers behandling, som fremhævet af gener kortlagt til neuroner i nederste højre hjørne (også kaldet Gruppe 6 på højre panel af figur 2A). Disse gener er tydeligt opreguleret efter den tidlige fase, der repræsenterer en væsentlig transkriptom funktion under fenretinid-induceret apoptose. Da ROS akkumulering er en fremtrædende virkning af fenretinid behandling, er det logisk at spekulere, at modulering af disse gener er et resultat af ROS akkumulering.

(A) Illustration af transkriptom ændringer ved CPP-SOM. Hver præsentation illustrerer en tid-point specifikke transkriptom kort, hvor alle de opreguleret (repræsenteret ved neuroner i rødt), nedreguleret (ved neuroner i blåt) og moderat reguleret (ved neuroner i gule og grønne) Gener er godt afgrænset. Farvestang står til ekspression værdier (log-forhold med basis 2), med lysere at betegne den højere værdi. Præsentationer i kontrol serien er angivet med hvide bar nedenunder, mens de i fenretinid behandlet serien er opdelt i tre faser: tidligt, mellemliggende og sene, som angivet med grå-gradueret bar nedenunder. Alle præsentationerne er forbundet af positioner, dvs. den samme position repræsenterer det samme neuron, hvis indeks er vist i det forstørrede gitter ideogram på højre panel. Seks genkendelige områder opnået gennem hierarkisk klyngedannelse baseret på mønster ligheder er farvet kodet som angivet. Gener i gruppe 6 er mest fremtrædende opreguleret under apoptose, hvilket er en oxidativ stress-responsive transkriptom signatur spektrum. (B) Illustration af ekspressionsmønstre af gener i repræsentative neuroner i gruppe 6 gennem farvekodede line grafer og søjlediagrammer, som eksemplificeret ved neuroner 46, 47, 40 og 49. Deres tilsvarende PWM og /eller GO berigelser er også angivet. (C) Større funktionelle træk forbundet med oxidativt stress-medieret apoptose, som visualiseres ved hierarkisk gruppering af repræsentative gener.

Transcriptional og funktionelle træk ved klynger gener karakteristisk fremhæver oxidativ stress-medieret apoptose.

Vores robuste transkriptom tilgang muliggør gruppering af gener med meget lignende ekspressionsmønstre i samme eller nærliggende omkringliggende neuroner, som illustreret i figur 2B. Dette kan lette mange aspekter af dybdegående udvinding af biologisk relevante oplysninger om fenretinid-induceret apoptose. Vi udførte transskriptionsfaktorbindende websted (TFBS) berigelse analyse efter hypergeometriske fordeling-baserede multiple hypotesetests at udlede fælles transkriptionelle funktioner i klynger gener (se metoder). Som illustreret af repræsentative neuroner i gruppe 6 (figur 2B), transskriptionsfaktorerne Nrf2, HSF1, ATF6 og Elk1 er signifikant overrepræsenteret i henholdsvis neuron 40, 46, 47 og 49. Nrf2 vides at aktivere transkription af gener, der koder antioxidative proteiner under oxidativ stress [20], [21], HSF1 er en transkriptionsfaktor ansvarlig for ekspression af varmechok gener [22], ATF6 er et centralt transskriptionel aktivator af udfoldet protein reaktion (UPR) [23], og Elk1 er involveret i transkription for overlevelse gener [24]. Disse data tyder på, at generne i gruppe 6 i vid udstrækning er reguleret af stress-responsive transkriptionsfaktorer, fremhæver virkningen af ​​upstream oxidativ signalering på downstream effekter.

For yderligere at behandle funktionelle betydning klynger gener, vi ansat Gene ontologi ( GO) for funktionel berigelse analyse. Funktionelle funktioner med statistisk signifikans blev afsløret, forestiller en relativt omfattende billede af oxidativ stress-medieret apoptose. Blandt disse funktioner var gener involveret i transkriptionel regulering, ribosom maskiner, oxidativt stress, ER stress /UPR, ubiquitin-proteasom systemet og apoptose (figur 2C). Ændringer af gener involveret i transkriptionel regulering synes at være logisk for optagelse af maligne celler i programmeret celledød, som angivet med opreguleret

DDIT3

/

CHOP

,

CEBPB

,

CEBPG

,

NFE2L1

og

PHF1

og nedreguleret

MYC

og

IKZF1

. Reduceret ribosom aktivitet kan udgøre en direkte reaktion på stress-undertrykte samlede protein oversættelse. Regulering af redox-relaterede gener kan forklare ROS reduktion under senere stadier af fenretinid-induceret apoptose. Opregulering af et stort antal af ER stress-og UPR-regulerede gener blev observeret i perioden fra 6 til 24 timer efter behandling (betegnet mellemtrin), implicerer forekomsten af ​​ER stress-og UPR-relaterede forsvarsaktiviteter. Især observerede vi aktivering af gener involveret i ubiquitin-proteasom systemet. De fleste af gener, der koder for proteasom apparat blev induceret efter den tidlige fase, fremme nedbrydningen af ​​overbelastede ufoldede /fejlfoldede proteiner fra ER stress /UPR. Opregulering af gener, der koder regulatorer /deltagere apoptotiske kaskader (f.eks

CASP7

,

BCLAF1

,

DEDD2

,

DAP3

,

STK17A

,

LAPTM5

MAGEH1

) og nedregulering af negative apoptose regulatorer såsom

BCL2

MPO

var tilsyneladende under mellemliggende og sene stadier.

Yderligere molekylære og cellulære beviser for oxidativ stress-medieret apoptose i Fenretinid behandlet leukæmi celler

Den senere involvering ER stress /UPR og mitokondrier tilknyttede apoptotiske aktiviteter.

for at validere funktioner afsløret af transkriptom analyse og at identificere yderligere komponenter af oxidativt stress-medieret apoptose, vi yderligere gennemført en række cellulære og molekylære analyser. Som vist i panelet til venstre i figur 3A, ændringer i proteinniveauer i ER stress /UPR markør GRP78 /HSPA5 og stress-inducerbare pro-apoptotisk transskriptionsfaktor CHOP /GADD153 blev korreleret med mRNA-niveauer (figur 2C). Disse gener og proteiner var specifikt opreguleret i den mellemliggende fase, hvilket giver yderligere beviser for, at ER stress /UPR opstod under denne tidsramme. Derudover pro-apoptotiske form for CASP4, en ER stress-specifik caspase [25], blev dramatisk reduceret på det sene tidspunkt, implicerer inddragelse i fenretinid-induceret apoptose. Som vist i den højre panel i figur 3A, blev mitokondrier forbundet apoptotiske caspase kaskader aktiveret på det sene stadium. Pro-apoptotisk CASP9 blev reduceret, mens CASP3 blev øget i sin aktive form forud for sent. Desuden blev spaltet PARP observeret efter caspasekaskaden aktivering. Samlet giver protein biokemiske data understøtter også den opfattelse, at ER stress /UPR forekommer ved det mellemliggende stadium, mens mitokondrier-involverede apoptose forekommer hovedsagelig på det sene stadium.

(A) Western blot-analyse af ER stress /UPR relaterede markører og apoptotiske caspaser upon 1 pM fenretinid behandling i NB4-celler. (B) Ophævelsen af ​​fenretinid-induceret apoptose ved vitamin C. (C) Synergistisk induktion af celleapoptose ved proteasominhibitor MG132 og fenretinid. Apoptose blev vurderet ved annexin V-specifikt antistof og PI dobbelt-farvning og flowcytometri-analyse. Resultaterne viser gennemsnittet af tre uafhængige evalueringer ± SD.

Synergistisk induktion af celleapoptose ved fenretinid og proteasominhibitor.

Fenretinid-behandlede celler, ROS signalering kan repræsentere en væsentlig stimulus på det tidlige stadium af programmeret celledød. At give yderligere bevis for ROS signalering i apoptose, vi udførte en antagonist under anvendelse C-vitamin som antioxidant. Som vist i figur 3B, C-vitamin behandling fuldstændigt ophævet fenretinid-induceret apoptose i NB4-celler. Gener, der koder proteasom komponenter var signifikant opreguleret i de mellemliggende og sene stadier. Således har vi den hypotese, at proteasomaktivitet kan fungere som en forsvarsmekanisme koblet til UPR for udfoldet /misfoldet proteinnedbrydning at reducere ER stress byrde [26]. Følgelig kan proteasom aktivering modvirke pro-apoptotiske /apoptotiske kaskade. For at udforske denne hypotese, brugte vi proteasominhibitoren MG132 at blokere proteasom aktivitet under fenretinid-induceret apoptose. Som vist i figur 3C, en sub-cytotoksiske koncentration (0,2 uM) af MG132 sammen med en lav dosis af fenretinid (0,5 uM) inducerede signifikant celle apoptose inden for 48 timer, hvilket viser synergistisk frem for antagonistiske virkninger af de to forbindelser.

Konvertering oxidative signalering i downstream virkninger gennem stress-responsive transkriptionsfaktorer som fremhævet af Nrf2 og HSF1

Koordineringen mellem tidsmæssige-rumlige ændringer i Nrf2 og HSF1 og ekspressionsmønstre af deres potentielle målgener.

Vores robuste transkriptom profilering tilgang lettet dybdegående udvinding af biologisk relevante oplysninger oxidativ stress-medieret apoptose, herunder forudsigelse af opstrøms transkriptionsfaktorer involveret i genregulering. Af transkriptionelle regulatorer forudsagt, stress-responsive transkriptionsfaktorer Nrf2 og HSF1 er af særlig interesse for at forstå hvordan oxidativ signalering omsættes til nedstrømsvirkningerne. Vi har derfor undersøgt yderligere den tidsmæssige tæthed og rumlig lokalisering af disse to stress-responsive transkriptionsfaktorer under apoptose. Som vist i figur 4A, blev protein-niveauer af både Nrf2 og HSF1 markant forhøjet i kerneekstrakter inden for 6 timers eksponering til fenretinid, og deres tidsmæssige overflod blev differentieret derefter. Nrf2 induktion blev forlænget ud over 24 timer mens HSF1 induktion blev afsluttet på dette tidspunkt. Tilsvarende analyser immunfluorescensmikroskopi afslørede markant akkumulering af begge faktorer i kerner af celler behandlet med fenretinid i 6 timer, sammenlignet med en diffus fordeling af Nrf2 og HSF1 i ubehandlede celler (figur 4B). Desuden blev nukleare indsamling af Nrf2 opretholdt ud over behandlingsperioden 24 timer mens den for HSF1 blev afsluttet. I betragtning af de relativt lave niveauer af ROS med 24 timers behandling (figur 1 D), inaktivering af HSF1 skyldes formentlig en reducerende mikromiljø [22]. Desuden er de tidsmæssige-rumlige ændringer i Nrf2 og HSF1 korrelerer godt med regulatoriske mønstre af deres potentielle målgener (figur 4C). Opreguleret udtryk for Nrf2 potentiel målgener blev udvidet til det sene tidspunkt, mens genekspression af HSF1 potentielle mål enstemmigt blev afsluttet ved udgangen af ​​den mellemliggende etape.

(A) Western blot analyse af Nrf2 og HSF1 fra nukleare ekstrakter af NB4 celler ubehandlede eller behandlet med en uM fenretinid på de angivne tidspunkter. “*” Angiver den ikke-specifikke binding band. (B) Nuklear translokation af Nrf2 og HSF1 følgende 1 pM fenretinid behandling i NB4 celler, som visualiseret ved immunfluorescensmikroskopi (skala barer, 5 um). (C) Illustration af ekspressionsmønstre for gener potentielt er mål for Nrf2 og HSF1, illustreret i venstre og højre panel hhv. (D) chips kombineret med PCR-assays til at validere den fysiske interaktion mellem transkriptionsfaktorer (dvs. Nrf2 og HSF1) og deres målgener. Total: total input; IgG: Chip reaktion med IgG-antistof som en kontrol; DNAJB6

#:.. Primere designet fra ikke-TFBS region af genet

DNAJB6

Fysiske interaktioner mellem Nrf2 og HSF1, og deres målgener upon aktivering

for at undersøge, om Nrf2 og HSF1 er fysisk bundet til deres mål, vi gennemførte kromatin immunofældning (chip) assays under anvendelse af antistoffer mod Nrf2 eller HSF1. Baseret på de forventede TFBS af de repræsentative gener, der er anført i figur 4C, blev specifikke PCR-primere designet ved hjælp af chip produkter af enten Nrf2 eller HSF1 som DNA-skabeloner. Som illustreret i det venstre panel i figur 4D, gener med den forudsagte TFBS af Nrf2 (dvs.

FTL

,

NQO1

,

TXNRD1

,

GCLM

og

GCLC

) er positive for Nrf2-chip produkter, mens ikke-forbundne gener (dvs.

LRRC

,

AFIM

PAX7

) er negative i de samme produkter. Selv om et basalt niveau af Nrf2 binding blev observeret i ubehandlede chip produkter, de fleste af de forudsagte gener afslørede væsentligt stærkere signaler i behandlede prøver. Ligeledes chip-PCR analyser af HSF1 afslørede lignende resultater (figur 4D, højre panel). Især primere designet fra TFBS regionen afslørede prominente bands i HSF1 chip produkter, mens dem fra de ikke-TFBS regioner af de samme gener afslørede fraværende signaler (fx

DNAJB6 vs. DNAJB6

#

). Alt i alt viser vores dokumentation for, at Nrf2 og HSF1 aktiveres på ROS akkumulering ved udgangen af ​​den tidlige fase, konvertering af oxidativ signalering til downstream effekter ved direkte handler på deres målgener. Nrf2 aktivering strækker sig til det sene tidspunkt, mens HSF1 aktivitet afsluttes ved udgangen af ​​den mellemliggende etape.

Funktionel relevans af Nrf2 og HSF1 aktivering til oxidativ stress-medieret apoptose i kræftceller.

Potentielle mål for Nrf2 er for det meste repræsenteret af gener, der koder antioxidant proteiner eller enzymer (figur 4C) til buffer de intracellulære redox aktiviteter, såsom

FTL

,

NQO

,

TXNRD

,

GCLM

og

GCL

. Aktivering af Nrf2 på dannelsen af ​​oxidative signalering på det tidlige stadium øger ekspressionen af ​​antioxidant gener, hvilket følgelig kan resultere i gradvis ROS reduktion på mellemtrinnet, og moderat ROS niveauer på det sene stadie (Figur 1D). Potentielle mål for HSF1 er i høj grad repræsenteret af gener, der koder UPR-relaterede chaperoner (figur 4C) såsom

HSPA8

,

HSPH1

,

HSPA1A

,

HSPA9B

,

DNAJA1

,

DNAJB1

,

DNAJB6

og

SERIPINH1

. HSF1 aktivering og deres målgener synes at være forbigående, hvilket giver yderligere beviser, at UPR observeret i Fenretinid-behandlede celler forekommer under den mellemliggende fase. Forbigående modulering af UPR er sandsynligvis vigtig for oxidativ stress-medieret apoptose i cancerceller, baseret på den kendsgerning, at mange af disse UPR-relaterede chaperoner er funktionelt inhiberende for pro-apoptotiske /apoptotiske kaskader [27]. Derfor afskedigelse frem for bevarelse af UPR forud for den sene fase, hvor de fleste apoptotiske aktiviteter foregår sandsynligvis afgørende for en effektiv progression af apoptose. Udover chaperone gener, er der flere pro-apoptotiske /apoptotiske gener også reguleret af HSF1, herunder

DEDD

[28] og

BAG3

[29]. Da den opregulering af disse gener også er ophørt ved udløbet af den mellemliggende fase, er det fristende at antage, at de er involveret i opstrøms aktiviteter af pro-apoptotiske /apoptotiske kaskader.

Væsentlig effekt af Nrf2 og HSF1 på stress-responsive transkriptom signaturer relevante for oxidativ stress-medieret apoptose

Fenretinid-induceret apoptose i kræftceller sker som reaktion på oxidativ stress, og er orkestreret af stress-responsive transkriptionsfaktorer, som fremhævet af modulation af et stort antal stress-responsive gener. Typisk er disse stress-responsive gener er repræsenteret ved dem samlet i gruppe 6 (figur 2A). Følgelig vi spekuleret på, at gener i gruppe 6 kan udgøre en signatur spektrum er karakteristisk for cancerceller undergår oxidativ stress-medieret programmeret celledød snarere end overlevelse ved stress stimulus. For at validere denne antagelse, og for at vurdere de potentielle konsekvenser af Nrf2 og HSF1 på den forudsatte signatur spektrum, vi forholdsvis overlappede gener i gruppe 6 med flere sæt af udtryk, der er relevante til forskellige stressreaktioner under ikke-apoptotiske betingelser [30], og vores tidligere offentliggjorte udtryk relevante data for ATO /RA-induceret differentiering /apoptose af NB4 celler [18]. Gennem hierarkisk klyngedannelse efterfulgt af integrering af genomisk TFBS oplysninger blev stress-responsive transkriptom funktioner under apoptotiske eller ikke-apoptotiske betingelser vist (figur 5). Ved at sammenligne disse funktioner på tværs af alle de betingelser, kan signaturen spektrum yderligere opdelt i fire kategorier (I-IV). Modulation af gener i kategori I er høj grad tilskrives HSF1 aktivering, som også anført af prominente opregulering under varme chok. HSF1 aktivering under ikke-apoptotiske heat shock betingelser synes at blive opretholdt frem forbigående. Modulering af gener i kategori II synes at være mere komplekse, sandsynligvis fordi de er organiseret af flere stress-responsive transkriptionsfaktorer, såsom CHOP og XBP1, som implicerede den observerede mangesidet TFBS sammensætning. Vore data antyder, at dette gen kategori også er involveret i ER stress /UPR forekommer ved det mellemliggende trin af oxidativ stress-medieret apoptose, baseret på ekspressionsmønstre samt funktionelle anmærkninger. Gener i kategori III, er direkte involveret i redox signalering i de mellemliggende og sene stadier, som fremhævet af betydelig berigelse af Nrf2 og dets co-faktor MAF. Aktivering af gener, der koder underenheder af proteasomet apparatet er en af ​​de mest fremtrædende træk i denne undersøgelse. Disse gener er udelukkende grupperet i kategori IV. TFBS analyse implicerer, at gener i denne kategori er moduleret af Elk1.

Stress-relaterede udtryk data blev samlet og vises gennem hierarkisk klyngedannelse. TFBS oplysninger for hver transskription faktor er integreret i venstre side af skærmen, med formodede hits markeret med rødt. Forskellige betingelser er angivet ved toppen af ​​skærmen. Tre stressreaktioner blev alle induceret under tærsklen, hvor en væsentlig dødelighed indtraf. Varmechok blev induceret i HeLa, fibroblast og K562-celler; Endoplasmatisk reticulum stress blev induceret i HeLa-celler med glycosyleringen inhibitor tunicamycin eller thiol reduktionsmiddel DTT og i fibroblaster med DTT; Oxidativ stress blev induceret i HeLa-celler med H

2O

2 eller med menadion, og i fibroblaster med menadion.