PLoS ONE: Den PTEN fosfatase Controls intestinale epithelceller Polaritet og Barrier Funktion: Rolle i kolorektal cancer Progression

Abstrakt

Baggrund

PTEN phosphatase virker på phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphater som følge af phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) aktivering. PTEN ekspression er blevet vist at være nedsat i colorektal cancer. Der vides kun lidt dog som den specifikke cellulære rolle PTEN i humane intestinale epitelceller. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge den rolle, PTEN i humane kolorektale cancerceller.

Metode /vigtigste resultater

Caco-2/15 blev HCT116 og CT26 celler inficeret med rekombinante lentivira udtrykker en shRNA specielt designet til at knock-down PTEN. Virkningen af ​​PTEN nedregulering blev analyseret på cellepolarisering og differentiering, intercellulær junction integritet (ekspression af celle-celleadhæsionsproteiner, barrierefunktion), migration (viklet assay), invasion (Matrigelcoatede transbrøndene) og om tumor og metastase-dannelse i mus . Elektronmikroskopi viste, at lentiviral infektion af PTEN shRNA signifikant hæmmet Caco-2/15 cellepolarisering, funktionel differentiering og udvikling brush border. En stærk reduktion i claudin 1, 3, 4 og 8 blev også observeret samt et fald i transepitelial modstand. Tab af PTEN udtryk øget spredning, migration og invasion kapacitet kolorektale cancerceller

in vitro

. PTEN nedregulering også øget tumorstørrelse efter subkutan injektion af kolorektal cancer celler i nøgne mus. Endelig tab af PTEN ekspression i HCT116 og CT26, men ikke i Caco-2/15 førte til en stigning i deres metastatiske potentiale efter hale-vene injektioner i mus.

Konklusioner /Signifikans

Tilsammen indikerer disse resultater, at PTEN styrer cellulære polaritet, etablering af celle-celle vejkryds, paracellulær permeabilitet, migration og tumorigen /metastatisk potentiale af humane kolorektal kræftceller

Henvisning:. Langlois MJ, Bergeron S, Bernatchez G , Boudreau F, Saucier C, Perreault N, et al. (2010) Den PTEN Phosphatase Controls intestinale epithelceller Polaritet og Barrier Funktion: Rolle i Colorectal Cancer Progression. PLoS ONE 5 (12): e15742. doi: 10,1371 /journal.pone.0015742

Redaktør: Hang Thi Thu Nguyen, Emory University, USA

Modtaget: August 31, 2010; Accepteret: November 22, 2010; Udgivet: 23 December, 2010

Copyright: © 2010 Langlois et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af den canadiske Institutes of Health Research (CIHR: www.cihr-irsc.gc.ca) (CTP-82.942) og MT-14405 (til NR). N.R. er en modtager af en canadisk forskning Stol i signalering og Digestive fysiopatologi. J.C., C.S. og F.B. er forskere fra Fonds de la Recherche en Santé du Québec. S. B. er en modtager af en ph.d.-stipendium fra den canadiske sammenslutning af Gastroenterologi /CIHR /CCFC. N.R., J. C., C. S., N.P., og F.B. er medlemmer af FRSQ-finansierede “Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel”. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er den næststørste årsag til kræft-relaterede dødsfald i de vestlige lande. Et kendetegn for kolorektal cancer er tab af cellulær organisation. Den histologiske grad af colorektale carcinomer er en vigtig prognostisk variabel og afhænger af graden af ​​glandulær differentiering og cellulære polaritet. High-grade, dårligt differentierede kolorektale neoplasmer er normalt mere aggressive end deres lav kvalitet, godt differentierede modstykker [1].

I epitelceller, celle-celle vedhæftning og apikale-basal polaritet opretholdes gennem dannelse af flere intercellulære adhæsionssystemer såsom tight junctions (TJs). TJ regulerer paracellulær diffusion og funktionelt segregerer plasmamembranen i to rum, som er en forudsætning for fuld polarisering af epitelceller [2]. Neoplastiske celler ofte udviser strukturelle og funktionelle mangler i både stramme og vedhængende vejkryds [3] – [5]. Som gennemgået af Martin og Jiang [4], er det udtryk for mange stramme junction proteiner disreguleret i tarmkræft. Den adherens junction protein E-cadherin er også mindre i invasive kolorektal kræft [6]. Derudover ekspressionsmønsteret for hDlg og hScribble, kendt at styre oprettelsen af ​​apikale-basal polaritet i epitelceller [7], ændrer sig markant i løbet kolorektal tumorudvikling med nedregulering af begge proteiner er forbundet med mangel på epitelcelle polaritet og uorganiseret vævsarkitekturen [8].

phosphoinositider er også opstået i de seneste år som generelle determinanter for både polaritet og identitet af flere membraner. De seneste data viser, at PtdIns (4,5) P2 er en afgørende faktor for den apikale overflade i epitelceller [9]. Ja, i ikke-polariseret MDCK celler begge PtdIns (4,5) P2 og PtdIns (3,4,5) P3 colocalize ved celle-celle og celle-ekstracellulær matrix kontakter. Men i de tidlige stadier af polarisering, PtdIns (4,5) P2 bliver hovedsagelig koncentreret ved den apikale membran af cellerne henviser PtdIns (3,4,5) P3 forbliver lokaliseret til den basolaterale membran og udelukket fra den apikale membran. Lipidet phosphatase PTEN lokaliseres til det apikale domæne og er nødvendigt for adskillelsen af ​​PtdIns (4,5) P2 til den apikale overflade på grund af sin dephosphorylerende virkning på D3-phosphatgruppen af ​​PtdIns (3,4,5) P3 [10 ]. Endvidere PTEN fungerer som en negativ regulator af phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt-signalvejen og har vist sig at påvirke mange processer dereguleret i tumorigenese såsom proliferation, celleoverlevelse, migration og invasion [11], [12] .

PTEN er kodet af

fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom 10 Hotel (

PTEN

) tumorsuppressorgen, som er den anden hyppigst muterede gen i humane kræftformer efter

TP53

[12]. Endvidere tab af PTEN immunofarvning i tarmkræft væv er blevet forbundet med fremskreden sygdom, levermetastaser og dårlig patientoverlevelse [13] – [16], hvilket tyder på dets potentielle beskyttende rolle mod progression af human colorektal carcinogenese. Da PTEN styrer polaritet i normale epitelceller, kan man spekulere på, at tabet af dette protein kan være tilstrækkelig til at udløse epithelial-mesenchymal overgang (EMT), en kritisk tidlig begivenhed i invasionen og metastase af mange typer af cancer, herunder CRC. I tidligere undersøgelser, er virkningerne af PTEN tab primært været målt i cancer cellelinjer, som huser mange andre transformerende og onkogene mutationer, og som har mistet deres epitelial fænotype [17] – [19]. En sådan fremgangsmåde har gjort det vanskeligt at afgøre, hvilke fænotyper er direkte følger af tabet af PTEN og til at definere de stadier af tumorigenese, som er specifikt ændres i celler med PTEN tab. For yderligere at karakterisere forbindelsen mellem PTEN, tabt polaritet og kolorektal cancer progression, brugte vi Caco-2/15 cellelinie afledt fra et relativt veldifferentieret human colorectal adenocarcinom. Denne klon af den forælder Caco-2-cellelinien er blevet grundigt karakteriseret for sin evne til at foretage en fuldstændig morfologisk og funktionel intestinal epitheldifferentiering proces, som finder sted spontant, når konfluens er nået, og som er afsluttet efter 15-20 dage efter konfluens . Mere specifikt disse colon celler danner apikale stramme og adhærente samlingskomplekserne og danne en polariseret monolag efter flere dages post-konfluens, udviser transepithelial elektrisk modstand (TEER) svarende til

in vivo Salg observationer [20] – [22 ]. blev også analyseret følgende “de-differentierede” CRC cellelinier: den HCT116, en mikrosatellit-ustabil human CRC cellelinie og CT26, en mus metastatisk coloncarcinomcellelinie. Resultaterne viser, at PTEN kan virke som en barriere for udvikling af kræft ved at styre cellulære polaritet, etablering af celle-celle vejkryds, paracellulær permeabilitet, migration og metastatisk potentiale af humane kolorektal cancer celler.

Materialer og Metoder

Materiale og antistoffer

antistoffer til påvisning af PTEN (A2B1), HNF1α (C-19) og HNF4α (C-19) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antistoffer rejst mod E-cadherin og villin var fra BD Biosciences (Mississauga, ON, Canada). De antistoffer til påvisning af phospho-AKT (Ser473) og AKT var fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Den β-actin antistof var fra Chemicon (Temecula, CA). Den occludin, claudins og ZO-1 antistoffer var alle fra Zymed Laboratories (Invitrogen, Burlington, ON, Canada). Det monoklonale antistof HSI-14 mod sucrase-isomaltasemangel blev venligst stillet til rådighed af Dr. Andrea Quaroni (Cornell University, Ithaca, NY). CDX2 immunoblotting blev udført med en kanin-polyklonalt antistof mod CDX2 tidligere karakteriserede [23]. Alle andre materialer blev opnået fra Sigma-Aldrich (Oakville, ON), medmindre andet er angivet

Cell kultur

Tre tyktarmskræft cellelinjer blev anvendt i nærværende undersøgelse:.

1-The kolorektal adenocarcinom cellelinie Caco-2/15 blev opnået fra A. Quaroni (Cornell University, Ithaca, NY). Denne cellelinie tilvejebringer en unik og velkarakteriseret model til undersøgelse af tarmen epitheldifferentiering eftersom disse celler undergår funktionelle og morfologiske differentiering til en enterocytterne fænotype med mikrovilli, dome-dannelse og ekspression af sucrase-isomaltase flere dage efter at have nået konfluens [20] – [22]. Disse celler udtrykker afkortet

APC

muteret

p53

men udviser vildtype

K-Ras

,

β-catenin

mismatch repair (MMR) proteiner; de er derfor mikrosatellit stabil (MSS) [24], [25]. Disse celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Invitrogen ™) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS). 2- HCT116 celler blev opnået fra ATCC (CCL-247). Disse celler vokser i flere lag og er ude af stand polarisering eller intestinal epitheldifferentiering [20]. Disse celler er hMLH1-mangel, udtrykker vildtype

p53

, vildtype

APC

og bære aktivere

K-Ras

,

pi3kca

, og

β-catenin

mutationer [26]. Disse celler er metastatisk [27], [28] tillader os at analysere virkningen af ​​PTEN tab af udtryk i fremskredne stadier af tyktarmskræft. Disse celler blev dyrket i McCoys medium (Wisent, St-Bruno, Quebec, Canada) indeholdende 10% FBS. 3- CT26 celler (venligt leveret af Pr Nicole Beauchemin, Université McGill, Canada) blev afledt fra en udifferentieret murine adenocarcinom, som blev induceret ved rektal injektion af

N

-nitroso-

N

-methylurethane i Balb /c mus. Disse celler bære aktivering

K-Ras

mutationer [29], vildtype

p53

udtrykker ikke E-cadherin eller ZO-1 [30]. CT26-celler blev holdt i RPMI-medium (Invitrogen ™) indeholdende 10% FBS og penicillin-streptomycin.

plasmidkonstruktioner og lentivirus produktion

lentivirale shRNA ekspressionsvektor (pLenti6-U6) blev konstrueret som tidligere beskrevet [31]. ShRNA oligonukleotider mod menneskelig PTEN blev udformet i henhold til Ambion retningslinjer (teknisk bulletin # 506) ved hjælp af siRNA-sekvenser gctaagtgaagatgacaatca (# 1), gcacaagaggccctagatttc (# 2), gccagctaaaggtgaagatat (# 3) med ttcaagaga som loop sekvens. Oligonucleotid-udglødet produkter subklonedes i pLenti6-U6 mellem

Bam

HI og

Xho

sites. Et irrelevant pLenti-shGFP (gccacaacgtctatatcatgg) eller en muteret pLenti-shPTEN (shMUT) blev anvendt som negativ kontrol. Det muterede pLenti-shPTEN blev genereret ved at ændre 3 nukleotider i sekvensen for den mest effektive shRNA mod PTEN (# 2) resulterer i siRNA sekvensen gcacaagataacctagatttc. The shRNA mod den murine form af PTEN (TRCN0000028992) og en tilsvarende kontrol shRNA (shTGFP) mod TurboGFP ™ (SHC004) blev opnået fra Sigma-Aldrich. Lentivira fremstillet i 293T-celler blev anvendt til celle-infektion ifølge Invitrogen anbefalinger (ViraPower Lentiviral Expression System). Ingen induktion af

OAS1

genekspression påvistes ved Q-PCR-analyse i forsøg med lentivirus-infektion (data ikke vist).

OAS1

(2050-oligoadenylat syntetase) er en klassisk interferon target-gen og er blevet anbefalet som en vigtig test for interferon induktion før tillægge en bestemt reaktion på genet målrettede [32].

Protein ekstraktion og Western blot-analyse

Protein ekstraktioner og Western blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet [22].

Transmissionselektronmikroskopi

prøver blev behandlet som tidligere beskrevet [22] og observeres på et Hitachi H-7500 transmission electron microscope.

Scanning elektronmikroskopi

Caco-2/15-celler blev podet på små lameller på 12 mm i diameter og fikseret som tidligere beskrevet for transmissionselektronmikroskopi [22] op til dehydrering trin i ethanol. Prøver blev derefter kritisk-punkt tørret med CO

2 og dækket med guld-palladium med en pådampningsbelægningsmaskinen. Coatede celler blev efterfølgende observeret med et JEOL scanningselektronmikroskop (model: JSM-840).

Bestemmelse af transepithelial elektrisk modstand

Caco-2/15-celler blev udpladet på Transwell® permeable membraner ( Corning, Acton, MA). TEER blev målt 3 og 9 dage efter cellerne havde nået sammenløb med et epitel Voltommeter (World Precision Instrument, model EVOM-G).

RNA-analyse

Total RNA isolering, RT-PCR og Q-PCR’er blev udført som tidligere beskrevet [31]. Target-ekspression blev kvantificeret relativt til PDGB ekspression. Primere til hvert gen blev udformet ved exon-exon junctions vha Primer3 software [33]. Primer sekvenser og Q-PCR betingelser er tilgængelige på anmodning.

Migration assays

Analyserne blev udført i overensstemmelse med den skarpe barberblad teknik som tidligere rapporteret [34].

assays af Rac og cdc42 aktiviteter

GTP-bundne niveauer af Rac og cdc42 blev analyseret med en G-LISA aktivering assay biokemi kit (Cytoskeleton, Denver, CO) i overensstemmelse med producentens instruktioner.

Invasion assays

Invasion blev udført ved hjælp af BD BioCoat ™ MatrigelTM Invasion Chambers med 8-um polycarbonated filtre (BD Biosciences). Celler blev podet i medium uden serum i nærvær af 2 mM hydroxyurinstof, en farmakologisk inhibitor af cellulær ribonucleosid reduktase at standse cellecyklussen i G1 /S-fase [35]. Medier indeholdende 20% FBS blev anvendt som kemoattraktant. Efter en inkubation på 48 timer ved 37 ° C blev ikke-invasive celler fjernes ifølge producentens procedure og invaderende celler blev fikseret med methanol 100%. Cellerne blev derefter farvet i krystalviolet 1%.

Dyremodeller

Female nøgne mus CD1

nu /nu

og Fox Chase SCID Beige mus blev indkøbt fra Charles River (Wilmington , MA). Alle eksperimentelle protokoller blev godkendt af den etiske komité for dyreforsøg af Université de Sherbrooke.

Tumorvækst

: I alt 2 × 10

6 celler suspenderet i 100 pi DMEM blev injiceret i den dorsale subkutane væv af 5 uger gamle hunmus CD1

nu /nu

. Mus blev aflivet efter 42 dage efter injektion for Caco-2/15 og 30 dage efter injektion for HCT116. Tumorer blev udskåret og vejet.

Eksperimentelle hale vene analyser:

hale-vene af 5 uger gammel kvinde CD1

nu /nu

mus eller Fox Chase SCID Beige mus blev injiceret med 10

6 Caco-2 /15, HCT116 eller CT26 celler suspenderet i 100 pi DMEM. Dyrene blev aflivet på ethvert tegn på åndedrætsbesvær eller vægttab, eller efter 14 dage efter injektion for CT26, 75 og 35 dage efter injektion for HCT116 injiceres henholdsvis CD1

nu /nu

og Fox Chase SCID Beige mus og 60 dage efter injektion for Caco-2/15-celler injiceret i Fox Chase SCID Beige mus. Lunger blev opretholdt i Bouins fiksativ i 24 timer. Individuelle lapper blev derefter adskilt og det totale antal af overfladeaktive synlige metastaser blev bestemt.

humane tumorer

Prøver af kolon kræft og parrede normale colon væv (mindst 10 cm fra tumor) har indhentet fra patienter, der gennemgår kirurgisk resektion. Patienterne modtog ikke neoadjuverende kemoterapi eller strålebehandling. Væv blev opnået efter patientens skriftligt informeret samtykke, i henhold til den protokol, der er godkendt af Institutional menneskelige Emne Review Board af Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke. Kliniske og patologiske informationer blev opnået fra medicinske journaler. Adenom prøver var endoskopisk inoperabel og defineret som avancerede grund af deres størrelse større end 1 cm eller ved tilstedeværelsen af ​​high-grade dysplasi eller villøs komponent. Patientens kræftformer blev histologisk klassificeret og klassificeres efter overordnede TNM mellemstationer kriterier (baseret på tumor-, lymfe lymfeknude og Metastatic- status). Alle væv blev frosset i flydende nitrogen inden for 15 minutter fra resektion som anbefalet af den canadiske Tumor Repository Network (www.ctrnet.ca). For proteinekstraktion blev parrede væv lyseret i Triton-prøvebuffer (100 mM NaCl, 5 mM EDTA [pH 8,0], 50 mM Tris-HCI [pH 7,5], 1% Triton X-100, 5% glycerol, 1 mM PMSF, 0,2 mM orthovanadat, 40 mM β-glycerophosphat, 50 mM NaF, og 2% protease inhibitor cocktail [P 8340, Sigma-Aldrich]) og immunblottet som beskrevet tidligere [22].

Datapræsentation

Typiske resultater vist er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter. Statistik blev beregnet ved anvendelse Student to halet t-test. Forskelle blev betragtet som signifikante ved * p ≤ 0,05 eller *** p≤0.005. Densitometriske analyser blev udført ved hjælp af billede J software.

Resultater

PTEN styrer colon epitelcelle polarisering og differentiering

For at undersøge virkningen af ​​PTEN tab af udtryk på differentiering og polarisering af kolorektal cancer celler, rekombinante lentivira koder korte hårnål RNA (shRNAs) blev først udviklet for at stabilt undertrykke PTEN mRNA-niveauer i Caco-2/15 celler. Adskillige lentivirale konstruktioner blev testet for deres evne til at knock-down PTEN. Den mest effektive shRNA blev betegnet shPTEN (data ikke vist). Caco-2/15-celler blev herefter inficeret med shPTEN lentivira eller med irrelevante shGFP lentivira eller lentivirus udtrykker et shPTEN med 3 mismatch nucleotider (shMUT) som negative kontroller. Den pLenti6-U6 lentiviral vektor, som coexpresses en blasticidin S-resistent gen, tillod udvælgelse af rene populationer af transducerede celler inden for 7 dage. Som vist i figur 1A, blev PTEN proteinniveauer næsten fuldstændig bankede ned i Caco-2/15 celler, der udtrykker shPTEN ( 90%); denne reduktion blev opretholdt under post-sammenflydning. Af note, PTEN nedregulering var også forbundet med en stigning i AKT phosphorylering, den vigtigste nedstrøms effektor af PI3K, der bekræfter, at PI3K pathway blev aktiveret i shPTEN udtrykkende celler.

Caco-2/15-celler var inficeret med enten rekombinante lentivira koder for en shRNA som specifikt slag-down PTEN (shPTEN) eller negativ kontrol shRNAs (shGFP eller shMUT). A og C. Efter selektion af inficerede celler, Caco-2 /var 15 lyseret ved -2, 0, 3, 6, 9 og 12 dage efter konfluens. Proteiner blev derefter analyseret ved Western-blot. B. Venstre paneler: Nyligt konfluente Caco-2/15 celler, der udtrykker shGFP eller shPTEN blev observeret ved optisk mikroskopi. Scale barer = 100 um. Middle paneler: Nyligt konfluente Caco-2/15 celler, der udtrykker shGFP eller shPTEN blev fikseret og observeret af transmission elektronmikroskopi. Scale barer = 2 um. Højre paneler: Nyligt sammenflydende shGFP eller shPTEN udtrykker-celler blev observeret ved scanning elektronmikroskopi. Scale barer = 1 um.

For at analysere, om PTEN har en indvirkning på Caco-2/15 celle polarisering blev cellemorfologi først undersøgt på forskellige dage i sammenløbet. Som observeret ved optisk mikroskopi, blev celle superficy steget markant med 5,3-fold (p 0,005 analyseret af Metamorph software) i nyligt konfluent Caco-2/15 celler, der udtrykker shPTEN forhold til at styre celler (figur 1B, venstre paneler). Desuden viste transmission elektronmikroskopi analyse, nyligt sammenflydende kontrol celler allerede var begyndt at polarisere hvorimod PTEN-manglende celler stadig opretholdt en flad udseende (figur 1B, midterste paneler). Ved 3 dage efter konfluens celler med reduceret PTEN ekspression begyndte først at polarisere mens kontrolceller allerede havde opnået deres cylindriske form (data ikke vist). Nedregulering af PTEN også resulteret i en nedsat antal mikrovilli på cellen apikale membran som observeret ved scanningselektronmikroskopi (figur 1B, højre paneler). Notatet blev ekspressionsniveauer af de funktionelle differentieringsmarkører sucrase-isomaltase og villin også markant mindre i PTEN-udtømte celler (figur 1C).

Vi dernæst undersøgte hvis PTEN nedregulering ændrer ekspressionen af ​​hepatocyt nukleare faktorer 1a ( HNF1α) og 4 (HNF4α) samt caudale-relaterede homeobox transcription faktor 2 (CDX2), som er kendt at styre intestinal epitelcelledifferentiering [36]. Som vist i figur 1C, mens ekspressionsniveauer af HNF4α beskedent blev reduceret i sammenflydende PTEN-deficiente Caco-2/15-celler, ekspression af HNF1α og CDX2 blev markant reduceret (figur 1C). Taget sammen indikerer disse resultater, at PTEN er vigtig for epitelcelle polarisering samt funktionelle og morfologiske differentiering af intestinale epitelceller. Notatet disse virkninger ikke synes at være en indirekte følge af ændring i celledeling siden Caco-2/15 celler, der udtrykker shPTEN udstillet den samme spredning end kontrol- celler og stoppe så hurtigt at formere da de nåede sammenløb (data ikke vist) .

PTEN nedregulering svækker tight junction integritet i kolon epitelceller

Da intercellulære junctions er regulatorer af cellepolaritet [2], [5], vi næste verificeret, om ekspressionen af ​​shPTEN havde en effekt på celle vejkryds. Under transmissionselektronmikroskopi, adherensovergange optrådte uændret (figur 2A, pile) i PTEN-deficient Caco-2/15-celler, mens tight junctions synes mindre organiseret på 3 dage efter konfluens (figur 2A, parentes). Som en kendsgerning, blev ustruktureret masse af proteiner systematisk observeret uden stramning af membranen på det sædvanlige position tætte sammenføjninger. Derfor blev barrierefunktion tight junctions også kompromitteret som bevidnet af faldet i TEER målt i shPTEN-udtrykkende celler sammenlignet med kontrol celler ved 3 og 9 dage efter Confluence (figur 2B). For at få yderligere indsigt i den måde, hvorpå PTEN styrer krydset integritet, ekspressionsniveauerne af flere vigtige synaptiske proteiner såsom occludin blev ZO-1 og claudins analyseret [2]. Proteinekspression af claudins 1, 3, 4 og 8 blev signifikant reduceret i både subkonfluerende og post-konfluerende shPTEN celler (figur 2C). Notatet blev udtryk for den adherens krydset protein E-cadherin også svækket i post-sammenflydende shPTEN celler (Figur 2C).

A. Caco-2/15 celler, der udtrykker shMUT eller shPTEN blev fikseret efter 3 dage efter konfluens og observeres ved transmissionselektronmikroskopi. Scale barer = 500 nm. Pile viser adherensovergange mens parenteser angiver tætte sammenføjninger. B. Caco-2/15-celler blev dyrket på porøse membraner hvorefter transepitel resistens blev målt i tre eksemplarer 3 og 9 dage efter at cellerne nåede konfluens. *** Signifikant forskellige på p≤0.005 (t-test). C. Caco-2/15 celler, der udtrykker shGFP eller shPTEN blev lyseret ved -2, 0, 3, 6, 9 og 12 dage efter sammenløbet efterfulgt af Western blot-analyse af forbindelsesepitoper proteiner.

Tab af PTEN udtryk i Caco-2/15 celler stimulerer migration /invasion, fremmer tumorvækst men er ikke tilstrækkelig til at give metastatisk potentiale

in vivo

Tab af intercellulære junctions er velkendt for at være forbundet med øget cellemigration og invasion kapacitet [4]. Endvidere PTEN er blevet vist, at kontrollere sådanne processer i andre celletyper [11]. Brug af sår-lukning assays blev migreringen af ​​nyligt konfluent kontrolceller sammenlignet med shPTEN-udtrykkende populationer. Som vist i figur 3A, evne shPTEN-udtrykkende Caco-2/15-celler at migrere blev markant forøget sammenlignet med kontrolceller, som bestemt ved måling af relative areal dækket af migrerende celler. Vi observerede også, at nedregulering af PTEN markant stimuleret Caco-2/15 Cellefrigørelse efter trypsinisering (data ikke vist). Disse data indikerer, at PTEN gentranskriptet nedregulering i CRC celler øger deres evne til at sprede sig og migrere. Da PTEN har vist sig at påvirke migration gennem aktivering af de små GTPaser Rac1 og cdc42 [37], næste analyserede vi, om deres respektive ekspression og aktivitet blev påvirket ved tab af PTEN ekspression. Som vist i figur 3B, både Rac og Cdc42 viste højere GTP-bundne niveauer i subkonfluerende og sammenflydende shPTEN-udtrykkende celler sammenlignet med kontrolceller.

A. Venstre paneler: Cell morfologi blev analyseret ved fasekontrastmikroskopi ved subkonfluens. Højre paneler: Nyligt sammenflydende celler stabilt udtrykker shMUT eller shPTEN blev såret og behandlet med 2 mM hydroxyurea. Efter 48 timer blev bevægelse af det sammenhængende ark tværs af lineære sårmargen (hvid linje) bedømt ved fasekontrastmikroskopi. Grafen til højre viser den relative areal dækket af migrerende celler som vurderet på 5 forskellige sår eksperimenter pr tilstand med Image J software. Scale barer = 100 um. B. Aktiverede niveauer af GTP-bundne Rac eller Cdc42 blev analyseret med G-LISA aktivering assay biokemi kits på subkonfluerende (SC) og nyligt konfluerende (C) Caco-2/15-celler. C. Invasion af celler blev undersøgt ved anvendelse Matrigelcoatede Transwells. Efter 48 timer blev invaderende celler fikseret, farvet med krystalviolet 1% og talt. D. Subkonfluente shMUT og shPTEN-udtrykkende Caco-2/15-celler blev lyseret og totalt RNA isoleret til genekspression analyseret ved Q-PCR’er. Det relative niveau for hvert RNA blev beregnet under anvendelse af standardkurven fremgangsmåde og normaliseret til det tilsvarende PDGB RNA-niveauet. E. 2 × 10

6 prolifererende Caco-2/15 celler, der udtrykker shMUT eller shPTEN blev injiceret subkutant i 5 nøgne mus pr tilstand. Tumorvægt blev bedømt 42 dage efter injektion. * P ≤ 0,05, *** p≤0.005, statistiske forskelle bestemmes ved hjælp af t-test.

Effekten af ​​PTEN mangel på invasion blev også bestemt ved hjælp af BD BioCoat Matrigel invasion kamre. Som vist i figur 3C, Caco-2/15 celler, der udtrykker de shPTEN klart udviste forøgede invasive kapacitet i sammenligning med shMUT-udtrykkende celler. Invasion ikke kun involverer nedbrydning af celle-celle kryds og øget motilitet af tumorceller, men også fokal proteolyse af den ekstracellulære matrix. Som vist i figur 3D, analyser Q-PCR viste, at ekspressionsniveauer af matrixmetalloproteinaser 2 og 9 (MMP2 og MMP9), osteopontin (OPN) og uPA (urokinase-plasminogenaktivator) var signifikant opreguleret i shPTEN-udtrykkende Caco- 2/15 celler.

tumorigenicitet af Caco-2/15 cellepopulationer blev næste vurderet efter subkutan injektion i flanken af ​​nøgne mus. Som vist i figur 3E, nedregulering af PTEN ekspression i Caco-2/15 celler alvorligt forøget deres kapacitet til at inducere tumorer in vivo.

Endelig undersøgte vi, om PTEN reduktion i Caco-2/15-celler er tilstrækkelig til at inducere tumormetastase

in vivo

, gennem brug af eksperimentel metastase halevene assay. Fox Chase SCID Beige mus injiceret med kontrol eller PTEN-deficient Caco-2/15 celler i halevenen undladt at udvikle metastaser, selv ved 60 dage efter injektion (data ikke vist), hvilket indikerer, at PTEN nedregulering ikke er tilstrækkelig til at give en metastatisk potentiale til godt differentierede CRC celler.

Tab af PTEN udtryk stimulerer migration /invasion, øger tumorvækst og inducerer metastatiske potentiale HCT116 celler

in vivo

virkningen af ​​PTEN lyddæmpning blev også vurderet i mikrosatellit-ustabil dedifferentierede HCT116. I disse celler PTEN inaktivering resulterede også i øget phospho-Akt (figur 4A), øget kapacitet i både migration ved sårdannelse (figur 4B) og invasion (figur 4C), ud over at være forbundet med en betydelig stigning i Rac aktivitet (1,5 fold, s 0,005) og OPN ekspression (1,9 gange, s 0,005) (data ikke vist). Notatet blev ekspressionsniveauer af MMP-2, MMP-9 og uPA i kontrol HCT116 celler, der allerede markant forhøjet og PTEN lyddæmpning ikke yderligere at øge mRNA niveauer af disse molekyler (data ikke vist). Den tumorigenicitet af HCT116 cellepopulationer blev også vurderet efter subkutan injektion i flanken af ​​nøgne mus. Som vist i figur 4D, nedregulering af PTEN udtryk i HCT116 celler øget deres evne til at inducere tumorer

in vivo

.

A. HCT116 celler blev inficeret enten med rekombinante lentivira koder shMUT eller shPTEN. Efter selektion af inficerede celler, blev prolifererende celler lyseret og proteinekspression blev analyseret ved Western blot. B. Venstre paneler: Cell morfologi blev analyseret ved fasekontrastmikroskopi ved subkonfluens. Højre paneler: Nyligt Konfluente celler blev såret og behandlet med 2 mM hydroxyurea. Efter 48 timer blev bevægelse af det sammenhængende ark tværs af lineære sårmargen (hvid linje) bedømt ved fasekontrastmikroskopi. Grafen til højre viser den relative areal dækket af migrerende celler som vurderet på 5 forskellige sår eksperimenter pr tilstand med Image J software. Scale barer = 100 um. C. Invasion af celler blev undersøgt ved anvendelse Matrigelcoatede Transwells. Efter 48 timer blev invaderende celler fikseret, farvet med krystalviolet 1% og talt. D. 2 × 10

6 prolifererende HCT116 celler, der udtrykker shMUT eller shPTEN blev injiceret subkutant i 5 nøgne mus pr tilstand. Tumorvægt blev bedømt 30 dage efter injektion. * Signifikant forskellige ved p ≤ 0,05.

Endelig undersøgte vi, om PTEN reduktion i HCT116-celler er tilstrækkeligt til at inducere tumormetastase

in vivo

, gennem brug af halevenen assay. T: tumor.