PLoS ONE: Kvantitativ analyse af effekten af ​​Cancer er invasiv og Collagen Koncentration på 3D Matrix Remodeling

Abstrakt

ekstracellulære matrix (ECM) remodeling er en nøglekomponent i celle migration og tumor metastase, og har været forbundet med cancer progression. Trods betydningen af ​​matrix remodeling, har systematiske og kvantitative undersøgelser af proces i høj grad har manglet. Endvidere er det fortsat uklart, om det sprængte spændeindretningen homøostase karakteristisk for malignitet skyldes først ændret ECM og vævsegenskaber, eller til ændringen af ​​vævet ved tumorceller. At udforske disse spørgsmål, vi studerede matrix remodellering af to forskellige prostatakræft-cellelinier i et tredimensionelt kollagen system. Over en uge, vi overvågede strukturelle ændringer i geler med varierende kollagen indhold ved hjælp af konfokal refleksion mikroskopi og kvantitativ billedanalyse, sporing målinger af fibril fraktion, porestørrelse, og fiber længde og diameter. Geler, der blev podet med nogen celler (kontrol), LNCaP-celler, og DU-145-celler blev kvantitativt sammenlignet. Geler med højere collagenindhold oprindeligt havde mindre porestørrelser og højere fibril fraktioner, som forventet. over tid, LNCaP- og DU-145-befolkede matricer viste imidlertid, forskellige strukturelle egenskaber sammenlignet både til hinanden og til kontrol- geler, med LNCaP-celler synes at begunstige mikromiljøer med lavere collagen fiber fraktioner og større porer end DU-145-celler. Vi postulerer, at DU-145 celler præference for tættere matricer skyldes deres højere invasionsevne og proteolytiske kapaciteter. Hæmning af matrix proteaser resulterede i reducerede fibril fraktioner til høje koncentration geler podet med enten celletype, der understøtter vores hypotese. Vores hidtil ukendte kvantitative resultater sonde dynamikken i gel remodeling i tre dimensioner og foreslå, at prostatacancerceller remodel deres ECM på en synergistisk måde, der er afhængig af både initial- matrixegenskaber samt deres invasionsevne

Henvisning:. Harjanto D , Maffei JS, Zaman MH (2011) Kvantitativ analyse af effekten af ​​Cancer er invasiv og Collagen Koncentration på 3D Matrix Remodeling. PLoS ONE 6 (9): e24891. doi: 10,1371 /journal.pone.0024891

Redaktør: Mário A. Barbosa, Instituto de Engenharia Biomedica, University of Porto, Portugal

Modtaget: April 28, 2011; Accepteret: August 23, 2011; Udgivet: 27 September, 2011

Copyright: © 2011 Harjanto et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne anerkende støtte fra National Institutes of Health (1R01CA132633). DH er støttet af National Science Foundation Graduate Research Fellowship. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

De fleste kræftformer, herunder prostatakræft, kun blive fatalt, når kræftcellerne har spredt sig til fjerne steder [1]. Cancermetastase involverer migrering af celler fra den oprindelige tumor masse gennem basalmembranen og løst bindevæv i blodet eller lymfesystemet. Tumorceller derefter ekstravasatere fra kredsløbssystemet for at finde vej til nye væv. Under metastase, celler interagerer med den ekstracellulære matrix (ECM), et komplekst netværk af glycosaminoglycaner, adhæsionsproteiner, og strukturelle fibre, såsom collagen. Mange egenskaber af ECM, herunder matrix-strukturen [2], mekanik [3], og dimensionalitet [4], er blevet vist at påvirke celle adfærd. Celler in vivo er normalt omgivet på alle sider af ECM, der viser vævsspecifikke mekaniske og strukturelle egenskaber. Derfor er det vigtigt at studere celler i afstemmelige tredimensionale (3D) systemer, som bedre efterligner fysiologiske betingelser end flade, meget stive substrater.

Et kritisk trin under in vivo cellemigrering, invasion og metastase er matrix remodeling. Matrix proteolyse er især vigtigt for celler podet i 3D, da de er mere tilbøjelige til at blive sterisk hindret i at bevæge sig end celler på plane substrater. Følgelig er det blevet vist, at inhiberende matrixmetalloproteaser (MMP’er) reducerer celle hastighed og persistens i 3D matricer, men må ikke signifikant ændrer tumorcelle bevægelse på 2D substrater [5], [6]. MMP-ekspression også ofte stiger i løbet af kræft progression [7], hvilket tyder på, at avancerede tumorceller mere aktivt omforme ECM at lette metastaser. MMP-2 og MMP-9 er blevet identificeret som vigtige MMP’er er involveret i metastatisk prostatacancer [8]. Celler kan også bruge deres actomyosin maskiner til at trække på matrixen at tilpasse fibre [9] – [11]

Mens matrix remodeling er en vigtig proces, har kun få undersøgelser forsøgt at studere den direkte.. Af særlig interesse er at forstå, hvordan remodeling dynamisk ændrer ECM struktur. Et værktøj, der er blevet anvendt til at undersøge ECM struktur er konfokal refleksioner mikroskopi (CRM). CRM indsamler lys, der reflekteres af ECM fibre, der giver mulighed for 3D strukturelle rekonstruktion af matrixen. Mens seneste arbejde viser, at CRM er blind for fibre orienteret i retning af det indfaldende lys, hvilket resulterer i en overvurdering netværk maskestørrelse [12], CRM er stadig et almindeligt brugt teknik, der giver informative data, der kan danne grundlag for sammenlignende undersøgelser. CRM er tidligere blevet anvendt til at undersøge kollagen-strukturen [13] – [16], fibrillogenese [17], og hvordan celler interagerer med ECM [18], [19]. Desværre er mange af de undersøgelser af celle-matrix-interaktioner har været temmelig kvalitativ, og de har endnu ikke give en direkte sammenligning mellem cellens invasivitet, startkoncentration kollagen, og /eller ændringer i strukturen over tid.

i dette papir, vi sigter mod at besvare alle disse spørgsmål kvantitativt. Vi undersøger hvordan matrix strukturelle egenskaber, som kvantificeret ved billedanalyse af CRM-data, ændre sig over tid til at evaluere ECM remodellering af prostatacancerceller i en 3D kollagen gel-system, variere koncentrationen af ​​kollagen for at bestemme virkningen af ​​den oprindelige ECM struktur og mekanik . Den remodeling adfærd for to prostata cancer cellelinjer, LNCaP og DU-145, sammenlignes. LNCaP-celler er en forholdsvis langsomt voksende, androgen-sensitive cellelinie afledt fra en metastatisk læsion til knogle [20]. DU-145-celler er hurtigere voksende, androgen-ufølsom, og afledt af en metastatisk læsion til hjernen [21]. En række undersøgelser har vist, at DU-145-celler er mere aktivt invasiv end LNCaP-celler [22] – [25]. Fra dette arbejde, vi er i stand til at få kvantitativ indsigt i, hvordan to forskellige tumorcellelinjer af varierende invasiv remodel matricen i 3D-miljøer. Vores resultater giver en ny indsigt i dynamikken i celle-matrix interaktioner fra matrixen perspektiv.

Resultater

Geler af varierende kollagen koncentration viser forskellige mekaniske og strukturelle egenskaber

Til opnå en basislinje for sammenligning blev 3D geler af varierende collagen koncentration (2, 3, eller 4 mg /ml), som ikke blev podet med celler (identificeret som “ingen celle” betingelse) undersøgt. Rheometry blev udført for at evaluere den oprindelige stivhed af gelerne. Som forventet forskydningsmodulet steg med kollagen koncentration, der spænder fra -200 til 550 Pa i 2 til 4 mg /ml geler (figur 1A), hvilket gav resultater svarende til dem rapporteret af andre grupper ved anvendelse af en lignende gelering teknik [26].

(

a

) Shear modul som funktion af kollagen koncentration for geler uden celler. Fejl barer: standardafvigelse. CRM billeder til geler uden celler til (

B

) 2 mg /ml; (

C

) 3 mg /ml; og (

D

) 4 mg /ml. (

E

) CFM og CRM overlejring af DU-145-celler (grøn) i 3 mg /ml kollagen (hvid) 5 dage efter såning. Scale bar for CRM billeder: 30 pm

For strukturel analyse blev CRM billedstakke erhvervet for de varierende kollagengeler 1, 3, 5 og 7 dage efter såning.. Repræsentative CRM billeder af de tre typer geler er vist i figur 1B-D. I denne undersøgelse de strukturelle parametre af interesse er den del af området collagenfibre besætte (benævnt “fibril fraktion”), porestørrelse, og fiber diameter og længde. Disse parametre blev valgt som sporbare, fysiologisk relevante målinger af matrix remodeling. Kvalitativt er det indlysende, at højere koncentration kollagen resulterer i geler, der er mere tæt befolkede med fibre, hvilket resulterer i mindre porestørrelser. Kvantitativ billedanalyse bekræfter disse observationer, som højere fibril fraktion (figur 2A) og mindre porestørrelse (figur 2B) er set med højere koncentrationer kollagen. Samlet set er der ingen signifikant ændring over tid for fibrilens tæthed og porestørrelse (figur S1) for geler af hver specifik kollagen koncentration, som det kunne forventes i fravær af matrix remodeling.

(

A

) fibril fraktion; og (

B

) porestørrelse, en uge efter såning. For celle-seedede geler, er data fra cellulære områder præsenteres.

LNCaP celler og DU-145 celler remodel matricen i forskellige manerer afhængig af den initiale koncentration kollagen

Gels af varierende collagen koncentration (2, 3, 4 mg /ml) blev derefter podet med fluorescens-farvet prostatacancerceller. At visualisere de farvede celler blev konfokal fluorescensmikroskopi (CFM) udføres sammen med CRM. Et repræsentativt billede er vist i figur 1E, der viser, at kræftcellerne er klart at klæbe til et 3D netværk af collagenfibre.

Som med kontrolplanterne geler blev celle-podede geler afbildet 1, 3, 5, og 7 dage efter plating at give indsigt i dynamikken i matrix remodeling. For at forstå det omfang matrix remodeling forekommer globalt versus umiddelbart lokale til celler, områder af gelen, der på et givet tidspunkt indeholdt celler (identificeret som “cellulære regioner”) samt regioner, som ikke blev besat af celler (identificeret som “acellulær regioner “) blev afbildet. Forskellige regioner blev udtaget mellem tidspunkter, så det ikke kan konkluderes, at en given region var (eller ikke var) optages af celler i løbet af forsøget som celler er bevægelige. Ikke desto mindre er det interessant at se, at mens kontrol geler viser forskellige strukturelle egenskaber sammenlignet med de podede geler, er der ingen signifikant forskel i fibril fraktion og porestørrelse fra acellulære og cellulære områder i geler podet med LNCaP-celler i 2 mg /ml collagen koncentration over tid (figur 3). Dette er tilfældet for begge cellelinier og for alle gel-koncentrationer på et givet tidspunkt (data ikke vist). Disse resultater antyder, at matrix remodeling sker på globalt plan, især når matrixen podes med en relativt høj tæthed af celler, som det er tilfældet her

(

A

) fibril fraktion.; og (

B

) porestørrelse, over tid. Cellulære regioner af podede geler indeholder celler; acellulære regioner ikke.

Når LNCaP-celler og DU-145-celler podes i collagen, er der en klar ændring i fibril fraktion og porestørrelse sammenlignet med den ingen celle tilstand (figur 2). En uge efter podning sammenlignet med kontrol geler, begge cellelinier viser højere kollagenfibril indhold i 2 mg /ml geler og mindre porer. (Sammenlignende data for ændringen i matrixegenskaber for podet geler over tid kan ses i figur S2.) DU-145-celler synes at deponere betydeligt mere kollagen end LNCaP-celler i 2 mg /ml geler. I højere kollagen koncentration geler, opførslen af ​​de to cellelinier afviger mere. Sammenlignet med kontrol geler har de DU-145 celler ikke at væsentligt ændre deres miljø, mens LNCaP-seedede 3 mg /ml og 4 mg /ml geler viser signifikant lavere fibril fraktioner og tilsvarende større porer. Profilerne fiber længde og diameter for begge cellelinier er meget sammenlignelig med, hvad der observeres i ingen celle tilstand (figur 4). Det skal dog bemærkes, at i de 2 mg /ml geler, blev observeret større forskel i disse fibre egenskaber end ved højere kollagen tætheder, med LNCaP-udsåede geler viser lidt smallere, kortere fibriller. LNCaP celler synes at favorisere miljøer med ca. -20% kollagen belægning, mens DU-145 celler favorisere tættere mikromiljøer med en fibril belægning på ~25-30%, da de fibril fraktioner for alle tre kollagen testede koncentrationer synes at konvergere til omkring disse værdier over forløbet af eksperimenter

Fiber diametre for (

A

) 2 mg /ml.; (

C

) 3 mg /ml; og (

E

) 4 mg /ml. Fiber længder til (

B

) 2 mg /ml; (

D

) 3 mg /ml; og (

F

) 4 mg /ml. Y-aksen angiver den decimalbrøk af fibre med en given diameter eller længde, som det er tilfældet i de andre fiber profil grafer (se også figur S1c-F).

LNCaP celler og du- 145-celler demonstrere forskellige niveauer af proteolytisk aktivitet, og inhibering af denne aktivitet ændrer matrix remodeling opførsel observeret

for direkte at vurdere den proteolytiske aktivitet og invasivitet af de to forskellige cellelinier mere direkte, gelzymografi udførtes. Som forventet fra tidligere undersøgelser [22] – [25], DU-145-celler synes at være langt mere invasiv, viser højere niveauer af proteolyse af aktiv MMP-2 og aktiv MMP-9 end LNCaP-celler (figur 5). Den øgede invasionsevne af DU-145 celler kan redegøre for deres tolerance over for mere tæt fibrøst kollagen mikromiljøer

(

A

) Gelatine zymogram.; og (

B

) kvantificerede data, med pixel af området med proteolytisk aktivitet på gelen normaliseret af cellen densitet anvendt i eksperimentet. Fejl søjler repræsenterer standard fejl.

For at teste denne hypotese, et bredspektret MMP-inhibitor, Marimastat, som blokerer aktiviteten af ​​MMP-1, 2, 3, 7, 9 og 12 [27 ], blev anvendt til behandling celler podet i kollagengeler af varierende koncentration. Når MMP-aktivitet blev inhiberet i begge cellelinjer blev fibril fraktioner af 4 mg /ml geler meget reduceret fra det, der blev set i gelerne podet med ubehandlede celler (figur 6), selv falder under det, der blev set i kontrolgrupperne geler. Dette resultat understøtter vores hypotese, at øget MMP aktivitet kan give mulighed for celler til at fortsætte med at vokse og trives i stærkt fiberholdige mikromiljøer. I mangel af en sådan aktivitet, celler remodel matricen for bedre at imødekomme deres modificerede behov.

fibril fraktioner fra cellulære regioner af geler målt 3 dage efter såning for geler podet med (

A

) LNCaP celler; og (

B

) DU-145 celler.

Diskussion

Matrix remodeling er et vigtigt skridt i celle migration, invasion og metastase. En kvantitativ forståelse af, hvordan tumorceller på forskellige stadier af sygdomsprogression ændre deres mikromiljøer er kritisk for en omfattende forståelse af sygdomsudvikling og terapeutisk intervention. Her har vi undersøgt, hvordan matrix struktur udvikler sig over tid ved hjælp af kvantitativ CRM, studere 3D collagen matricer af varierende koncentration tilsået med to prostata cancer cellelinjer af varierende invasiv.

Vi fandt, at kollagen geler uden celler viste en højere forskydningsmodul og udviste mindre porestørrelse og højere fibril fraktion med stigende kollagenkoncentration som forventet. Den fibril fraktion og porestørrelse disse kontrol geler ikke ændre sig væsentligt med tiden. Vi var også i stand til at bevise, at LNCaP celler og DU-145 celler er aktivt remodeling deres omgivelser. Efter en uge, begge celletyper øget fibrilens fraktion og reducerede porestørrelse 2 mg /ml geler sammenlignet med kontrollen. I mellemtiden, i 4 mg /ml geler, celler modificeret matrixerne til reduktion fibril fraktion og øge porestørrelse. De strukturelle ændringer, der observeres var påviselige over en tidshorisont på flere dage og blev fundet at forekomme relativt ensartet gennem matricerne, da der ikke var nogen forskel mellem acellulær og cellulære regioner LNCaP- eller DU-145-seedede geler.

det blev også vist, at LNCaP-celler og DU-145-celler remodel matrixen i forskellige måder, hvilket indebærer, at forskellige celletyper begunstiger forskellige mikromiljøer og vil omforme dem i overensstemmelse hermed for at matche deres behov. I gennemsnit LNCaP-celler syntes at favorisere lavere kollagen indhold og højere porestørrelser end DU-145-celler. 2 mg /ml kollagen geler podet med LNCaP-celler vise kortere, smallere fibre i gennemsnit end deres kontrol og DU-145 modstykker. Ved højere koncentrationer, fiber profiler for hver kollagen koncentration for de tre betingelser (kontrol, LNCaP, og DU-145) var mindre skelnes, hvilket antyder, at det er organisering af matrixen snarere end strukturen af ​​individuelle kollagenfibriller sig, er forskellige mellem de forskellige gel betingelser.

opreguleret matrix remodeling er et centralt element i tumorer. Remodeling omfatter deponering af nye ECM, nedbrydning af eksisterende matrix komponenter, og fiber tilpasning. Deposition af nye ECM kan ikke forventes i tumor mikromiljøer som man kunne antage, at celler i 3D-matricer ville foretrække at beskæftige sig med færre steriske hindringer for invasion. Men mellemliggende snarere end meget lave ECM ligandkoncentrationer er blevet vist, at være optimal for celle bevægelse på grund af behovet for at afbalancere trækkraft og adhæsionskræfter [28]. Histologiske undersøgelser har vist, at maligne væv viser også øget kollagen deposition [29]. For nylig er det blevet påvist, at invasive cancercellelinier, herunder LNCaP-celler, producerer et type I collagen, der er resistent over for MMP-nedbrydning og letter proliferation og migration [30]. I de 2 mg /ml kollagengeler især da kan ECM deposition være vigtig for celleadhæsion og bevægelse, der forklarer det forøgede indhold kollagen observeret i nærvær af celler.

Omvendt, når kræftceller støder tætte net af ECM såsom basalmembranen, øget matrix proteolyse og fiber alignment bliver kritisk for cellebevægelse. Prostatakræft biopsier udviser højere MMP niveauer end normale væv [29]. Det er muligt, at DU-145-celler ikke remodel de relativt tætte 3 og 4 mg /ml collagen matrixer til så høj grad som de LNCaP-celler siden DU-145-celler er mere invasive [22] – [24] og udtrykker højere niveauer af MMP, herunder MT1-MMP [23], og er derfor bedre i stand til at bevæge sig gennem sådanne tætte miljøer. LNCaP celler nødt til at organisere matricen ved selektiv nedbrydning eller tilpasse fibre ved hjælp af deres actomyosin maskiner for at opnå større porestørrelser. Da kollagen kan ud over at være en hindring for migration, lette invasion og spredning [30], DU-145, som de mere invasive cellelinje, er bedre egnet til en tungere fiberholdigt gel.

Når MMP’er var inhiberet i begge cellelinjer, finder vi, at cellernes præference for tættere matricer samtidigt blev reduceret, da de fibril fraktioner i 4 mg /ml geler podet med Marimastat-behandlede celler var meget lavere end i geler podet med ubehandlede celler. Faldet var især dramatisk for geler podet med DU-145 celler, jo mere invasive cellelinje. Dette antyder, at aktive MMP’er er en vigtig aktør i at bestemme, hvor cellerne remodel matricen, og at øget MMP aktivitet kan ikke føre blot at reduceret indhold ECM som man kunne forvente. Vores data indikerer snarere, at MMP’er kan faktisk resultere i flere fibrøse mikromiljøer. Dette tyder på, at MMP’er kan påvirke matrix remodeling via alternative veje udover bare at nedbryde matrixen. Faktisk har MMP’er blevet impliceret i gelkontraktion [31], med MMP-inhibering resulterer i en reduktion af kollagengel kontraktion [32]. Desuden har det vist sig, at MMP hæmning resulterer i nedsat kollagen syntese [33], [34], hvilket også kan forklare den samlede reduktion i fibril fraktioner set i vores marimastat behandling eksperimenter.

præference den ubehandlede DU-145-celler for mere kollagen-rige miljøer er også i overensstemmelse med den observation, at væv stivne under cancer progression [35], [36]. I denne undersøgelse viste vi, at kollagen-indhold korrelerer godt med forskydningsmodul. Vi har derfor konstatere, at DU-145-modificerede miljøer, som viste højere gennemsnitlige fibril fraktioner, er stivere i gennemsnit end LNCaP-modificerede matricer. Men det er uklart, om den øgede stivhed er en årsag til udvikling af kræft eller er i stedet en effekt af kræft progression. Vores data her peger i retning af sidstnævnte. Dette arbejde understøtter den fremherskende teori om afbrydelse af spændeindretningen homeostase som en vigtig egenskab ved den maligne fænotype [35], [37]. Det skal bemærkes, selvom der i vores undersøgelse, sammenlignede vi remodeling virkninger af kun to forskellige cellelinier. Langt mere arbejde at sammenligne remodeling virkninger af et bredt spektrum af kræft cellelinjer er nødvendig for at kunne foretage den almindelige oversigt, der mere højt invasive kræftformer foretrækker højere mikromiljøer tæthed. Det ville også være interessant at se, om og hvordan ikke-kræft celler (dvs. stamceller eller fibroblaster til vævsdyrkningsapplikationer) demonstrere forskellige remodeling aktivitet.

Samlet set vores resultater tilvejebringe en ny kvantitativ billede af matrix remodeling evolution og dynamik og giver en direkte sammenligning af matrix remodeling for to særskilte prostata cancer cellelinjer. Vi håber, at vores resultater vil føre til nye linjer af undersøgelse på dynamikken i matrix remodeling og fremtidige eksperimenter vil fortsætte med at sammenligne både hvordan de strukturelle og mekaniske egenskaber af celle-seedede kollagengeler udvikler sig med tiden ved hjælp af kræft og ikke-kræft celletyper. En sådan undersøgelse vil give yderligere og desperat behov for oplysninger om forståelse, styring og bekæmpelse af metastaser.

Materialer og Metoder

Cell kultur

To prostata cancer cellelinjer, LNCaP og DU-145 (begge fra ATCC, Manassas, VA), blev undersøgt. LNCaP-celler blev dyrket i RPMI-1640-medier og DU-145-celler blev dyrket i F12K medie. Begge typer af medier blev suppleret med 10% vol /vol føtalt bovint serum (FBS) og 1% v /v penicillin-streptomycin (10.000 IE /ml penicillin, 10.000 pg /ml streptomycin) (alle cellekulturreagenser fra ATCC). Cellerne blev holdt ved 37 ° C, 5% CO

2 i en inkubator. Celler blev farvet med 5 um CellTracker ™ Orange CMRA (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens anvisninger for celler i suspension før kollagen podning. Når podet i kollagen blev celler opretholdt i antibiotiske-frie medier suppleret med 10% FBS.

Fremstilling af kollagengeler

Celler blev suspenderet i 3D type I collagen (BD Biosciences, San Jose, CA) i en endelig densitet på 200.000 celler /ml. For geler med celler, kollagenmatrixen opløsning bestod af LNCaP eller DU-145-celler suspenderet i et passende medie, suppleret med 10% v /v FBS, og et lige volumen af ​​kollagen og neutraliserende opløsning (100 mM HEPES-buffer (Fisher Scientific, Pittsburgh , PA) i 2 × phosphatbufret saltvand (PBS), pH 7,3), som tidligere beskrevet [38]. Geler uden nogen celler blev fremstillet på samme måde, bortset fra at volumen cellesuspensionen blev erstattet med mediet. Endelig collagen-koncentration blev varieret fra 2, 3, og 4 mg /ml. Det totale volumen af ​​hver gel-opløsning var 1 ml. Matricen opløsning fik lov til at gelere i en 35 mm glas-bottom skålen (Mattek, Ashland, MA) ved 37 ° C og 5% CO

2 i en inkubator i 2 timer før 2 ml 10% v /v FBS -supplemented medium blev tilsat. Medier blev udskiftet hver anden til tredje dag. Geler blev fremstillet i tre eksemplarer for hver tilstand.

Rheometry

De mekaniske egenskaber af geler med varierende kollagen indhold (2, 3, 4 mg /ml) blev vurderet ved anvendelse rheometri. Kort fortalt blev kollagen opløsninger uden celler (sammensætning som tidligere beskrevet) geleret direkte på rheometer (TA Instruments AR2000 Rheometer) ved 37 ° C i 30 minutter. Umiddelbart efter gelering blev målinger taget med et kegleformet geometri, oscillerende 0,1-10 Hz ved et moment på 0,1 μN * m. Tre prøver for hver betingelse blev målt. En magt lov fit blev anvendt på de data for at opnå en værdi for størstedelen opbevaring og elasticitetsmodul ved 10 Hz.

Konfokal mikroskopi

For at vurdere mikrostrukturen af ​​geler, blev CRM udført med et konfokalt (Olympus FV1000) med en 60 × 1.2 NA nedsænkning i vand linse. Kollagen forgyldt med glas-bottom retter var begejstrede med en lav intensitet 488 nm laser og lys mellem 485-495 nm lys blev indsamlet. Billeder blev erhvervet mindst 100 um ind i gelen for at undgå kantvirkninger. For kontrol- geler, der ikke var podet med celler, tre 30 um stakke med 0,5 um-tykke skiver blev opnået fra tilfældigt udvalgte regioner i gelen 1, 3, 5, og 7 dage efter udpladning. På hvert tidspunkt for hver gel, der blev podet med celler, blev tre stakke taget i regioner, der indeholder celler og tre stakke blev taget i regioner, som ikke indeholdt celler (dvs. havde ingen celler inden for 10 um over, under, eller lateralt). Regioner med og uden celler blev identificeret ved at udføre konfokal fluorescensmikroskopi (CFM) samtidig med CRM. For CFM blev en 543 nm laser, der anvendes med indstillingerne for excitation /emission spektre af Alexa Fluor 546. I cellulære regioner blev en CFM billede af cellerne opnået sideløbende med CRM billede af kollagen strukturen. De samme mikroskop indstillinger blev brugt til hver erhvervelse for at sikre, at resultaterne var sammenlignelige.

Billedanalyse

Raw CRM-data blev analyseret for at opnå kollagen strukturelle parametre. De samme behandlingsindstillinger blev anvendt fra billede til billede at sikre ensartethed. Fibril fraktion og porestørrelse blev opnået med ImageJ (NIH, Bethesda, MD). Kort fortalt blev 2D-billeder fra hver stabel binariseres, med collagenfibre angivet med sorte pixler. De binariserede billeder blev derefter anvendt til at beregne den del besat af kollagen, i lighed med hvad der tidligere er rapporteret [39]. Porestørrelse blev målt ved at trække tre linjer (vandrette, lodrette og diagonale, undgå celler, når de var til stede) på tværs af binariseret billede i midten af ​​hver stabel, og under anvendelse af plottet profil funktion i ImageJ. Et script blev skrevet i Matlab (MathWorks, Natick, MA) til at beregne afstanden mellem kollagen fibre fra dette profildata. Dette igen svarer til hvad er blevet opfyldt før [40].

Fiber diameter og længde blev bestemt under anvendelse Imaris (Bitplane, St. Paul, MN). En ru overflade maske blev oprindeligt fremstillet fra rå CRM data, hvorfra en glat overflade blev genereret. De objekter, der er oprettet med det resulterende glatte overflade hver repræsenterede et kollagen fibril og statistik på radius og halv længde af hver fibril var output.

Kvantitative gelatinezymografi

gelatinezymografi blev anvendt til at sammenligne MMP-aktivitet mellem cellelinier. Både LNCaP og DU-145-celler blev udpladet og dyrket til nær konfluens før inkubation med serumfrie medier i 24 timer. Medier blev ekstraheret fra kulturer, og koncentreret via ultracentrifugering i 30 minutter (10 kDa afskæring). Prøver blev derefter blandet med Laemmli loading buffer uden reduktionsmiddel og underkastes gelatinezymografi som tidligere beskrevet [41]. Kort beskrevet blev prøverne anbragt i en polyacrylamidgel co-polymeriseret med 0,1% gelatine og underkastet elektroforese. Geler blev derefter overført til en vandig opløsning indeholdende 2,5% Triton-X100 renaturere proteinerne, efterfulgt af ækvilibrering i et udviklende buffer (50 mM Tris, pH 7,8, 200 mM NaCI, 5 mM CaCI

2, 0,02% Brij- 35) og efterfølgende inkubering ved 37 ° C i 20 timer. Geler blev endelig farves og affarvet med Coomassie blue. Efter affarvning blev gelerne tørret natten over under anvendelse af en gel tørring kit (Promega, Madison, WI). Områder med proteolytisk aktivitet udtrykkes som klare bånd mod en farvet baggrund. Gel billeder blev behandlet med ImageJ og tærsklingsbehandles at erhverve passende pixelværdier for både MMP-2 og MMP-9 fulgte med normalisering af originale celle koncentrationer. Eksperimentet blev udført tre gange.

MMP inhiberingsundersøgelser

Celler blev podet i geler med varierende kollagen indhold (2, 3, og 4 mg /ml) i 12 brønds-glas-bottom plader ( Mattek). Den samlede mængde af hver af disse mindre geler var 0,5 ml. Hver gel blev behandlet med 50 pM Marimastat (Tocris, Ellisville, MO) i 1 ml 10% FBS-suppleret medium 2 timer efter initial gelering og anbringelse i inkubatoren. Derefter blev mediet erstattet med 100 pM Marimastat i 10% FBS-suppleret medium hver 24 timer. Geler blev fremstillet in triplo. CFM og CRM blev udført 1 og 3 dage efter podning. Billedbehandling blev udført som beskrevet tidligere.

Statistisk analyse

Da ingen af ​​de CRM strukturelle data fulgte normalfordelinger vurderet ved qq parceller, blev 95% konfidensintervaller konstrueret ved hjælp af bootstrapping fra mindst 5000 simuleringer. Den skævhed-rettet, accelereret algoritme blev brugt. Analyse blev udført med Matlab. Fejl barer på alle grafer er 95% konfidensintervaller, medmindre andet er angivet.

Støtte Information

Figur S1.

Strukturelle parametre for geler uden celler. (

A

) fibril fraktion og (

B

) porestørrelse over tid for alle tre gel-koncentrationer. (

C

) Fiber diametre og (

D

) fiber længder til 2 mg /ml collagen over tid. (

E

) Fiber diametre og (

F

) fiber længder på dag 7 for alle gel-koncentrationer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0024891.s001

(TIF )

Figur S2.

Strukturelle parametre for de cellulære områder i DU-145 celler og LNCaP celler sammenlignet med ingen celle tilstand over tid. Fibril fraktion for (

A

) 2 mg /ml; (

C

) 3 mg /ml; og (

E

) 4 mg /ml. Pore ​​størrelse for (

B

) 2 mg /ml; (

D

) 3 mg /ml; og (

F

) 4 mg /ml

Doi:. 10.1371 /journal.pone.0024891.s002

(TIF)

Tak

Forfatterne vil gerne anerkende bistand fra Phil Allen, PhD, til mikroskopi ekspertise, og Kaethe Beck, med udviklingen af ​​Imaris billedbehandling rutine. Vi er også taknemmelige for medlemmer af vores laboratorium for indsigtsfulde kommentarer og forslag i hele denne undersøgelse.