PLoS ONE: Receptor Aktiveret Ca2 + Frigivelse hæmmes af borsyre i prostatakræft Cells

Abstrakt

Baggrund

Den globale ulighed i forekomsten af ​​kræft er fortsat et stort problem for folkesundheden. Vi fokuserede på prostatacancer eftersom mikroskopisk sygdom hos mænd er fælles, men forekomsten af ​​klinisk sygdom varierer mere end 100 fold verdensplan. Ca

2+ signalering er en central regulator af celledeling, men har fået lidt opmærksomhed i forebyggelse af kræft. Vi og andre har rapporteret en stærk dosisafhængig reduktion i forekomsten af ​​prostata- og lungekræft i populationer udsættes for bor (B) i drikkevand og fødevarer; og i tumor og celledeling i dyre- og cellekultur modeller.

Metoder /vigtigste resultater

Vi undersøgte virkningen af ​​B på Ca

2 + butikker ved hjælp kræft og ikke-kræft menneske prostata cellelinier, Ca

2 + indikatorer Rhod-2 AM og Indo-1 AM og konfokal mikroskopi. I DU-145-celler, inhibering af Ca

2+ frigivelse var tydelig efter behandling med Ringers indeholdende Ryr agonister cADPR, 4CmC eller koffein og respektive niveauer af BA (50 uM), (1, 10 uM) eller (10, 20 , 50.150 pM). Mindre aggressive LNCaP cancerceller kræves 20 uM BA og den ikke-tumor-cellelinie PWR1E krævede 150 uM BA signifikant at hæmme koffein stimuleret Ca

2+ frigivelse. BA (10 uM) og RyR antagonisten dantroline (10 uM) var ækvivalente i deres evne til at inhibere ER Ca

2+ tab. Flowcytometri og konfokal mikroskopi analyse viste eksponering af DU-145 celler til 50 uM BA i 1 time faldt gemt [Ca

2 +] med 32%.

Konklusion /Betydning

Vi show B forårsager en dosisafhængig fald i Ca

2+ frigivelse fra ryanodine receptor følsomme butikker. Dette skete ved BA-koncentrationer til stede i blodet hos geografisk spredte befolkninger. Vores resultater tyder på højere BA blodet nedsætte risikoen for prostatakræft ved at reducere intracellulær Ca

2 + signaler og opbevaring

Henvisning:. Henderson K, Stella SL Jr, Kobylewski S, Eckhert CD (2009) receptor Aktiveret Ca

2+ Frigivelse hæmmes af borsyre i prostatacancerceller. PLoS ONE 4 (6): e6009. doi: 10,1371 /journal.pone.0006009

Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: November 17, 2008; Accepteret: 20 maj 2009; Udgivet: 23 juni 2009

Copyright: © 2009 Henderson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet for dette tilskud blev finansieret af personlige midler (CE) og delvist af University of California giftige stoffer Forskning og Training Program (TSR TP) for delvis støtte af KH og SK. CE er ph.d. mentor for KH og SK. TSR TP finansiering var for studerende stipendier begrænset til studerende støtte og havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke. eksisterer konkurrerende interesser.

Introduktion

En af de måder celler responderer på miljømæssige stimuli er ved at åbne kanaler mellem lokaliteter af lagrede calcium, såsom det endoplasmatiske reticulum (eR), Golgi og mitokondrier ( MT), som indeholder store frie Ca

2 + koncentrationer (500 uM), og cytoplasmaet, som indeholder lave frit Ca

2 + koncentrationer (100 nM) [1]. En hurtig stigning i cytoplasmatisk Ca

2+ kan opnås ved kapacitiv calcium post (CCE), der involverer frigivelse af lagret Ca

2+ ved ryanodine receptor (RyR) og IP

3 receptor (IP

3R) i cytoplasmaet, efterfulgt af en tilstrømning af ekstracellulær Ca

2+. CCE aktiverer Ca

2+ bindende proteiner, som regulerer talrige cellefunktioner herunder gentranskription, celleproliferation, vesikel sekretion, og apoptose [2], [3]. Cytoplasmatisk Ca

2 + koncentrationer returneres til normal som Ca

2+ fjernes ved transportører såsom Na

2 + – Ca

2+ veksleren i plasmamembranen, det sarkoplasmiske endoplasmatiske ATPase ( SERCA) i ER-membranen, Ca

2+ uniporter i mitokondrier, og ved at binde til højaffinitetsbinding proteiner [4], [5]. I denne rapport præsenterer vi beviser for, at fysiologiske niveauer af borsyre (BA) hæmmer gemt Ca

2+ frigivelse fra RyR agonist følsomme steder.

Bor (B) er den 9

th mest rigelige element i havvand (425 uM B) og indtil for nylig afvist som biologisk irrelevant [6]. B er bundet til oxygen i naturen og i fysiologiske væsker 98,4% findes i form af B (OH)

3 borsyre og 1,6% som B (OH)

4

– borat. Biologi har anvendt dette element i strukturen af ​​adskillige molekyler, herunder: antibiotika i svampe [7]; quorum sensing auto inducer 2 i bakterier [8]; og rhamnogalacturonan-II-dimer i planter [9]. I planter, er B kræves til celleforlængelse, blomstring og dannelse frø og er en integreret del af fødevareafgrøder. Uladet BA krydser plasmamembran root epidermale celler i cytosolen ved passiv diffusion og dette lettes ved NIP5; 1 transportører [10]. BA er delvist omdannet til borat i cytosolen (pKa 9,6) og transporteres ind i veddet hjælp udførsel transportør BOR1 [11], [12]. En human homolog af BOR1 navngivne NaBC1has blevet rapporteret at være til stede i mammale cellelinier og øge celleproliferation ved lave BA koncentrationer [13], men dette er endnu ikke bekræftet af et andet laboratorium. Effekten af ​​BA på vækst og celleproliferation i ørred, zebrafisk og den mammale HEK og HeLa-celler følger et omvendt U-form med højere koncentrationer forårsager cellevækstinhiberingen [13] – [15]. Koncentrationer på 60 til 100 um BA inhiberer celleproliferation i prostatacancerceller, hvorimod høje koncentrationer af 500 til 1000 uM BA kræves for at inhibere proliferation af ikke-tumor prostata epitelceller over samme tidsramme [16].

Humane blodets indhold af BA afspejler den lokale geologi, vandkvalitet, og planter i kosten med et verdensomspændende området fra 2 til 120 uM (21-1232 ng B /g våd blod) i fri levende raske mænd og kvinder [17 ], [18]. Adskillige humane studier har observeret et fald i risikoen for prostata- og lungekræft, og unormal cervikal cytopatologi i forhold til mængden af ​​B indtages fra mad og vand [19] – [22]. En undersøgelse har ikke observere en beskyttende effekt, men adskilte sig fra andre undersøgelser i at bruge en anden B mad database og skønnet indhold af nogle fødevarer B [23], [24].

Den biologiske plausibilitet for kemoforebyggende effekt af BA er støttet af flere linjer af undersøgelsen. Hos immunkompromitterede mus, BA tilskud reducerede væksten af ​​transplanterede humane prostatatumorer, nedsat IGF-1 vævskoncentrationer, og sænkede serum prostataspecifikt antigen niveauer [25]. I cellekultur, BA reducerede proliferation af humane cancer prostata cellelinier på en dosisafhængig måde og inhiberede celle migration og invasion [16], [26], [27]. Vi opdagede forholdet mellem BA evne til at inhibere prostatacancer celleproliferation og calcium signalering efter massespektrometri undersøgelser viste affiniteten af ​​BA for NAD

+ blev reduceret ved phosphorylering og derfor potentielt underlagt biologisk regulering [28], [29]. BA viste sig også at være en ikke-kompetitiv inhibitor af ADP-ribosyl cyclase [30]. Dette førte os til at studere dens indvirkning på NAD

+ /cADPR Ca

2+ frigivelse vej. Vi viste, at farmakologiske niveauer af BA (250 og 1000 uM), men ikke methylboronic syre, faldt NAD

+ stimuleret frigivelse af Ca

2+ uden at påvirke calciumfrigivelse, når den anvendes alene [27]. Det var ikke klart af disse undersøgelser, hvis BA var hæmmende Ca

2+ frigivelse ved at forstyrre NAD

+ konvertering til cADPR, blokering frigivelse af Ca

2 + butikker, eller forstyrre CCE. Det rejste også den mulighed, at BA koncentrationer i normalt blod område kan være i stand til at hæmme Ca

2+ frigivelse fra ryanodine receptor (RyR) følsomme butikker. Her demonstrerer vi, at fysiologiske niveauer af BA hæmmer Ca

2+ frigivelse fra Ryr responsive butikker i humane prostata epitelceller og lavere luminale Ca

2 + niveauer.

Metoder

Cell kulturer

Eksperimenter anvendte prostatacancercellelinjer DU-145 og LNCaP, og den ikke-tumorcellelinie PWR1E. Celler blev dyrket og opretholdt i cellekultur-plader ved 37 ° C i 95% luft og 5% CO

2 befugtet inkubator. For konfokale eksperimenter blev celler dyrket på glas dækglas i 24 timer før udførelse analyser og studerede på en sammenflydning på mindre end 80%. DU-145 og PWR1E celler blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og LNCaP var en gave fra Dr. Allen Pantuck af Institut of Urology, Geffen School of Medicine ved University of California, Los Angeles. RPMI celledyrkningsmedier blev tilsat 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml), og L-glutamin (200 mM). PWR1E ikke-tumorceller blev holdt i Keratinocytkulturer medium indeholdende streptomycin (100 ug /ml), L-glutamin (200 mM), 2,5 ug humant rekombinant EGF, og 25 mg ekstrakt fra bovin hypofyse (Gibco, Carlsbad, CA). Bor depleteret medier blev fremstillet under anvendelse af bor specifikke ionbytterharpiks Amberlite IRE-743 (Sigma) som tidligere beskrevet [16] og modificeret som følger. Ni gram autoklaveret IRA-743-ionbytterharpiks blev tilsat til 500 ml medier og blandet på en Orbit rotator ved 75 til 100 opm i 15 til 20 timer ved 9 ° C.

Måling af Ca

2 + Transienter

Opbevaring Ca

2 + ændringer blev overvåget ved hjælp af calcium sensitive farvestof Rhod-2, AM ester (Biotium, Hayward, CA), som akkumuleres i organeller. Rhod-2, AM ester har en Kd på 1 mM og har vist sig at inddeler, især i mitokondrierne, men som vi viser, i andre organeller samt (fig. 1). Vi anvendte også ER Tracker grøn og Mito Tracker grøn (Molecular Probes, Carlsbad, CA), sammenholdt med Rhod-2, Am ester. De er meget specifikke fluorescerende etiketter til det endoplasmatiske reticulum og mitokondrierne, hhv. Vi analyserede Ca

2 + ændringer i respons på BA og forskellige agonister ved at vælge områder af interesse i celler, der overlappede den røde Rhod-2 Ca

2+ etiket med den grønne ER tracker (fig. 1A) [31] – [33]. Rhod-2, AM ester blev fremstillet som en 1 mM stamopløsning i DMSO og fortyndet i enten komplet RPMI medier eller komplette Keratinocytkulturer medier til 3 uM. Celler blev inkuberet med Rhod-02:00 ester (5 uM) og ER eller Mt Tracker (0,5 uM, 250 nM) i RPMI eller keratinocyt medier i 30 minutter ved 37 ° C. Ca

2+ frigivelse blev stimuleret under anvendelse af agonister i kombination med forskellige koncentrationer af BA i Ringers opløsning. Billeder blev opsamlet med en Zeiss 510 LSM 5 Pascal monteret på en opretstående mikroskop (Zeiss Axioplan 2) udstyret med en Axoplan X63 (NA 0,95) nedsænkning i vand mål. En HeNe laser blev anvendt til at excitere Rhod-2 ved 543 nm. 488 nm fra en laserdiode blev anvendt til at excitere ER eller Mt Tracker. Emissionen blev opsamlet på et fotomultiplikatorrør gennem et 560 nm LP-filter for Rhod-2 og en 505 LP filter for ER og Mito trackers. Yderligere forstørrelse, tidsserier, og baggrund subtraktion blev kontrolleret ved hjælp af Zeiss LSM erhvervelse software. Alle billeder blev erhvervet som 12 bit.

A. To DU-145-celler mærket med rødt fluorescerende intracellulært calcium fluorofor, Rhod-2, og grønt fluorescerende endoplasmatiske reticulum etiket, ER tracker. Gul angiver overlapning Ca

2+ og ER og cirklen er den region af interesse (ROI) analyseret i disse eksperimenter. Pile viser organeller: Nucl (nucleolus), Nuc (kerne), ER (endoplasmatisk reticulum) B. To DU-145-celler mærket med rødt fluorescerende intracellulære Ca

2+ fluorofor, Rhod-2, og grønt fluorescerende mitokondriel etiket, Mito tracker. Gul angiver overlap af calcium og mitokondrier. Pile angiver organeller:. Nucl (nucleolus), Nuc (kerne), mt (mitokondrier)

Analyse af Ca

2+ frigørelse med konfokalmikroskopi

BA behandlinger blev anvendt i Ca

2+ free Ringers opløsning fremstillet ved anvendelse af ultrarent vand for at fjerne B [16], [34]. Ca

2+ frigivelse fra RyR blev aktiveret ved tilsætning af enten 25 uM cADPR til 10 uM digitonin permeabiliserede celler, eller 20 mM koffein eller 100 uM 4-chlor-m-cresol (4cmc) i intakte celler [35] , [36]. Inhibering af Ca

2+ frigivelse blev opnået ved anvendelse af 10 uM dantrolen eller varierende koncentrationer af BA i nærvær af en agonist [37]. SERCA blev inhiberet under anvendelse af 10 uM cyclopiazonsyre (CPA) [2]. Alle narkotika ansøgninger for en 30 sekunders varighed i calcium gratis Ringers opløsning (143 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM MgCl

2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA-2H

2O, 1 mM EGTA) for at se Ca

2+ frigivelse fra butikkerne uden input af ekstern Ca

2+. Drug ansøgning blev efterfulgt af en tre minutters vask i Ringers opløsning indeholdende calcium (140 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM CaClz

2, 1 mM MgCl

2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES). Opløsninger blev leveret til perfusionskammeret med en hastighed på 1 ml /min ved anvendelse af en enkelt-pass, tyngdekraft-foder perfusion system. Konfokal billeder blev taget hvert sekund og begyndte 2 minutter før den første behandling ansøgningen for at etablere en base linje af fluorescensintensitet. Ændringen i fluorescensintensitet (f) som følge af anvendelsen lægemiddel blev sammenlignet med et midlet basisopgørelse som bestod af tre målinger forud for påføring af lægemidlet (FO). Alle målinger blev normaliseret til basislinien på denne måde under anvendelse af forholdet f-fo /FO. 6-10 celler blev typisk analyseret i et synsfelt, og alle eksperimenter blev udført på et minimum af tre uafhængige præparater. Rækkefølgen af ​​narkotika ansøgning var baseret på en indledende eksperiment involverer hinanden følgende agonist-kun applikationer. Hvis 2

nd anvendelse af agonist forårsagede en lavere Ca

2+ frigivelse end 1

st blev celler behandlet med agonist plus BA først. Dette undgik den mulighed, at målte hæmning af Ca

2+ frigivelse skyldes BA skyldtes delvis til ildfaste celler lavet så efter forudgående behandling med agonist.

Analyse af lagrede calcium niveauer

DU-145 prostatacancerceller blev behandlet med BA i 1 til 72 timer i medier strippet af bor ved hjælp Amberlite IRA-743 ionbytterharpiks (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) som tidligere beskrevet. Lige før analyse celler blev fjernet fra pladen under anvendelse af 1% trypsin fordøjelse, centrifugeret, og mærket i 45 minutter i standard medier med 3 uM Rhod-02:00 ester til opbevaring Ca

2+ analyse. For at overvåge cytoplasmatiske Ca

2 + niveauer blev celler mærket med 5 uM Indo-1 AM (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 45 minutter. Mærkede celler blev derefter vasket og resuspenderet i 1 ml normal medier. Fluorescens blev analyseret ved anvendelse af en Beckton Dickinson BD-LSR I analytisk flowcytometer. Rhod-2 excitation blev opnået med en 514 nm argon-laser og analyseret i (581 nm) FL-2 kanal. Indo-1 var ophidset med en UV-laser (351 nm) og analyseret på 400 nm (FL5) og 510 nm (FL4) band-pass filtre. Resultater for Indo-1 mærkede celler er givet som forhold mellem fluorescens (FL5 /FL4). Forward og side scatter blev brugt til at udelukke cellulære fragmenter [38]. Rå flowcytometri data blev analyseret under anvendelse FLOWJO software (Treestar Software, San Carlos, CA, USA). Resultaterne præsenteres som% Ca

2 + niveauer sammenlignet med ubehandlede celler. Opbevaring Ca

2 + niveauer blev også analyseret i BA behandlede og ikke-behandlede celler ved at sammenligne Ca

2+ storage tømning som respons på 100 uM thapsigargin hjælp konfokal mikroskopi [39].

Statistisk analyse af data

data er præsenteret som middelværdi ± SD og blev analyseret ved anvendelse af Students parrede eller uparrede t-test eller envejs ANOVA for multiple sammenligninger med Dunnetts multiple sammenligningstest post-hoc test anvendelse af GraphPad Prism 4.0. En p-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Ligningen for ikke-lineær ét sted binding (hyperbel) Y = Bmax * X /(K

d + X) blev anvendt til at beregne K

d og Bmax-værdier ved hjælp Graphpad software.

Kemi og forsyninger

B blev fjernet fra vand og medier, der bruger metoder beskrevet tidligere [13]. Koffein, 4-CMC, ATP, CPA, dantrolen, thapsigargin, cADPR, digitonin og borsyre blev opnået fra Sigma (St. Louis, MO) fortyndet i calciumfrit Ringers opløsning for at sikre, at hvis DMSO var nuværende niveauer var ikke større end 0,1 %. Alle opløsninger blev fremstillet frisk før perfusion. Superfusionssystem med 0,1% DMSO i calcium gratis Ringers opløsning påvirkede ikke ER Ca

2+ niveauer eller billedbehandling svar.

Resultater

Formålet med undersøgelsen var at bestemme, om fysiologiske koncentrationer af BA hæmme frigivelsen af ​​Ca

2+ fra Ryr følsomme butikker i menneskelig prostatakræft og ikke-tumor epitelceller. DU-145-celler blev fyldt med Rhod-2 og ER tracker eller Mito tracker at bestemme, om Rhod-2 rumopdelt i et eller begge rum. Det var ikke muligt at afgrænse Ca

2+ signalering fra ER versus mitokondrier i levende celler ved hjælp af konfokal mikroskopi. Rhod-2 mærket Ca

2+ i mitokondrier, ER, nucleolus, og andre områder i cellen (fig. 1A-B). I vores eksperimenter blev en kombination af ER Tracker og Rhod-2 anvendes til at definere vores regioner af interesse på websteder af lagret Ca

2+ (fig. 1A). Dette område omfattede Ca

2 + butikker placeret i ER og mitokondrier (Fig. 1A-B). Anvendelse af BA fra 0,1-1000 pM alene ikke demonstrerer en umiddelbar målbar effekt på opbevaring Ca

2+ hjælp konfokalmikroskopi (data ikke vist).

Borsyre hæmmer Ca

2+ udgivelse i respons på ryanodine receptoragonister

for at afgøre, om BA hæmmede Ca

2+ frigivelse fra RyR, vi behandlede DU145 celler med tre forskellige Ryr agonister i kombination med BA. Competitive ligandbindende analyse viste BA var et enkelt site reversibel kompetitiv inhibitor af cADPR, en endogen agonist af RyR (fig. 2A-C). Ligevægtsdissociationskonstanten, (K

D) for cADPR var 15,10, men i nærvær af BA steg til 49,39. Hæmning af BA blev vendt ved at øge koncentrationen af ​​cADPR og tilstedeværelsen af ​​BA ændrede ikke det maksimale antal bindingssteder (Bmax) (tabel 1).

A. 50 uM BA inhiberede 25 uM cADPR induceret Ca

2+ frigivelse (n = 6; *** p 0,001). B. Competitive ligandbindende undersøgelse viste BA var en overvindes kompetitiv antagonist af cADPR i samme site model. Koncentrationer af BA blev afholdt ved 50 uM. Ved lave koncentrationer cADPR flyttet BA Ca

2+ frigivelse svar til højre, men dette blev vendt ved højere koncentrationer cADPR og den maksimale respons (Bmax) blev ikke ændret. Hvert datapunkt er gennemsnittet af n = 6. R

2 er 0,9155 og 0,8606 for cADPR uden og med BA, henholdsvis.

Vi analyserede derefter effekten af ​​BA på anden Ryr agonister i intakte celler. Vi bruges første koffein [20 mM] en agonist, der potentierer RyR følsomhed over for dets native ligand, Ca

2+. Som svar på to på hinanden følgende anvendelser af koffein, den anden udgivelse var lidt større end den første (fig. 3A). Denne sekvens blev derefter gentaget med BA tilsat i kombination med koffein i det andet program. Resultaterne af disse forsøg viser, at BA reduceret Ca

2+ frigivelse på en dosisafhængig måde ud fra 10 til 150 um BA (fig. 3B-F). Vi derefter undersøgt effekten af ​​BA på 4CmC, en direkte agonist af RyR. Sammenhængende anvendelser af 50 pM 4CmC resulterede i tilsvarende Ca

2+ frigivelse (fig. 4A). Som observeret med koffein, BA faldt 4CmC stimuleret Ca

2+ frigivelse på en dosisafhængig måde (fig. 4B-E). Men hæmning begyndte ved 1 uM BA og nåede et maksimum på 10 uM BA.

A. Ca

2+ frigivelse i DU-145-celler som respons på hinanden følgende anvendelser af 20 mM koffein (n = 6, * p = 0,0168). B. 10 uM BA inhiberede signifikant Ca

2+ frigivelse (n = 6, ** p 0,01). C. 20 uM M BA inhiberede Ca

2+ frigivelse signifikant (n = 6, * p = 0,0163). D. 50 uM BA inhiberede Ca

2+ frigivelse signifikant (n = 6, ** p = 0,0042). E. 150 uM BA hæmmede signifikant Ca

2+ frigivelse, n = 6, *** p = 0,0001. F. kombineret dataanalyse viser inhibitorisk dosisresponseffekt af BA på koffein stimuleret Ca

2+ frigivelse, (n = 6 pr koncentration, ** p 0,01). Figurerne 2-9, hver søjle repræsenterer middelværdien reaktion af 6 eksperimenter (n = 6) replikeres 3 gange. De linje scanninger på højre for hver søjlediagram er repræsentative svar fra et enkelt forsøg.

A. På hinanden følgende anvendelser af 4-CMC ændrede ikke calciumfrigivelse respons (n ​​= 6, NS). B. 0.1 uM BA ikke hæmmer Ca

2+ frigivelse. C. 1,0 uM BA inhiberede Ca

2+ frigivelse (n = 6, * p 0,05). D. 10 uM BA inhiberede Ca

2+ frigivelse (n = 6, *** p = 0,0005). E. Kombinerede dataanalyse viser en dosisafhængig Ca

2+ frigivelse respons (n ​​= 6 pr fusion (** p. 0,01)

Tidligere undersøgelser har vist, at den inhibitoriske virkning af BA på celledeling på IC

50 for DU-145 celler var ca. 10% mindre effektive på de mindre aggressive LNCaP prostatakræft cellelinje. Desuden BA var ikke i stand til at opnå en 50% reduktion i proliferation i ikke-tumor PWR1E prostata epitelceller ved forsøg med op til 4 gange IC

50 for DU145 [16]. Vi undersøgte disse cellelinjer for at bestemme om BA var også mindre effektiv til inhibering af koffein følsomme Ca

2+ frigivelse. inhibering af Ca

2+ frigivelse som reaktion på koffein i LNCaP prostatatumorceller foregået over 20 uM-150 uM BA (fig. 5A-D). således LNCaP-celler var mindre følsomme over for BA sammenlignet med DU-145. LNCaP-celler var ikke reagerer på 4CmC behandling (ikke vist). Den PWR1E non-tumor, hyperplasisk prostata-cellelinien krævede 150 uM BA at inhibere koffein stimuleret Ca

2+ frigivelse (fig. 6A-D). PWR1E celler var ikke-responsive for 4CmC behandling (ikke vist).

A. 20 uM BA inhibering af calcium frigivelse (n = 6, * p = 0,0226). B. 50 uM BA inhibering af Ca

2+ frigivelse (n = 6, ** p = 0,0019). C. 150 uM BA inhibering af koffein induceret Ca

2+ frigivelse (n = 6, *** p 0,0001). D. Kombinerede data, der viser koncentrationsafhængig hæmning af koffein stimuleret frigivelse (n = 6, ** p 0,01)

A.. Konsekutive koffein applikationer i PWR1E prostata celle. (N = 6, NS). B. 50 uM BA og koffein induceret Ca

2+ frigivelse viser ingen hæmning (n = 6, NS). C. 150 uM BA inhiberede koffein induceret Ca

2+ frigivelse (n = 6, ** p = 0,0029). D. kombinerede data viser ingen dosis-respons og inhibering kun ved 150 uM (n = 6, * p 0,05).

Borsyre inhiberer cyclopiazonsyre induceret Ca

2+ frigivelse fra ER

frigivelsen af ​​eR Ca

2 + butikker i nogle ikke-exciterbare celler kan stimuleres ved anvendelse cyclopiazonsyre (CPA), som inhiberer SERCA på en måde svarende til thapsigargin, men kan vaskes ud [40] . BA (0,1-1000 uM) alene ændrede ikke storage calciumniveauer i tidsforløbet af eksperimentet (ikke vist). Svar på hinanden følgende anvendelser af CPA [10 uM] ikke henfalde (fig. 7A). Samtidig påføring af CPA og 1 uM BA forårsagede et signifikant fald i frigivelse og 10 uM BA forårsaget næsten fuldstændig inhibering (fig. 7B-D). Vi derefter testet effekten af ​​dantrolen, en kendt inhibitor af RyR om Ca

2+ frigivelse ved CPA. Vi fandt, at 10 uM dantrolen hæmmede CPA stimuleret Ca

2+ frigivelse på et niveau svarende til 10 uM BA (Fig. 8A-B).

Celler blev testet med CPA + BA efterfulgt af CPA. A. Konsekutive anvendelser af CPA ændrede ikke Ca

2+ frigivelse (n = 6, NS). B. 0,1 uM M BA ikke hæmme CPA stimuleret Ca

2+ frigivelse (n = 6, NS). C. 1,0 uM BA inhiberede CPA stimuleret Ca

2+ frigivelse (n = 6, ** p = 0,0037). D. 10 uM BA hæmmede CPA stimuleret Ca

2+ frigivelse (n = 6, *** p 0,0001)

A.. Celler blev testet med CPA (10 uM) + dantrolen (10 uM) efterfulgt af CPA (n = 6, *** p 0,0001 B. BA inhiberede CPA stimuleret Ca

2+ frigivelse i en koncentrationsafhængig måde Den.. inhiberende virkning af dantroline og BA var ækvivalente ved 10 uM, CPA (n = 6, ** p 0,01).

Borsyre behandling sænker oplagring [Ca

2 +] uden effekt på cytoplasmatisk [Ca

2+]

Vores resultater viser BA hæmmede Ca

2+ frigivelse føre os til at analysere relative [Ca

2 +]

st niveauer ved hjælp af Rhod-2 farvede celler og relative [Ca

2 +]

CYT niveauer ved hjælp af Indo-1 farvede celler og flowcytometri. Eksponering af DU-145 celler til BA [10-50 uM] i 24 timer påvirkede ikke [Ca

2 +]

cyt (fig. 9A). Men reduktioner [Ca

2 +]

st (22%) forekom med 10 uM BA resulterede i en reduktion i [Ca

2 +]

st med 50 uM BA på 1 time (fig. 9B). Hverken højere koncentrationer BA eller behandling med 10 pM BA op til 72 timer resulterede i yderligere reduktion i [Ca

2 +]

st (fig. 9BC). Vi derefter gennemførte konfokale målinger af thapsigargin stimuleret Ca

2+ udgivelse efter DU-145 celler blev forbehandlet med BA (50 uM) i 24 timer og observeret et fald på 35% i Ca

2+ frigivelse (fig. 9D).

A. Relativ [Ca

2 +]

cyt efter udsættelse for 0, 10 og 50 uM BA i 24 timer (n = 5, NS). B. [Ca

2 +]

st som procent af 0 behandling i DU-145-celler behandlet med 0-250 uM BA i 24 timer. Borsyre [10-50 uM] reducerede ER calcium niveauer med mere end 22% -32% i forhold til ubehandlede celler (n = 5, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001). C. Reduktion af [Ca

2 +]

st i DU145 celler behandlet med 50 pM BA fra 1-72 timer (n = 5, ** p 0,01). D. Konfokal måling viste forbehandling af celler med BA i 24 timer sænkede thapsigargin stimuleret Ca

2+ frigivelse i forhold til ubehandlede celler (n = 6, *** p 0,0001)

Diskussion.

Denne undersøgelse rapporterer den uventede opdagelse, at lagrede Ca

2+ frigivelse og luminale niveauer kan moduleres af fysiologisk relevante niveauer af BA i DU-145 prostatacancer epitelceller. Dette er relevant for vores forståelse af kræftrisiko, da blodets indhold af BA bestemmes af forbruget af B i drikkevand og plante afledte fødevarer [17]. Det er sandsynligt, at være den første cellulære respons til B eksponering og dermed et udgangspunkt for at forstå, hvordan risikoen for prostata- og lungekræft, med B på en dosisafhængig måde [16], [21], [22]. BA udstillet attributterne for en klassisk antagonist i, at det ikke havde en umiddelbar effekt på Ca

2+ frigivelse når den anvendes af sig selv og dens virkninger var agonist afhængige. BA dosisafhængig inhiberet Ca

2+ frigivelse som reaktion på cADPR, en endogen agonist af RyR, og agonister koffein og 4-CMC (fig. 2-5). I vores konkurrencedygtige ligandbindende analyse, BA viste karakteristisk for et enkelt site antagonist ved, at det var reversibel ved højere koncentrationer af cADPR (fig. 2B). BA øgede K

d, 15,1-49,4, men påvirkede ikke Bmax (tabel 1). BA er blevet vist at binde til cADPR ved høje koncentrationer, men BA evne til at inhibere cADPR, koffein og 4CmC inducerede Ca

2+ frigivelse indikerer, at BA ved fysiologiske koncentrationer kan binde til cADPR bindende site på RyR stabilisere Ca

2+ kanal i sin inaktive tilstand [30].

Proliferation af LNCaP-celler er blevet rapporteret til at være ca. 10% mindre følsomme og PWR1E ikke-tumorceller er mere end 4 fold mindre følsomt over for BA end DU-145-celler [16]. Vi observerede også dette mønster af følsomhed i BA evne til at hæmme koffein stimuleret Ca

2+ frigivelse. Den laveste effektive koncentration for DU-145 var 10 uM BA, LNCaP var 20 uM BA, og PWR1E var 150 uM BA (fig 3F, 5D . 6D). Ud over den formindskede respons over for BA, både LNCaP og PWR1E var ikke-responsive for 4CmC behandling. RyR isoformerne 1 og 2, men ikke 3 vides at blive aktiveret af 4CmC i nogle cellelinjer [41]. Det er muligt, at cellelinje forskelle skyldtes forskelle i Ryr isoformer eller deres ekspression. LNCaP-cellelinjer har vist sig at udtrykke RyR 1 og 2, men ikke 3 [42]. Vi kunne ikke finde studier i litteraturen, der identificerede Ryr isoformer i DU-145 eller PWR1E celler i en hvilken som helst prostata cellelinje.

nyrefunktionsprøver har vist BA reabsorberes af nyrerne i ikke-gravide og gravide kvinder [43]. Opdagelsen af ​​en elektrogen, spændingsreguleret bicarbonat natrium-koblet borat co-transporter (NaBC1) i rotte nyretubuli kan forklare denne iagttagelse, men det er endnu ikke blevet bekræftet af et andet laboratorium. NaBC1 ekspression induceret proliferation i HEK og Hela-celler ved aktivering af MAPK-vejen 16 timer efter behandling [13]. Det vides ikke på nuværende tidspunkt, om NaBC1 udtrykkes i prostata tumor og ikke-tumor cellelinier, men forskelle i ekspression er blevet rejst som en mulig forklaring på variationen i cellulær følsomhed for BA mellem prostata tumor og ikke-tumorceller [10 ].

for yderligere at udforske BA evne til at hæmme gemt Ca

2+ frigivelse testede vi dets virkninger i overværelse af CPA (fig. 7-8). CPA inhiberer SERCA kanal medfører tømning af Ca

2+ butikker [44]. Vores undersøgelse viste, at BA dosisafhængig blokeret CPA medieret Ca

2+ udgivelse i DU-145 celler. Vi har også observeret en reduktion af lagerplads Ca

2 + niveauer med 22% til 32% i 10 til 50 uM BA behandlet DU-145 celler i forhold til ubehandlede celler. STIM proteiner er involveret i at udløse Ca

2+ tilstrømning ind på skadestuen [45] – [48]. Hvis BA reducerer Ca

2+ lækage gennem Ryr kanaler de store tab ved lækage kan forekomme gennem preseniliner og andre ikke-kanal proteiner, der ikke stimulerer STIM proteiner. Dette vil resultere i nedsat lagret Ca

2 + niveauer, der er i stand til at signalere genopfyldning.

Betydningen af ​​Ca

2+ i cellecyklus kontrol og spredning er en veletableret område for kræftforskning, men det er ikke blevet undersøgt som en virkningsmekanisme i kræftforebyggelse [49] – [51]. BA evne til at modulere celleproliferation er blevet forbundet med ændringer i ekspressionen af ​​cycliner og MAPK-vejen i DU-145, HEK293 og HeLa-celler [13], [16], [26]. Det er dog muligt forekommer disse virkninger som svar på nedsættelser i Ca

2+ release eller opbevaring. I prostatacancer LNCaP-cellelinie, observerede Humez at IGF (5 ng /ml), hvilket øger cellevækst, øget ER [Ca

2 +]

ER, hvorimod TNF-alfa (1 ng /ml), som reducerer celleproliferation, reduceret [Ca

2 +]

eR [52].

det kan konkluderes, BA er tidligere blevet rapporteret at reducere risikoen for prostatacancer i mennesker og mindske tumorvækst og prostata cancer proliferation, migration og invasion. Vores resultater viser, at fysiologiske niveauer af BA hæmmer agonist stimuleret frigørelse af oplagret Ca

2+ på en dosisafhængig måde og lavere gemt Ca

2 + opbevaring niveauer.