PLoS ONE: Størrelse-Based Isolering af cirkulerende tumorceller i lungekræftpatienter Ved hjælp af en Microcavity Array System

Abstrakt

Baggrund

Epithelial celleadhæsionsmolekyle (EpCAM) -baseret tælling af cirkulerende tumorceller (CTC) har prognostisk værdi i patienter med solide tumorer, såsom fremskreden bryst-, tyktarms-, og prostatakræft. Imidlertid har ringe følsomhed blevet rapporteret for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). For at løse dette problem, har vi udviklet en microcavity array (MCA), der er integreret med en miniature enhed til CTC isolation uden at forlade sig på EpCAM udtryk. Her rapporterer vi resultaterne af en klinisk undersøgelse af CTCs avancerede lungekræftpatienter, hvor vi sammenlignede MCA-system med den CellSearch system, som anvender den konventionelle EpCAM-baserede metode.

Metoder

Parrede perifere blodprøver blev opsamlet fra 43 metastatiske lungecancerpatienter at opregne CTCs vha CellSearch system ifølge producentens protokol og MCA-system ved immunolabeling og cytomorphological analyse. Tilstedeværelsen af ​​CTCs blev vurderet blindt og uafhængigt af begge systemer.

Resultater

blev påvist

CTCs i 17 ud af 22 NSCLC patienter, der bruger MCA-system versus 7 af 22 patienter, der bruger CellSearch system. På den anden side, blev CTCs påvist i 20 af 21 småcellet lungecancer (SCLC) patienter, som brugte MCA-system versus 12 ud af 21 patienter, som brugte CellSearch system. Væsentligt flere CTCs i NSCLC patienter blev opdaget af MCA-system (median 13, spændvidde 0-291 celler /7,5 ml) end af den CellSearch systemet (median 0, interval 0-37 celler /7,5 ml) demonstrerer statistisk overlegenhed (p = 0,0015 ). Statistisk signifikans blev ikke nået i SCLC selvom blev observeret tendensen begunstige MCA-systemet over CellSearch systemet (p = 0,2888). MCA-systemet også isoleret CTC klynger fra patienter, der var blevet identificeret som CTC negative ved hjælp af CellSearch system.

Konklusioner

MCA-systemet har et potentiale til at isolere betydeligt flere CTCs og CTC klynger i avanceret lungekræftpatienter forhold til CellSearch systemet

Henvisning:. Hosokawa M, Kenmotsu H, Koh Y, Yoshino T, Yoshikawa T, Naito T, et al. (2013) Størrelse-Based Isolering af cirkulerende tumorceller i lungekræftpatienter Ved hjælp af en Microcavity Array System. PLoS ONE 8 (6): e67466. doi: 10,1371 /journal.pone.0067466

Redaktør: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hongkong

Modtaget: Januar 18, 2013; Accepteret: 17. maj 2013; Udgivet: 28 juni 2013

Copyright: © 2013 Hosokawa et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af regionale innovationsstrategier Cluster Program og en Grant-in-Aid for Research Fellowship for Unge Forskere (11J11150) fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. MH, TYoshino, HKanbara, og TM har ansøgt om patenter relateret til MCA-system . HKanbara er ansat af Hitachi Chemical Co., Ltd. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag af kræft-relaterede dødsfald i de fleste industrialiserede lande. Småcellet lungekræft (SCLC) tegner sig for ca. 15% af lungekræft tilfælde, og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), som omfatter adenocarcinom (ADC) og pladecellekræft (SCC), tegner sig for 85% af lungekræft tilfælde . Det er for nylig blevet vist, at identifikation af NSCLC patienter ved påvisning af genetiske afvigelser, specielt

EGFR

-activating mutationer og

EML4-ALK

fusion gen, giver mulighed for bedre forudsigelse af respons på EGFR tyrosin kinaseinhibitorer og ALK-inhibitorer, henholdsvis [1], [2]. Trods fremskridt i forebyggelse og behandling, er NSCLC patienter ofte diagnosticeret på et fremskredent stadium og har en dårlig prognose på grund af sygdommens tendens til fjernmetastaser, den primære årsag til dødelighed blandt NSCLC-patienter. Kendetegnet ved aggressiv tumorvækst og ofte præsentere med metastaser i de regionale knudepunkter og fjerntliggende organer, SCLC er oprindeligt meget følsomme over for kemoterapi, men har tendens til at erhverve kemoresistens, hvilket fører til uundgåelige tilbagefald.

Cirkulerende tumorceller (CTCs) er defineret som tumorceller, der cirkulerer i det perifere blod af patienter med metastatisk cancer. Når den måles under anvendelse af US Food and Drug Administration (FDA) -godkendte CellSearch systemet (Veridex, Raritan, NJ, USA), antallet af CTCs i perifert blod kan anvendes til at forudsige prognosen for patienter med metastatisk brystcancer [3], colorectal cancer [4], prostatacancer [5], NSCLC [6], og SCLC [7]. Den CellSearch systemet beriger CTCs anvendelse af magnetiske perler overtrukket med et monoklonalt antistof-målretning epitelcelle markør, såsom epitelcelle-adhæsionsmolekyle (EpCAM) [8], [9]. Imidlertid har flere undersøgelser vist, at tilstedeværelsen af ​​EpCAM på tumorceller varierer med tumortype [10], [11]. Ekspressionen af ​​epiteliale cellemarkører, herunder EpCAM, nedreguleres at øge invasionsevne og metastatisk potentiale ved epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) [12] – [16]. Det er blevet foreslået, at den lave forekomst af CTCs detekteret i patienter med fremskreden NSCLC vha CellSearch systemet kan skyldes tabet af EpCAM-ekspression [17], hvilket indikerer, at EpCAM-baserede CTC isoleringsmetoder ikke kan opnå en stabil og reproducerbar CTC nyttiggørelse fra alle tumortyper.

Andre CTC isolation metoder er hovedsagelig baseret på forskelle i størrelse og formbarhed mellem CTCs og hæmatologiske celler. Som tumorceller ( 8 um) er større end leukocytter [18] – [21], isolering ved størrelsen af ​​epiteliale tumorceller (Iset) kan opnås ved anvendelse filtrering for at adskille individuelle celler. ISET hjælp af en polycarbonat-filter, en billig, brugervenlig metode til at berige CTCs, muliggør genvinding og detektering af epitelial-markør-negative CTCs på basis af størrelse-afhængige CTC isolation. I kliniske forsøg, har vist sig anvendelsen af ​​et ISET-baseret system for at opnå højere CTC påvisning følsomhed i patienter med metastatisk lungecancer sammenlignet med brugen af ​​den CellSearch systemet [22] – [24].

For nylig, mikrofabrikerede anordninger til størrelse baseret separation af tumorceller er ofte blevet udviklet for at muliggøre præcis og effektiv berigelse af CTCs fra fuldblod [25] – [28]. Disse anordninger omfatter en miniaturiseret microcavity array (MCA) system, som vi udviklet til højeffektive indfangning af enkeltceller ved filtrering baseret på forskelle i størrelserne af celler [29], [30]. I en tidligere undersøgelse undersøgte vi anvendelse af vores MCA-system til påvisning af spikede tumorceller fra ubehandlet humant fuldblod ud fra forskelle i størrelse og deformerbarhed mellem tumorceller og andre blodceller [31]. Ved hjælp af vores enhed, var vi i stand til at indeslutte tumorceller på størrelse-og geometri-kontrollerede microcavity arrays sammensat af 10.000 åbninger ved påføring undertryk, så det indkapslede celler til at være let optælles og analyseret ved mikroskopisk billeddannelse af bestemte områder. Endvidere fandt vi, at anvendelsen af ​​det miniaturiseret anordning tilladt for indføring af en række reagenser til påvisning af tumorceller gennem mikrofluid struktur. Vores resultater viser, at vores system er en enkel, men præcist system til påvisning af tumorceller i fuldblod. For at bekræfte og bygge videre på vores tidligere resultater, vi sammenlignede kapacitet og effektivitet i vores roman MCA-system og den nuværende guldstandarden CellSearch systemet i at udføre CTC påvisning og tælling i hele blodprøver hentet fra en kohorte af NSCLC og SCLC-patienter.

Materialer og metoder

Study design og etiske retningslinjer

Denne prospektive undersøgelse blev udført for at evaluere CTC optælling ved hjælp af CellSearch systemet og MCA-system i patienter med metastatisk lungekræft i et blindet forsøg (Umin kliniske forsøg registreringsdatabasen, nummer UMIN000005189). Tilstedeværelsen af ​​CTCs blev vurderet individuelt efter deres kriterier før kende nogen resultater fra hinanden. Kriterierne Undersøgelsen inklusionskriterier var diagnosen patologisk bevist lungekræft med radiologisk tydelige metastatiske læsioner, dvs. histologisk eller cytologisk bekræftet metastatisk NSCLC eller SCLC og indskrivning på Shizuoka Cancer Center. De institutionelle anmeldelse bestyrelser i Shizuoka Cancer Center godkendte forsøgsprotokollen, og alle patienter skal skriftligt informeret samtykke. Fra hver af de 43 patienter, der blev indskrevet, hvoriblandt 22 var blevet diagnosticeret med NSCLC og 21 med SCLC, var 10-15 ml blod opsamles i EDTA-rør til CTC tælling af MCA-system i vores laboratorium (Shizuoka Cancer Center, Shizuoka , Japan), og 20 ml blev opsamlet i CellSave indsamling rør til CTC tælling af CellSearch system i laboratorium SRL Inc. (Tokyo, Japan).

Cell Kultur og mærkning

HCC827, NCI-H358, NCI-H441, DMS79, NCI-H69, og NCI-H82 cellelinjer blev købt fra American Type Culture Collection uden yderligere prøvning eller godkendelse. A549 (Riken Bioresource Center, Tsukuba, Japan) og PC-14 [32] blev venligst stillet til rådighed af Dr. Fumiaki Koizumi (National Cancer Center, Tokyo, Japan). Den A549, HCC827, NCI-H358, NCI-H441, PC-14, DMS79, NCI-H69, og NIC-H82 NSCLC og SCLC-cellelinier blev dyrket i RPMI 1640 medium indeholdende 2 mM L-glutamin (Sigma-Aldrich, Irvine, UK), 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), og 1% (v /v) penicillin /streptomycin (Invitrogen Corp.) i 3-4 dage ved 37 ° C med 5% CO

2 tilskud. Umiddelbart før hvert eksperiment blev cellerne dyrket til konfluens trypsinbehandlet og resuspenderet i phosphatbufret saltvand (PBS). Som en måling af tumor celle størrelse, blev celle størrelsesfordeling bestemmes ved hjælp af CASY® Cell Counter + Analyzer System Model TTC (Schärfe System GmbH, Reutlingen, Tyskland). For at evaluere enhedens ydeevne blev tumorcellelinier mærket med CellTracker Red CMTPX (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), med mærkning opnås ved at inkubere cellerne med en tracking-farvestof (5 uM) i 30 minutter. Efter at cellerne var blevet pelleteret ved centrifugering (200 g i 5 min) blev supernatanten dekanteret. Cellerne blev derefter vasket to gange med PBS for at fjerne overskydende farvestof, inden de resuspenderes i PBS indeholdende 2 mM EDTA og 0,5% bovint serumalbumin (BSA).

Fremstilling af MCA System

MCA-systemet blev fremstillet på samme måde som tidligere beskrevet [29], [31]. For CTC tælling med fluorescensmikroskop observation blev en MCA, der var blevet fremstillet af electroforming af nikkel anvendes. For CTC morfologisk analyse af Giemsa-farvning, blev en transparent MCA, der var blevet fremstillet ved hjælp af laser bestråling af poly (ethylenterephthalat) (PET), der anvendes. Hver af de 10.000 hulrum anbragt i hver 100 x 100 matrix blev fremstillet for at have en diameter på 8-9 um på den øvre overflade og være 60 pm fjernt fra den tilstødende microcavity. Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) strukturer blev fremstillet og derefter integreret med MCA således at den øvre substrat bestod af en mikrokammer en prøve indløb og et udløb, mens det nedre substrat under MCA indeholdt en vakuumledning for at frembringe negativt tryk, muliggør celle klemning. CTC isolation anordning blev konstrueret ved samling MCA, mens de øvre og nedre PDMS lag blev konstrueret ved anvendelse af afstandselementer bånd (figur 1a). Indløbet prøve blev forbundet med et reservoir, mens vakuum mikrokanal blev forbundet til en peristaltisk pumpe.

(a) Skematisk diagram af strukturen af ​​MCA-system. (B) scanning elektronmikroskop billede af en dyrket tumorcellelinie fanget på MCA-system. (C-f) celler isoleret fra SCLC patient blod farves med Hoechst 33342 (c) og fluorescensmærkede antistoffer, der er målrettet cytokeratin (d) og CD45 (e). Sammenlægning af billederne (f) tilladt for identifikation af CTCs og hæmatologiske celler. Scale bar = 60 um.

CTC Optælling ved hjælp af MCA System

Humane blodprøver blev opsamlet i en samling rør med EDTA for at forhindre koagulation og anvendes inden 2 timer. Den gennemsnitlige mængde af blod analyseret var 4,0 ml per prøve (interval, 3,0-7,5 ml). Alle CTC tælling ved hjælp af MCA-system blev udført uden kendskab til patientens kliniske status i laboratoriet af Shizuoka Cancer Center Research Institute. Efter indføring af blodprøver i reservoiret, blev negativt tryk påført på en cellesuspension under anvendelse af en peristaltisk pumpe forbundet til en vakuumledning, lade prøven ledes gennem mikrohulrum ved en strømningshastighed på 200 pl /min. At fjerne eventuelle blodlegemer forbliver på arrayet, PBS indeholdende 2 mM EDTA og 0,5% BSA (1 ml) blev indført i reservoiret og ført gennem de mikrohulrum ved en strømningshastighed på 200 uL /​​minut i 5 minutter.

at farve CTCs med anti-pancytokeratin antistof, blev fanget celler fikseret ved strømning 400 pi 1% paraformaldehyd (PFA) i PBS via MCA ved en flowhastighed på 20 pl /min i 20 min. Efter vask med 100 pi PBS, blev cellerne behandlet med 300 pi 0,2% Triton X-100 i PBS ved en gennemstrømningshastighed på 20 pl /min i 15 min. Efter permeabilisering blev celler behandlet med 3% BSA i PBS ved en gennemstrømningshastighed på 20 pl /min i 30 min. At identificere CTCs og leukocytter, 600 pi celle-farvningsopløsning indeholdende 1 ug /ml Hoechst 33342 (Molecular Probes); en cocktail af anti-pancytokeratin antistoffer (Alexa488-AE1 /AE3 (1:100 fortynding eBioscience, San Diego, CA, USA) og FITC-CK3-6H5 (1:60 fortynding Miltenyi Biotec, Auburn, Californien CA USA); og PE-mærket anti-CD45-antistof (1:120 fortynding BD Biosciences, San Jose, CA, USA) blev ledt gennem mikrohulrum ved en flowhastighed på 20 pl /min i 30 min Endelig blev arrayet vasket med 400. . pi PBS indeholdende 2 mM EDTA og 0,5% BSA for at fjerne overskydende farvestof Efter genvinding af tumorceller, et billede af hele cellen arrayet område blev opnået ved anvendelse af et fluorescensmikroskop (BX61, Olympus, Tokyo, Japan) integreret med en 10 × objektivlinse og en computer betjente motoriseret stadiet; WU, NIBA, og WIG filtersæt, en afkølet digitalkamera (DP-70, Olympus). og Lumina Vision erhvervelse software (Mitani Corporation, Tokyo, Japan)

i kliniske forsøg et helt billede af cellen vifte området var opnået ved hjælp af en fluorescens mikroskop (Axio Imager Z1, Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland) integreret med en 10 × eller 20 × objektiv og en computer- drives motoriseret fase; WU, FITC, og Texas Red filter sæt; et digitalt kamera (AxioCam HRc, Carl Zeiss); og AxioVision erhvervelse software (Carl Zeiss). Efterfølgende var billedanalyse udført og genstande, som opfyldte forud fastsatte kriterier var blevet talt. Fluorescensintensiteter og morfometriske karakteristika, såsom cellestørrelse, form og nuklear størrelse, blev anset ved udførelse CTC identifikation og ikke-tumorcelle udelukkelse, med celler kendetegnet ved en runde til ovale morfologi og en synlig kerne (dvs. som Hoechst-33342 positive), der var positive for cytokeratin og negativ for CD45 identificeret som CTCs. Isolerede CTCs på den gennemsigtige MCA blev også farves under anvendelse af en May-Grunwald-Giemsa (MGG) -farvning metode bestående af fiksering med 4% PFA, ufortyndet May-Grünwald plet i 2 minutter, maj-Grünwald plet fortyndet 50% i PBS i 1 min og Giemsa farve i 18 minutter, efterfulgt af skylning med PBS i 1 min.

CTC Tælling hjælp af CellSearch System

Hele blodprøver blev holdt ved stuetemperatur, sendt natten over til laboratoriet hos SRL Inc., og behandles inden for 96 timer efter opsamling. Alle CTC evalueringer blev udført uden kendskab til patientens kliniske status i laboratoriet, og resultaterne blev rapporteret kvantitativt som antallet af CTCs /7,5 ml blod. CTCs blev defineret som EpCAM-isolerede intakte celler, der viser positiv farvning for cytokeratin og negativ farvning for CD45. I overensstemmelse med tidligere evalueringer af CellSearch systemet [8], blev en patient anses CTC positivt, hvis ≥2 CTCs /7,5 ml blod blev påvist i patientens prøve.

Resultater

CTC Isolation og billedanalyse under anvendelse MCA System

Isolering og farvning af tumorcellerne fra fuldblod blev afsluttet inden for 120-180 min, og image scanning af MCA blev udført ved 3 fluorescens bølgelængder under anvendelse af en 10 × eller 20 × objektivlinse og en motoriseret trin. Figur 1b-f viser scanning elektroskop mikroskopi (SEM) og fluorescens billeder af de farvede celler, der blev inddrevet på MCA. Som det kan ses, blev ensomme celler og celleklynger individuelt fanget og tilbageholdt på de mikrokaviteter, der let kunne opregnede. Indvundne celler, der havde en runde til ovale morfologi og en synlig kerne (dvs. var Hoechst 33342 positiv) og var positive for pancytokeratin og negative for CD45, blev identificeret som tumorceller, mens CD45-positive celler blev identificeret som kontaminerende normale hæmatologiske celler. Billederne afslører eksistensen af ​​en særskilt immunofænotype af epitelial celle markør-positive tumorceller. Selv om en række leukocytter blev tilbageholdt på array, tumor-celle tælling var relativt letkøbt fordi enkelte celler var blevet fanget på præcist afstemt mikrokaviteter.

følsomhed MCA System i CTC Påvisning af Lung Cancer Cell Lines

i vores tidligere undersøgelse, varierende antal celler i lungen cancercellelinie NCI-H358 blev tilsat til blod, og tumor celleisolering blev evalueret ved hjælp af vores MCA-system [31]. Den beregnede detektion effektivitet var konstant og over 90%, når 10-100 tumorceller var til stede pr ml blod. I denne undersøgelse for at evaluere genfindingsevne forskellige lungecancer-cellelinjer under anvendelse af MCA-system, 100 celler af hver af 8 lung cancercellelinier (A549, HCC-827, NCI-H358, NCI-H441, PC-14 DMS-72, NCI-H69, og NCI-H82) blev tilsat til sunde donor blodprøver og derefter behandlet af MCA-analysen. Tabel 1 viser de gennemsnitlige genfindingsevne og typiske diameter af cellelinierne. Som det kan ses, blev en høj genvindingsgrad opnået, uanset tumortype, der spænder fra 68% til 100% i cellelinjen spike-i eksperimenter. De fleste af de genvundne celler var levedygtige og i stand til at formere sig selv efter at have gennemgået isolation proces, hvilket tyder på potentiale for yderligere biologiske og molekylær analyse af CTCs.

Næste, for at vurdere specificiteten og følsomheden af CTCs afsløring blev følsomhedstest udført på kunstige prøver fremstillet ved tilsætning af 1 og 3 dyrkede NCI-H358 celler til raske donor blodprøver, som tidligere rapporteret af Vona et al. [20]. On og 3 dyrkede NCI-H358-celler fik tilsat i separate 7,5 ml portioner af blod. Disse 7,5 ml blodprøver blev forarbejdet med MCA-system i 3 uafhængige tests (tabel S1). Resultaterne viste en Mærkbarhedstærsklen for MCA-system tæt på 1 tumorcelle pr 7,5 ml blod. Desuden CTCs var ikke detekterbar fra 6 rask donor blod under anvendelse af MCA-system (figur 2). Derfor blev en patient anses CTC positive, hvis ≥1 CTCs pr 7,5 ml blod blev registreret af MCA-system.

CTC tæller /7,5 ml blod er vist for 6 raske donorer, 22 NSCLC-patienter og 20 SCLC patienter .

Desuden tumorcellen genfindingsevne MCA-system blev sammenlignet med den for ISET (figur S1). I denne sammenligning blev 100 celler af NSCLC cellelinje NCI-H358 tilsat til sunde donor blodprøver og derefter behandlet af MCA-system og en track-ætset polycarbonat 8-um pore membran (Nucleopore, Whatman Ltd., Kent, UK). Resultaterne viste genfindingsprocenten hjælp af MCA (100% ± 5%) for at være betydeligt højere end ved brug af ISET systemet (91% ± 2%) (p 0,05, t-test), hvilket indikerer, at brugen af ​​MCA systemet gør det muligt CTC isolation med en effektivitet svarende til eller større end den ISET systemet.

CTC Optælling hjælp af CellSearch System og MCA System

at gennemføre blind sammenligning af påvisning følsomhed af CellSearch og MCA-systemer blev blodprøver indsamlet fra 22 metastatisk NSCLC og 21 SCLC-patienter fra april 2011 og februar 2012 og analyseret for bestemmelse af antallet af patienter identificeret som CTC positive ved hvert system (tabel 2). Af disse prøver, en prøve indsamlet fra en SCLC patient blev ikke evalueret af MCA system, fordi en utilstrækkelig mængde blod var blevet indsamlet til behandling i begge systemer. Som følge heraf blev 17 af de 22 (77%) NSCLC-patienter identificeret som CTC positive ved anvendelse af MCA-system, men kun 7 af de 22 (32%) NSCLC-patienter under anvendelse af CellSearch systemet (tabel 3). Af disse patienter var 8 identificeret som CTC positivt af både CellSearch systemet og MCA-system, 1 blev identificeret som CTC positive med kun CellSearch systemet, og 9 blev identificeret som CTC positive med kun MCA-systemet. I betragtning af de resultater, som begge systemer sammen, 18 (82%) af NSCLC-patienter blev identificeret som CTC positiv. Analyse af disse resultater viste, at et betydeligt større antal NSCLC patienter blev identificeret som CTC positive med MCA-systemet (median celletal 13, rækkevidde 0-291 celler /7,5 ml; Figur 2) end ved CellSearch systemet (median celletal 0 , range 0-37 celler /7,5 ml), der viser den statistiske overlegenhed MCA-system i CTC tælling (p = 0,0015, Wilcoxon test. tabel 3)

i modsætning hertil 20 af de 20 (100%) SCLC-patienter blev identificeret som CTC positive ved anvendelse af MCA-system versus 12 af de 21 (57%) patienter, som brugte CellSearch system. Medianen CTC optælling viste sig at være 2 celler /7,5 ml (interval 0-325) under anvendelse af CellSearch systemet og 23 celler /7,5 ml (interval 2-2329) under anvendelse af MCA-system (figur 2). Selv ikke når et niveau af statistisk signifikans, påvisning følsomhed MCA-system i CTC tælling viste en tendens til at være større end den CellSearch systemet (p = 0,2888, Wilcoxon test tabel 3). For hvert resultat, blev aftalen mellem testresultaterne af de systemer, vurderes af Bland-Altman plots [33]. I analysen af ​​aftale om CTC opregningen i NSCLC patienter var den gennemsnitlige forskel var 50,1 (95% CI, interval 11,1-89,1), med grænserne for aftale spænder fra -125,8 til 226,0. MCA-systemet gav uforholdsmæssigt højere CTC tæller ved højere middelværdier i forhold til The CellSearch (figur S2a). I modsætning hertil i analysen af ​​aftale om CTC opregningen i SCLC patienter var den gennemsnitlige forskel var 202,6 (95% CI, rækkevidde -116.7-521.9), med grænserne for aftale spænder -1.162,0-1567,2. I modsætning til i analysen af ​​NSCLC blodprøver, sås ingen bias mellem systemerne i analysen af ​​SCLC prøver med undtagelse af personer med ekstremt høj CTC titer (figur S2b). Statistisk analyse afslørede også ingen sammenhæng mellem stedet for metastaser og CTC optælling af patienter med lungecancer ved hjælp af enten systemet (data ikke vist).

Morfologiske Funktioner af CTCs isoleret ved anvendelse af MCA System

CTCs var tælles, identificeret som værende cytokeratin positive og CD45 negativ, og som har en synlig kerne på basis af analyse af fluorescerende billeder. Som det kan ses i figur 3, som viser et repræsentativt galleri af CTCs identificeret ved billedanalyse, CTCs er større end de omgivende leukocytter og optræder ofte i klynger, her defineret som sammenhængende grupper af celler indeholdende 3 eller flere kerner. Figur 4 viser et ensomt CTC og en CTC klynge detekteret i én SCLC patient ved anvendelse af MCA-system. Brug af MCA-system, blev der observeret CTC klynger i 2 af de 22 NSCLC-patienter (patient nr 13 og 21) og 4 af de 21 SCLC-patienter (patient nr 31, 33, 34, og 43). May-Grunwald-Giemsa farvning af CTCs isoleret under anvendelse af MCA-system viste, at de er karakteriseret ved en høj N /C-forhold, nuklear støbning, og morfologisk lighed med primære tumorceller.

Celler blev farvet med Hoechst 33342 , FITC-mærket anti-cytokeratin antistof, og PE-mærket anti-CD45-antistof.

Kan-Grünwald-Giemsa-farvede celler viste en høj kerne-cytoplasma ratio og nuklear støbning (× 40). Sort pil indikerer 9-um microcavity. Scale bar = 60 um.

Diskussion

Iset systemer har vist sig at have højere CTC detektionsfølsomhed end CellSearch systemet i flere cancere, herunder NSCLC [17], [22] imidlertid porer Iset filtre, som er lavet af polycarbonat ved spor ætsning, er tilfældigt placeret inden for systemerne på en uensartet tæthed. I modsætning til sådanne track-ætset polycarbonatfiltre, er størrelsen, geometri, og tætheden af ​​de mikrokaviteter i MCA-system vurderet i den aktuelle undersøgelse præcist styret til at opnå specifik celle separation i henhold til forskelle i cellulær størrelse og formbarhed. Justering celler på MCA letter ikke kun cell imaging ved at tillade scanning af bestemte områder med en automatiseret fluorescens mikroskop, men også muliggør reduktion på arbejdsmarkedet kræves til CTC optælling [29], [31]. Som sådan MCA system giver en platform for anvendelse af high-throughput imaging teknologier, der giver hurtigere og billigere dataindsamling samt CTC optælling og avancerede analyse af molekylære fænomener, herunder fluorescens in situ hybridisering til påvisning af tumorspecifikke genomiske ændringer. Endvidere er MCA integreret med en miniaturiseret anordning, således at berigelse af CTCs fra blod, samt farvning og vask i mikrofluid assay kan udføres inden for en integreret anordning.

I den foreliggende undersøgelse, CTCs isoleret på MCA lykkedes farvet med fluorescensmærkede antistoffer, der er målrettet tumor cellemarkører, og farvning og vask viste sig at have ringe eller ingen virkning på tilbageholdelsen af ​​tumorceller på mikrohulrum. På grund af sin meget lille størrelse, MCA-systemet er bærbare, der, ved at muliggøre point-of-care CTC optælling, eliminerer behovet for at sende blod til test under ugunstige forhold forsendelse og fremskynder den kliniske beslutningsproces. Disse funktioner, i tillæg til vores nyligt udviklede procedure til isolering enkelte celler fra MCA hjælp mikrokapillærer, tillade tumorceller, der skal inddrives fra MCA til efterfølgende molekylær analyse af CTCs [29].

I denne blinde sammenligning af brug af MCA-system til det konventionelle CellSearch System for CTC tælling i patienter med lungecancer, blev MCA-systemet fandt stand til at isolere forskellige lungecancer-cellelinjer spiked inden fuldblod ved høje niveauer af effektivitet. Men MCA anlæg udføre isolering af SCLC-cellelinier lidt mindre effektivt sammenlignet med NSCLC cellelinier, hvilket viser, at små ( 8 um i diameter) celler i SCLC-cellelinier kunne passere gennem mikrohulrum under blod filtrering. I en tidligere undersøgelse [31], fandt vi, at brystet (MCF-7 og Hs578T), gastrisk (AGS og SNU-1), og kolon (SW620) tumorceller linjer, der medtager EpCAM-negative tumorceller kan med held inddrevet ved hjælp af MCA-system med mere end 80% effektivitet. Vi fandt imidlertid også, at effektiviteten af ​​udvinding af små celler (gennemsnitlig diameter 11,6 um) af tumoren cellelinien SW620 at være lidt mindre end i andre cellelinjer, som vi gjorde de SCLC celler undersøgt i denne undersøgelse linjer.

MCA-system vurderes i den foreliggende undersøgelse viste sig at besidde en højere detektion følsomhed end den CellSearch systemet i NSCLC CTC optælling, hvilket tyder overlegenhed størrelses- og deformerbarhed-baserede isoleringsteknikker sammenlignet med immunomagnetiske-baserede teknikker. Den dårlige følsomhed CellSearch er blevet tilskrevet den lave EpCAM udtryk i fremskreden NSCLC. Men en af ​​de NSCLC patienter vurderet i nærværende undersøgelse fandtes at være CTC positive ved anvendelse af CellSearch system, men CTC negativ hjælp af MCA-system, hvilket indikerer, at ændringer i EpCAM udtryk ikke alene kan forklare de konstaterede forskelle mellem de to systemer i NSCLC tælling .

CTC opdagelse sats ved hjælp af den CellSearch system SCLC patienter var 67%, hvilket er betydeligt højere end i NSCLC patienter og i overensstemmelse med den, der findes i tidligere undersøgelser [7], [34] – [36]. Selv om MCA-system ikke er afhængig af EpCAM-ekspression, hvilket cirkulerende SCLC celler er blevet rapporteret at vise høje niveauer [37], under udførelsen CTC isolation, dets anvendelse viste sig at give en høj detektionsrate, hvilket indikerer, at det kunne udnyttes til CTC detektering i ikke bare NSCLC men også SCLC patienter. Ikke desto mindre CTC tællinger af adskillige patienter var højere, når analyseret under anvendelse af CellSearch System sammenlignet med MCA-system, hvilket indikerer, at nogle små tumorceller i patienten blodet kan strømme gennem mikrohulrum, som beskrevet ovenfor. Tidligere forskning har antydet, at immunomagnetiske separationsteknikker ikke kapacitet til at isolere store klynger, hvorimod anvendelse af størrelse-baserede separationsteknikker fører til tab af små CTCs [17]. For at løse disse problemer, blev formen på mikrokaviteter i MCA ændret for at forbedre deres effektivitet i at isolere små celler fra tumorceller i fuldblod i vores seneste undersøgelse [38].

Observation af CTC klynger er blevet rapporteret i forskellige kræftformer, herunder lungekræft [23], [24], [39] – [42]. Det antages, at der dannes i klynger giver CTC celler med fordele i forhold resterende ensom i form af overlevelse, proliferative kapacitet, og evne til at danne mikrometastaser. I denne undersøgelse blev CTC klynger isoleret fra både NSCLC og SCLC-patienter, som brugte MCA-system. Interessant nok blev CTC-positive klynger identificeret som havende et lille antal CTC celler ved CellSearch system, men et stort antal af MCA-system. En af grundene til flere SCLC patienter viste sig at have en stor CTC tæller når vurderet af MCA-system kan være, at dette system muliggør isolering af større CTC klynger, der ikke kan isoleres ved immunomagnetisk separation. Undersøgelse af denne hypotese kræver yderligere detaljeret analyse af de særlige kendetegn ved CTC klynger, såsom udtryk for epitel markører og tilstedeværelsen af ​​apoptotiske celler i CTC klynger, som kunne udføres ved hjælp af MCA-system.

Det kan konkluderes, vores