PLoS ONE: honokiol Anholdelser Cell Cycle, inducerer apoptose, og forstærker den cytotoksiske virkning af gemcitabin i Human kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

overlevelsesrater for patienter med kræft i bugspytkirtlen er ekstremt fattige på grund af sin asymptomatisk progression til fremskreden og metastatisk stadie, hvor de nuværende behandlingsformer stort set ineffektive. Derfor er hidtil ukendte terapeutiske midler og behandlingsmetoder ønskes at forbedre det kliniske resultat. I denne undersøgelse, vi bestemt virkningerne af honokiol, en biologisk aktiv bestanddel af orientalsk lægeurt

Magnolia officinalis /grandiflora

på to bugspytkirtelkræft cellelinjer, MiaPaCa og Panc1, alene og i kombination med standard kemoterapeutisk lægemiddel , gemcitabin. Honokiol udøvet væksthæmmende effekter på både pancreas cancer cellelinjer ved at forårsage cellecyklusstop på G

1 fase og induktion af apoptose. På molekylært niveau, honokiol markant nedsat ekspression af cykliner (D1 og E) og cyclinafhængige kinaser (Cdk2 og Cdk4), og forårsagede en stigning i Cdk inhibitorer, p21 og p27. Desuden honokiol behandling førte til forøgelse af Bax /bcl-2-og Bax /Bd-XL-forhold til at favorisere apoptose i bugspytkirtelkræftceller. Disse ændringer blev ledsaget af forøget cytoplasmatisk akkumulering af NF-KB med et samtidigt fald i nukleare fraktion og reducerede transkriptionel aktivitet af NF-KB-responsiv promotor. Dette blev forbundet med nedsat phosphorylering af inhibitor af kappa B alpha (IKB-α) forårsager dens stabilisering og dermed øget cellulære niveauer. Vigtigere, honokiol også potenseret de cytotoksiske virkninger af gemcitabin til dels ved at begrænse gemcitabin-inducerede nuklear akkumulering af NF-KB i de behandlede pankreas cancercellelinjer. Tilsammen disse resultater viser, for første gang, den væksthæmmende effekter af honokiol inden for bugspytkirtelkræft og angive sin potentielle nytte som en ny naturlig middel i forebyggelse og terapi

Henvisning:. Arora S, Bhardwaj A, Srivastava SK, Singh S, McClellan S, Wang B, et al. (2011) honokiol Anholdelser Cell Cycle, inducerer apoptose, og forstærker den cytotoksiske virkning af gemcitabin i Human bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 6 (6): e21573. doi: 10,1371 /journal.pone.0021573

Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: Maj 11, 2011; Accepteret: Juni 2, 2011; Udgivet: 24 Jun 2011

Copyright: © 2011 Arora et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af gavebistand fra National Institutes of Health /National Cancer Institute (NIH /NCI) (CA137513) og USAMCI. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en af ​​de mest dødelige maligniteter i USA med dødeligheden stigende hvert kommende år [1], [2]. Ifølge skøn over American Cancer Society, blev 43140 amerikanere diagnosticeret med kræft i bugspytkirtlen i 2010 og 36.800 døde, mærkning dette malignitet som den fjerde hyppigste dødsårsag af kræft [2]. På grund af sin asymptomatisk progression, er pancreascancer diagnosticeret på et stadium, hvor det allerede har metastaseret eller er lokalt fremskreden [3]. Terapeutiske metoder mod fremskreden sygdom har stort set mislykkedes, og cirka 80% af patienter diagnosticeret med denne malignitet stadig dør inden 2-8 måneder [4]. Gemcitabin, et standard FDA godkendte lægemiddel til pancreascancer terapi, er rapporteret at være minimalt effektive som forbedrer patientens overlevelse ved par uger kun [3], [5]. Derfor er det af yderste vigtighed at udvikle alternative terapeutiske regimer og strategier for effektiv forvaltning af kræft i bugspytkirtlen.

Flere nye strategier, der er rettet mod vækstfremmende veje alene og i kombination med gemcitabin, er blevet testet i bugspytkirtelkræft til forbedre terapeutiske resultat [6]. Desuden har flere nylige undersøgelser identificeret dereguleret signalering elementer, såsom Ras, Akt, NF-KB, miRNA, etc., at det ikke kun fremmer kræft progression, men også give kemoresistens i bugspytkirtelkræft [7] – [9]. Induktion af disse overlevelse veje resultater fra aktivering genmutationer, tab af hæmmende veje og /eller forstærkning gennem autokrine og parakrine signalsystemer mekanismer [3], [10]. Faktisk har det nu vist sig, at målretning af visse af disse signaler knudepunkter kan være nyttige til inhibering af tumorvækst og progression samt genoprette følsomheden af ​​tumorceller over for de cytotoksiske lægemidler [3], [9], [10] .

naturlige produkter har været kernen i kræft kemoterapi for sidste mange årtier, og i virkeligheden, over 60% af de nuværende lægemidler mod cancer har deres oprindelse fra naturlige kilder [11]. I flere nylige undersøgelser har hidtil ukendte planteafledte forbindelser blevet identificeret til at virke som antitumormidler ved modulering af biologiske veje [12]. Honokiol, en biologisk aktiv biphenolic forbindelser isoleret fra

Magnolia officinalis /grandiflora har

fået betydelig opmærksomhed på grund af sin potente anti-neoplastiske og anti-angiogene egenskaber [13], [14]. Det har givet lovende data mod hud, tyktarms-, lunge- og brystkræft [13], [15] – [17]. Den slående aspekt af honokiol som et anti-neoplastisk lægemiddel er dens potentiale til at hæmme nuklear faktor kappa B (NF-KB), som er associeret med cancer celleoverlevelse og kemoresistens [9], [10], [18]. NF-KB konstitutivt aktiveret i en række hæmatologiske og faste maligne lidelser, inklusive kræft i bugspytkirtlen og styrer ekspressionen af ​​et array af gener involveret i celleproliferation og overlevelse gennem direkte og indirekte mekanismer [18] – [20]. I den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt, for første gang, virkningerne af honokiol mod kræft i bugspytkirtlen. Vores data viser, at honokiol hæmmer væksten af ​​humane bugspytkirtelkræft cellelinjer, MiaPaCa og Panc1, ved at forårsage cellecyklus arrest og induktion af apoptose. Desuden er vores studie giver evidens for en rolle honokiol i kemosensibiliserende de bugspytkirtelkræftceller at cytotoksiske virkninger af gemcitabin.

Resultater

Vækst hæmmende virkning af honokiol på humane bugspytkirtelkræftceller

To humane bugspytkirtelkræft cellelinjer nemlig. MiaPaCa og Panc1 blev anvendt som et modelsystem for at undersøge virkningen af ​​honokiol på pankreatisk vækst kræftcelle. Celler behandlet med honokiol (10-60 uM) viste ændringer i morfologi sammenlignet med vehikel (DMSO) -behandlede celler. Med stigende koncentration af honokiol, celler blev runde, indskrumpet og løsrevet fra substratet (figur 1A), i overensstemmelse med morfologiske ændringer forbundet med apoptose. Efterfølgende vi kvantificeret de cytotoksiske virkninger af honokiol ved måling levedygtighed procent under anvendelse WST-1 assay. Vores data viste, at honokiol inducerede en dosis- og tidsafhængig nedgang i væksten af ​​både de bugspytkirtelkræft cellelinjer med IC

50 værdier på ~43.25, 31,08 og 18,54 uM (mod MiaPaCa), og ~47.44, 34,17 og 21,86 uM (mod Panc1) efter 24, 48 og 72 h behandlinger henholdsvis (figur 1b). Tilsammen indikerer disse resultater, at honokiol har væksthæmmende effekter på bugspytkirtelkræftceller.

(A) MiaPaCa og Panc1 celler blev podet i brønds plade (1 x 10

5 celler /brønd) 6 og tilladt at nå 70-80% sammenløb før honokiol (10-60 uM) behandling i 48 timer. Efter behandling blev signifikant ændring i celle morfologi observeret af begge celletyper som undersøges under fasekontrastmikroskop. Celler blev runde, indskrumpet og frigjort fra celleoverfladen på en dosis-afhængig måde. Repræsentative mikrografer er fra en af ​​de tilfældige synsfelter (forstørrelse 200X) af celler behandlet med 20, 40 eller 60 uM honokiol. (B) MiaPaCa og Panc1 celler blev dyrket i 96 brønds mikrotiterplader (1 × 10

4 celler /brønd) og behandlet med honokiol (10-60 uM) ved 70-80% konfluens. Procent levedygtighed af celler måltes ved WST-1 assay efter 24, 48 og 72 timer. En OD-værdi af kontrolceller (behandlet med et tilsvarende volumen af ​​DMSO, slutkoncentration, 0,1%) blev sat til 100% levedygtighed. Honokiol inhiberede cellelevedygtighed på en dosis- og tidsafhængig måde for både de celletyper tyder antitumorvirkning af honokiol. Data er udtrykt som middelværdi ± SD; (N = 3).

honokiol forårsager G

1 fase cellecyklusstop og inducerer apoptose i bugspytkirtelkræftceller

Undertrykkelse af kræft cellevækst kan være forårsaget enten ved anholdelse af cellecyklusprogression eller på grund af induktion af apoptose eller begge [12]. Vore data om cellecyklusfordeling viste, at behandling med honokiol resulterede i berigelse af bugspytkirtelkræftceller i G

1 fase med et samtidigt fald i antallet af celler i S-fase (proliferativ fraktion) (figur 2). Vi observerede en ~1.28, 2,16 og 2,46 folder (i MiaPaCa) og ~1.08, 1,53 og 1,93 folder (i Panc1) fald i antallet af celler i S-fase ved 20, 40 og 60 pM doser honokiol, henholdsvis (figur 2 ). I apoptoseassays, demonstrerede vores data en betydelig stigning i apoptotisk indeks (PE Annexin V positiv /7AAD negative celler) i en dosisafhængig måde efter 24 timers honokiol behandling (figur 3). Ved 20, 40 og 60 uM koncentrationer af honokiol observerede vi ~1.25, 2,04 og 3,96 folder øges i apoptotiske indeks for MiaPaCa og ~1.34, 1,98 og 3,32 folder øges i apoptotiske indeks for Panc1 celler. Alt i alt, vores resultater viser, at honokiol har både cytostatiske og cytotoksiske egenskaber over bugspytkirtelkræftceller.

MiaPaCa og Panc1cells (1 × 10

6 celler /brønd) blev synkroniseret ved dyrkning i serumfrit medium i 72 timer efterfulgt af inkubering i serum-holdige medier i 24 timer og efterfølgende behandling med enten honokiol (20, 40 eller 60 uM) eller DMSO (kontrol) i 24 timer. Fordeling af celler i forskellige faser af cellecyklussen blev analyseret ved propidiumiodid (PI) farvning efterfulgt af flowcytometri. Forbedret akkumulering af MiaPaCa og Panc1 celler i G

1 fasen af ​​cellens cyklus blev observeret efter behandling med honokiol på en dosis-afhængig måde (som angivet ved flow histogrammer) med et samtidigt fald i S-fase celler.

MiaPaCa og Panc1 celler blev dyrket i plader med 6 brønde (1 x 10

6 celler /brønd) og fik lov til at nå 70-80% konfluens. Celler blev behandlet med enten honokiol (20, 40 eller 60 uM) eller DMSO (kontrol) i 24 timer og efterfølgende farvet med 7-AAD og PE Annexin V efterfulgt af flowcytometri. De lavere venstre kvadranter af hver paneler viser de levedygtige celler (negative for begge, PE Annexin V og 7-AAD). Den øverste højre kvadranter indeholder nekrotiske eller sent apoptotiske celler (positive for begge, PE Annexin V og 7-AAD). Nederste højre kvadranter repræsenterer de tidlige apoptotiske celler (PE Annexin V positive og 7-AAD negativ). Data viser en dosisafhængig stigning i antallet af apoptotiske celler i både MiaPaCa og Panc1 celler efter behandling med honokiol i sammenligning med kontrolceller, hvilket indikerer apoptotis inducerende potentiale honokiol.

honokiol ændrer ekspressionen af celle-cyklus og overlevelse-associerede proteiner

for at undersøge mekanistiske grundlag af væksthæmmende effekter af honokiol, vi næste undersøgt dens virkning på ekspressionen af ​​vigtige proteiner involveret i celleproliferation og overlevelse. Vore data viser en dosis-afhængigt fald i ekspressionen af ​​cykliner (D1 og E) og cyclinafhængige kinaser (Cdk2 og Cdk4); mens en induceret ekspression af cyclinafhængige kinaseinhibitorer (p21 og P27) blev observeret efter honokiol behandling i både MiaPaCa og Panc1 bugspytkirtelkræftceller (figur 4). Blandt overlevelse proteiner, observerede vi en dosisafhængig reduktion i niveauerne af anti-apoptotiske protein Bcl-2 og Bcl-XL, hvorimod en samtidig stigning i niveauet af pro-apoptotisk protein Bax blev observeret (figur 5A), der fører til en stigning i forholdet Bax /Bcl-2 (figur 5B, øvre panel) og Bax /Bcl-xL (figur 5B, nedre panel). Disse resultater viser, at honokiol ændrer ekspressionen af ​​proteiner involveret i reguleringen af ​​cellecyklus og apoptose til at give sin vækst hæmmende effekt.

bugspytkirtelkræftceller (MiaPaCa og Panc1) blev behandlet med enten honokiol (20, 40 eller 60 uM) eller DMSO (kontrol) i 24 timer. Totalt protein blev isoleret og underkastet immunoblotanalyse til forskellige cellecyklus-associerede proteiner (cyclin D1, cyclin E, Cdk2, Cdk4, p21 og p27). β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Intensiteter immunreaktive bånd blev kvantificeret ved densitometri. Normaliserede densitometriske værdier er angivet ved toppen af ​​båndene udviser et dosisafhængigt fald i ekspressionen af ​​cyclin D1, cyclin E, Cdk2 og CDK4 og stigning i ekspressionen af ​​cyclin-hæmmere; p21 og p27, efter udsættelse for honokiol, i begge celletyper.

(A) MiaPaCa og Panc1 celler blev behandlet med enten honokiol (20, 40 eller 60 uM) eller DMSO (kontrol) i 24 timer. Immunoblotting blev udført i Bd-XL, Bcl-2 og Bax proteiner efterfulgt af densitometri af immunoreaktive bånd. Normaliserede densitometriske værdier er angivet ved toppen af ​​båndene. (B) Bar diagram opsummerer virkningerne af honokiol behandling på Bax /Bcl-2-forhold (øvre panel) og Bax /Bcl-XL-forhold (nederste panel). Dataene tyder på, at honokiol inducerer apoptose ved opregulering pro-apoptotisk Bax og nedregulering antiapoptotiske bcl-2 og Bd-xL proteiner.

honokiol dæmper konstitutiv aktivering af NF-KB i humane bugspytkirtelkræftceller

NF-KB er konstitutivt aktiv i mange cancertyper, herunder pancreascancer [18] – [20], og det har vist, at aktiveringen af ​​denne signalering node letter cellecyklusprogression [21] og apoptotisk resistens [22 ]. Derfor undersøgte vi, om behandlingen af ​​bugspytkirtelkræftceller med honokiol har en indvirkning på NF-KB-aktivering i bugspytkirtelkræftceller. Vi undersøgte først virkningen af ​​honokiol på den transkriptionelle aktivitet af NF-κB- responsiv promotor i en luciferase reporter assay. Vores data viste en dosisafhængig reduktion i transkriptionsaktivitet af NF-KB (~1.40, 2,08 og 4,0 folder i MiaPaCa, og ~1.29, 1,96 og 5,26 folder i Panc1 celler) ved 20, 40 og 60 uM af honokiol behandling henholdsvis (Figur 6A). For yderligere at understøtte denne observation, vi næste studerede den cellulære lokalisering (cytoplasmatisk vs. nukleare) p65 subunit af NF-KB. Vores immunoblot data viste, at honokiol behandling forårsagede en markant og dosisafhængig reduktion i NF-KB-niveauer i den nukleare brøkdel af både MiaPaCa og Panc1 bugspytkirtelkræftceller med en samtidig stigning i cytoplasmatiske fraktion (figur 6B). Cellulær fordeling af NF-KB styres af relative ekspression af dets biologiske inhibitor IKB, hvilket holder NF-KB afsondret i cytoplasmaet i en inaktiv kompleks [23]. Derfor har vi analyseret de cytoplasmatiske ekstrakter af honokiol-behandlede bugspytkirtelkræftceller til bestemmelse af IKB-α-niveau. Vores data viste en dosisafhængig stigning i niveauet af IKB-α ved honokiol-behandling (figur 6B). Dette var forbundet med en samtidig reduktion af IkB-α phosphorylering indikerer øget stabilisering af IkB-α efter udsættelse for honokiol. Sammenlagt indikerer vore data, at honokiol undertrykker konstitutiv aktivering af NF-KB i pankreatiske cancerceller.

(A) MiaPaCa og Panc1cells (0,5 × 10

6 celler /brønd) blev podet i 12-brønds plade . Næste dag ved 60% konfluens, blev cellerne co-transficeret med NF-KB luciferase reporter og TK-Renilla luciferase (kontrol) plasmider. Fireogtyve timer efter transfektion blev celler behandlet med honokiol (20, 40, eller 60 uM) for næste 24 timer. Proteinlysater blev foretaget, og luciferase (Fire-fly, test og Renilla, transfektion effektivitet kontrol) aktivitet vurderes ved hjælp af en dual-luciferase analysesystem. Dataene er angivet som normaliseret fold-ændring i luciferaseaktivitet (middel ± SD, n = 3, * p 0,05). (B) I alt blev nukleare og cytoplasmiske ekstrakter fremstillet fra celler behandlet med honokiol (20, 40, eller 60 uM) i 6 timer og ekspression af NF-KB /p65, p-IkB-α (S32 /36) og IκB- α bestemtes ved Western blot-analyse. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Intensiteter immunreaktive bånd blev kvantificeret ved densitometri. Normaliserede densitometridata værdier er angivet ved toppen af ​​båndene indikerer en formindsket lokalisering af NF-KB /p65 i kernen med en samtidig stigning i cytoplasmaet. I modsætning hertil blev der udtryk for p-IKB-α faldt fører til øgede niveauer af IKB-α. Tilsammen disse data tyder klart på, at honokiol hæmmer NF-KB-aktivitet gennem stabilisering af IKB-α.

honokiol chemosensitizes de bugspytkirtelkræftceller for gemcitabin toksicitet

Gemcitabin er den eneste FDA- godkendt kemoterapeutisk lægemiddel mod kræft i bugspytkirtlen; Men det er stadig minimalt effektivt grundet kemoresistens [3], [5], [10]. Da aktivering af NF-KB betragtes som en af ​​de mekanismer potentierende kemoresistens, vi undersøgt, om honokiol ville fungere som en chemosensitizer i bugspytkirtelkræftceller. Bugspytkirtelkræftceller (MiaPaCa og Panc1) blev behandlet med gemcitabin alene eller i kombination med at sub-IC

50 koncentrationer af honokiol og effekt på væksthæmning blev undersøgt ved hjælp af cellernes levedygtighed assay. Vores data viste, at gemcitabin hæmmede væksten af ​​bugspytkirtelkræftceller på en dosis-afhængig måde og kombineret behandling med honokiol førte til en betydelig reduktion i IC

50 gemcitabin (figur 7A). Ved 10 og 20 pM doser honokiol henholdsvis en ~1.53 og 2,41 gange (i MiaPaCa) og ~1.40 og 2,08 gange (i Panc1) fald i IC

50 af gemcitabin blev observeret symboliserer kemosensibiliserende virkning honokiol (figur 7A). For at identificere en rolle af NF-KB, undersøgte vi dens cellulære lokalisering i gemcitabin (alene eller i kombination med honokiol) -behandlede bugspytkirtelkræftceller. Vores data viste en forøget akkumulering af NF-KB i nuklear rum og et ledsagende fald i cytoplasmatisk fraktion med stigende doser af gemcitabin i både MiaPaCa og Panc1 celler (figur 7B). Især observerede vi, at honokiol (selv ved 20 uM dosis) var effektiv til inhibering af gemcitabin-induceret aktivering af NF-KB i både MiaPaCa og Panc1 celler (Figur 7C). Disse resultater tyder klart, at honokiol forstærker den anti-tumor effekt af gemcitabin ved at fungere som en kemo-sensibilisator i bugspytkirtelkræftceller.

(A) MiaPaCa og Panc1 celler blev dyrket i 96 godt mikrotiterplader (1 × 10

4 celler /brønd). Ved sub-konfluens, blev celler behandlet med gemcitabin (1,25-40 uM) alene eller i kombination med honokiol (10 eller 20 uM) i 48 timer. Procent levedygtighed blev målt ved WST-1 assay. Data er præsenteret som relativ procent levedygtighed i forhold til ubehandlede eller honokiol kun-behandlede celler til kontrol for vækst undertrykkende virkninger af honokiol (gennemsnit ± SD, n = 3. *, p 0,05). Et signifikant fald i IC

50 værdier af gemcitabin blev observeret i celler co-behandlet med honokiol. (B) Celler blev behandlet med gemcitabin (5, 10 og 20 uM) i 6 timer og ekspression af NF-KB /p65 i nukleare, blev cytoplasmatiske og totale cellelysater bestemt ved Western blot analyse. Gemcitabin behandling af celler resulterede i forøget cellekerneakkumulering af NF-KB /p65 på en dosisafhængig måde (C) Nuclear og cytoplasmiske ekstrakter blev fremstillet ud fra celler behandlet med gemcitabin (10 uM), honokiol (20 uM) alene eller i kombination til 6 h. Ekspression af NF-KB /p65 med nukleare, cytoplasmatiske og totale cellelysater blev bestemt ved Western blot analyse. Data viser, at honokiol co-behandling begrænsede gemcitabin-induceret NF-KB /p65 kerneakkumulation. Sammen disse resultater tyder på, at honokiol virker som en chemosensitizer og øger de cytotoksiske virkninger af gemcitabin i bugspytkirtelkræft.

Diskussion

Kræft i bugspytkirtlen er stadig en ødelæggende malignitet på grund af manglende effektiv behandling til behandling [3]. Den foreliggende undersøgelse viste, at honokiol (en naturlig biphenolic forbindelse) er effektive til at undertrykke væksten af ​​humane pancreatiske cancerceller (MiaPaCa og Panc1) på grund af dets cytostatiske og cytotoksiske egenskaber. Desuden er vores studier fremlagt beviser for en rolle honokiol i kemosensibiliserende de bugspytkirtelkræftceller til gemcitabin toksicitet. Honokiol hæmmede NF-KB-aktivitet og forårsagede ændret udtryk for mange cellecyklus og overlevelse-associerede proteiner giver sin vækst undertrykkende og kemosensibiliserende virkninger i bugspytkirtelkræftceller.

Dereguleret vækst i kræftceller ofte tilskrives tab af kontrol i proliferative og apoptotiske veje [24]. Faktisk har molekylære undersøgelser viste, at ekspressionen af ​​cellecyklus regulatorer og proteiner associeret med celleoverlevelse ofte ændres i flere humane cancere [25] – [27]. Cell cyklus er reguleret af samordnede aktioner af cycliner, cyclin-afhængige kinaser (CDK) og cdk’er hæmmere [26], [28]. Vi observerede, at behandling af pankreatiske cancerceller med honokiol resulterede i G

1-fasen af ​​cellecyklusprogression, sammen med reduktionen i cyclin D1, cyclin E, Cdk2 og CDK4 og stigning i p21 og p27 på proteinniveauet. Cyclin D1 og dets katalytiske partner Cdk4 dominerer i G

1 fase, mens cyclin E og Cdk2 kompleks regulerer celle-cyklus progression fra G

1 til S [26], [28]. Derfor er vores resultater viser, at den honokiol-inducerede standsning af bugspytkirtelkræftceller i G

1 cellecyklusfase kan medieres via nedregulering af cycliner og Cdk’er sammen med opregulering af p21 og P27-proteiner, som danner heterotrimere komplekser med G

1-S Cdk’er og cycliner at hæmme deres aktivitet [29]. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser om effekten af ​​honokiol i menneskelig lymfoide leukæmi, skællede lungekræft og brystkræft celler [16], [17], [30].

Efter G

1- fase cellecyklusstop kan celler enten undergå reparation eller indtaste den apoptotiske vej til at opretholde cellulær integritet og eliminering af begået en fejl /muterede præmaligne og neoplastiske celler [31]. Således induktionen af ​​apoptose er en af ​​de beskyttende mekanismer mod kræft initiering og progression og cancerceller har ofte erhvervet resistens over for apoptose [24]. I den foreliggende undersøgelse, observerede vi signifikant induktion af apoptose i honokiol-behandlede bugspytkirtelkræftceller indikerer, at honokiol er i stand til at forstærke den apoptotiske maskineri. Celleoverlevelse vedligeholdes af en fin balance af forholdet mellem pro-apoptotiske (f.eks Bad og Bax) og anti-apoptotiske proteiner (f.eks Bcl-2 og Bcl-XL), der styrer processen af ​​apoptose gennem frigivelse af caspaser [ ,,,0],32], [33]. Derfor ændret ekspression af Bcl-2-familien proteiner observeret ved honokiol behandling af pankreatiske cancerceller på en måde, der favoriserer stigningen i forholdene mellem Bax /Bcl-2 og Bax /Bcl-xL kunne ligge til grund den observerede apoptotiske virkning af honokiol. Deregulering af apoptose-relaterede proteiner er også blevet rapporteret i chondrosarcoma celler efter honokiol behandlingen yderligere støtte for dets rolle i apoptoseinduktion [34].

Vi har også observeret inhibering af NF-KB-aktivitet ved honokiol behandling, som var forbundet med hæmning af IKB-α phosphorylering og samtidig stigning i sit udtryk. Transkriptionsfaktor NF-KB konstitutivt aktiveret i flere maligniteter og er blevet rapporteret at være patologisk impliceret i pancreascancer [18] – [20]. Nylige undersøgelser har vist, at væksten-undertrykkende virkning af honokiol i prostata og tyktarmskræft medieres gennem inhibering af NF-KB [35]. NF-KB-transkriptionsfaktoren er sammensat af heterodimerer bestående af Rel (p65, c-Rel og RelB), p52, og P50-proteiner og er lokaliseret i cytoplasmaet i sin inaktive form i kompleks med IkB (inhibitor af NFKB bestående af α og β-underenheder, som maskerer dets nukleare lokaliseringssignal [36]. Aktivering af NF-KB er forårsaget, når IkB-α bliver phosphoryleret af IKK (inhibitor kinase) -kompleks fører frem til dets ubiquitinering og nedbrydning. Dette resulterer i frigivelsen af ​​NFKB fra cytoplasmaet og transport ind i kernen efterfulgt af aktivering af NF-KB-responsive promotor. NF-KB er kendt for at inducere ekspressionen af ​​cyclin D1, Bcl-2 og Bcl-xL (ændret ved honokiol behandling i aktuelle undersøgelse) sammen med en række af proteiner involveret i celleproliferation og overlevelse [37], [38]. Derfor kan det foreslås, at vækst suppression af bugspytkirtelkræftceller ved honokiol medieres gennem inhibering af NF-KB.

Klinisk resultat i bugspytkirtelkræft er forblevet fattige grundet avanceret og metastatisk tilstand af sygdommen på diagnosetidspunktet og ineffektivitet af tilladte lægemiddel-behandling på grund af kemoresistens [3], [5], [10]. I øjeblikket gemcitabin er den nationale standard kemoterapeutiske stof til kræft i bugspytkirtlen behandling. Gemcitabin interfererer med DNA-syntese, der fører til cellecyklusstop og apoptose i ultimativ kursus [39], [40]. En af de mekanismer, der begrænser gemcitabin virkning induceret aktivering af NF-KB som reaktion på behandlingen [41], som kan forårsage apoptotisk forsinkelse eller undertrykkelse. I denne undersøgelse har vi vist kemosensibiliserende virkning honokiol på bugspytkirtelkræftceller til gemcitabin toksicitet. Derudover viste vi, at gemcitabin induceret nukleare akkumulering af NF-KB, som kunne inhiberes effektivt ved co-behandling med honokiol. Disse parallelle fund indikerer, at hæmning af NF-KB-aktivitet også kan mediere chemosensitization af bugspytkirtelkræftceller ved honokiol. Faktisk er det blevet rapporteret tidligere, at anti-cancer effekter af kemoterapeutiske midler kan forstærkes ved inhibering af NF-KB-aktivitet [22], [41].

Som konklusion har vi vist, for første gang vækstinhiberende og kemosensibiliserende potentiale honokiol i bugspytkirtelkræft. Honokiol forårsager G

1 fase cellecyklusstandsning og induktion af apoptose ved at ændre ekspressionen af ​​cellecyklus og overlevelse associerede proteiner. Inhibering af NF-KB kan være en af ​​de væsentlige mekanismer i honokiol-induceret vækst undertrykkende og kemosensibiliserende virkninger i bugspytkirtelkræftceller. Vi tror derfor, at honokiol kunne være et hidtil ukendt lovende naturligt middel til behandling af kræft i bugspytkirtlen og kan også tjene som en chemosensitizer at forbedre den terapeutiske effektivitet af gemcitabin, som allerede er i klinisk anvendelse som et terapeutisk lægemiddel.

materialer og metoder Salg

Reagenser

Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) og Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) medium blev indhentet fra Thermo Scientific (Logan, UT). Føtalt-bovint serum (FBS) var fra Atlanta Biologicals (Lawrenceville, Georgien). Penicillin, streptomycin og trypsin-EDTA blev indkøbt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Honokiol blev indkøbt fra LKT Laboratories (St. Paul, MN). Gemcitabin blev leveret af USAMCI apotek. FuGENE transfektion reagens, fosfatase /proteasehæmmere cocktail og celledeling reagens WST-1 blev indkøbt fra Roche Diagnostics (Mannheim, Tyskland). Propidiumiodid /RNAse farvning puffer og PE Annexin V apoptose afsløring kit blev indkøbt fra BD Bioscience (San Diego, CA). Nuklear ekstrakt kit blev indkøbt fra Active Motif, LLC (Carlsbad, CA). Antistoffer mod Bcl-2, Bax og p-IkB-α (Ser32 /36) (kanin polyklonale), Bcl-xl og NF-KB /p65 (kanin monoklonale), og IkB-α (muse monoklonalt) blev opnået fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffer mod p21, blev Cdk4 (monoklonalt muse), p27, cyclin D1, cyclin E, Cdk2 (kanin polyklonale), og peberrodsperoxidase-konjugeret sekundære antistoffer indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). p-actin (muse monoklonalt) antistof blev købt hos Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). ECL plus western blotting afsløring kit blev indkøbt fra Thermo Scientific. pGL4.32 [luc2P /NF-KB-Re /Hygro] plasmid, pRL-TK plasmid og Dual Luciferase Assay System kit var fra Promega (Madison, WI).

Cellekultur og behandlinger

De humane pancreas cellelinier MiaPaCa og Panc1 (ATCC, Manassas, VA) blev opretholdt i kultur som adhærerende monolag i RPMI-1640 og DMEM henholdsvis suppleret med 10% (v /v) FBS, penicillin (100 enheder /ml) og streptomycin (100 ug /ml). Celler blev holdt i 5% CO

2 befugtet inkubator ved 37 ° C. Vækst medium blev skiftet hver 3 dage og cellerne blev delt (01:03), når de nåede 80% sammenløb. For behandlinger blev stamopløsning af honokiol (10 mmol /l) fremstillet i DMSO, opbevaret ved -20 ° C og fortyndet med frisk komplet medium umiddelbart før anvendelse. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af honokiol alene, gemcitabin alene eller i kombination (som specificeret i figurteksterne). Et tilsvarende volumen af ​​DMSO (slutkoncentration, 0,1%) blev tilsat til kontrollen Salg

Cellevækst assay

Celler blev podet i 96 brønds plader (1 × 10

4. celler /brønd) en dag forud for behandling. Cellelevedygtighed i de behandlede celler blev undersøgt efter 24-72 timer ved at anvende WST-1 (4- [3- (4-iodphenyl) -2- (4-nitrophenyl) -2H-5-tetrazolio] -1, 3-benzen di-sulfonat) assay kit pr producentens anvisninger med passende kontroller. Dette assay er baseret på spaltningen af ​​WST-1 i metabolisk aktive celler til dannelse vandopløseligt formazan. Absorbansen af ​​formazan blev målt ved en bølgelængde på 450 nm, med baggrundssubtraktion ved 630, under anvendelse af en Bio-Rad Benchmark mikropladelæser (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Væksten blev beregnet som procent levedygtigheden = [(A /B) × 100], hvor A og B er absorbansen af ​​behandlede og kontrol celler.

Cell-cyklus analyse

Effekten af honokiol behandling på cellecyklusprogression blev bestemt ved flowcytometri efter farvning med propidiumiodid (PI). Kort fortalt blev celler (1 x 10

6 celler /brønd) blev podet i 6 brønds plade og synkroniseret ved dyrkning deraf i serumfrit medium. Efter 48 timer blev mediet erstattet med komplet medium indeholdende ønskede koncentrationer af honokiol eller DMSO. Flydende og vedhæftede celler blev opsamlet efter 24 timers behandling og fikseret i 70% ethanol natten over ved 4 ° C. Cellerne blev derefter farvet med propidiumiodid under anvendelse PI /RNase-farvning buffer i 1 time ved 37 ° C. Farvede celler blev analyseret ved flow-cytometri på en BD-FACS Canto ™ II (Becton-Dickinson, San Jose, CA) til beregning af den procentuelle cellepopulationen i forskellige faser af cellecyklus ved hjælp Mod Fit LT-software (Verity Software House, Topsham