PLoS ONE: Angivelse af SATB1 Fremmer vækst og metastaser af kolorektal cancer

Abstrakt

Special AT-rige sekvens-bindende protein-1 (SATB1) er blevet identificeret som et genom organisator, der omprogrammerer kromatin organisation og transskription profiler. SATB1 fremmer tumorvækst og metastase i brystkræft og er forbundet med dårlig prognose i flere kræfttyper. Sammenhængen mellem SATB1 og kolorektal cancer (CRC) er ikke blevet undersøgt intensivt. Derfor er denne undersøgelse havde til formål at undersøge effekten af ​​SATB1 på CRC vækst og metastase in vitro og in vivo og dens sammenhæng med den samlede overlevelse og klinisk-patologiske faktorer i CRC patienter. Stabil SATB1 knockdown og SATB1-overekspression cellelinier blev etableret. SATB1 knockdown nedsat cellevækst, kolonidannelse, migration og invasion og øget apoptose i CRC celler in vitro (p 0,05), hvorimod SATB1 overekspression haft den modsatte effekt. SATB1 overekspression øget tumorvækst og metastase til lungen og leveren in vivo ved hjælp af xenograft dyremodeller (p 0,05). Således SATB1 fremmet en aggressiv CRC fænotype in vitro og in vivo. Immunohistokemisk analyse af 560 CRC prøver viste, at SATB1 ekspression var betydeligt højere i CRC væv end i matchede ikke-tumor mucosa (p 0,001). Desuden SATB1 ekspression var signifikant højere hos patienter med dårligt differentieret tumorer, højere invasion dybde, fjernt metastase, og avanceret TNM stadie. SATB1-positive patienter havde en dårligere prognose end SATB1-negative patienter, og SATB1 blev identificeret som en selvstændig prognostisk faktor for CRC (p = 0,009). Slående, vi også vurderet SATB2 udtryk i CRC og fandt, at SATB2 blev mere rigeligt udtrykt i ikke-kræft slimhinder sammenlignet med kolorektal cancer væv (p 0,001). Men SATB2 udtryk havde ingen indflydelse på prognosen af ​​CRC patienter (p = 0,836). SATB1 udtryk var signifikant associeret med kortere overlevelsestid enten i SATB2-positive patienter eller i SATB2-negative patienter (p 0,001). Afslutningsvis vores resultater viste en vigtig rolle for SATB1 i CRC tumorgenese og metastase. Derfor kan SATB1 er en vigtig prognostisk biomarkør og terapeutisk mål for CRC

Henvisning:. Zhang Y, Tian X, Ji H, Guan X, Xu W, Dong B, et al. (2014) Angivelse af SATB1 Fremmer vækst og metastaser af kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (6): e100413. doi: 10,1371 /journal.pone.0100413

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Modtaget: September 15, 2013; Accepteret: 28. maj 2014 Udgivet: 27 juni 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science finansiering (No: 81.272.765), Capital Karakteristisk Clinical Application Research (No: Z121107001012083), Key Project of Capital Fund Medical Development (No: 2009-2095), Beijing Municipal Natural Science Foundation (No: 7.122.030) , Beijings Udestående Talenter tilskudsordning (215 Program, No: 2009/02/18), Special Project of Beijing “tiere, hundreder og tusinder” Sundhed Talentsand midler fra Beijing Cancer Hospital (No: 10-04). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er den tredje hyppigste årsag til kræft-associerede dødsfald i USA [1] og den næstmest udbredte kræft i Kina [2]. Ca. 15-25% af CRC patienterne oplever synkrone levermetastaser, og 80-90% af disse patienter har inoperabel metastatisk leversygdom [3]. Metastatisk leversygdom er den største dødsårsag i CRC patienter [4]. Derfor er der et presserende behov for at identificere følsomme og specifikke molekylære markører til at forudsige CRC metastaser. Yderligere forståelse af de underliggende mekanismer af CRC metastase er afgørende i identifikationen af ​​biomarkører for metastatisk progression i CRC.

Special AT-rige sekvens-bindende protein-1 (SATB1) er en vævsspecifik nuklear protein, der er overvejende udtrykt i thymocytter [5], og blev oprindeligt anerkendt for sin afgørende rolle i ordentlig T-celle udvikling [6] – [8]. SATB1 binder særlige AT-rige anker sites omskriver heterochromatin at danne en “bur-lignende” funktionel nukleare arkitektur, der fungerer som en landing platform for kromatin-remodeling faktorer. Derfor kan SATB1 netværket regulere genekspression ved ændring af funktionelle organisation af DNA-sekvensen [9], [10]. SATB1 er for nylig blevet rapporteret at være et genom organisator. SATB1 ekspression markant ændret ekspression af over 1000 brystkræftgener herunder metastase-associerede gener og tumorsuppressorgener at fremme vækst og metastase af brysttumor [11]. Desuden viste multivariat overlevelsesanalyse, at SATB1 var en uafhængig prognostisk faktor for brystkræft [11]. SATB1 overekspression har også været forbundet med dårlig prognose i larynx pladecellecarcinom [12], gastrisk cancer [13], [14], og malign kutan melanom [15]. Sammenhængen mellem SATB1 og kolorektal cancer (CRC) er fortsat uklar

I denne undersøgelse, vi demonstrerede inddragelse af SATB1 i CRC vækst og metastase baseret på følgende beviser:. (A) SATB1 overekspression blev påvist i både CRC cellelinjer og CRC tumorer (b) vækst og kolonidannelse satser blev nedreguleret i SATB1-knockdown celler, men op reguleret i SATB1-overekspression celler, (c) migration og invasion kapaciteter var langt fattigere i SATB1-knockdown celler, hvorimod mere aggressiv i SATB1-overudtrykkende celler, (d) SATB1 overekspression fremmes carcinogenese og metastase in vivo ved anvendelse af dyremodeller, (e) ekspressionen af ​​SATB1 protein var mere rigelige i CRC væv end i matchede ikke-cancervæv, og (f) SATB1 ekspression viste sig at være en uafhængig prognostisk faktor for CRC patienter.

Materialer og metoder

2.1 cellelinjer og Cell Culture

SW480, SW620, HT-29, HCT116, RKO og LoVo CRC cellelinjer blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC) og Chinese Academy of Medical Sciences Peking Union Medical College, og alle cellelinier blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; GibcoBRL, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), streptomycin (100 ug /ml) og penicillin (100 ug /ml). Alle cellelinjer blev dyrket ved 37 ° C under 5% CO

2.

2.2 Etablering af Stable SATB1-knockdown cellelinier

Tre korte hårnål RNA (shRNA) sekvenser blev udformet baseret på SATB1 sekvensen (NM_002971) identificeret ved shRNA Target Finder (Ambion, Life Technologies, Carlsbad, Californien): shRNA1 (2566), 5′-GTCCACCTTGTCTTCTCTC-3 ‘; shRNA2 (2364), 5’-AAGGACAATTCCGGTTTAGAG-3 ‘; og shRNA3 (2797), 5’-AAAGTGTGTACCCCGTAAGCA-3 ‘. De oligoduplexes blev klonet ind i pSilencer3.1 vektor (Ambion, Life Technologies, Carlsbad, Californien). De resulterende konstruktioner blev transficeret i LoVo celler eller RKO celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, Californien) ifølge producentens anvisninger. Celler transficeret med tom vektor (pSilencer3.1) blev anvendt som kontroller. Stabile shRNA transfektanter blev udvalgt ved dyrkning med 600 ug /ml G418 (GibcoBRL) i 3 uger. RT-PCR, western blot, og immunfluorescensfarvning blev brugt til at bekræfte nedregulering af SATB1 udtryk.

2.3 Etablering af Stabile SATB1-overekspression cellelinier

Fuld-længde human SATB1 cDNA blev klonet ind i pcDNA3.1 ekspressionsvektor (Ambion, Life Technologies, Carlsbad, Californien). SW480-celler blev transficeret med SATB1-pcDNA3.1 eller tom vektor (pcDNA3.1) som kontrol. Transfektanter med stabil SATB1 overekspression blev udvalgt ved dyrkning med 600 ug /ml G418 i 3 uger. RT-PCR, Western blot, og immunfluorescensfarvning blev anvendt til at bekræfte opregulering af SATB1 ekspression.

2.4 Patienter og prøver

CRC tumorvæv blev opnået fra 560 patienter, der var diagnosticeret og behandlet i Department of Surgery, Peking University School of Oncology mellem 2005 og 2008. Ingen af ​​patienterne har modtaget kemoterapi eller strålebehandling inden operationen. Fem-hundrede og fyrre-to af disse patienter blev fulgt op postoperativt, over en periode på mindst 3 år. Og detaljeret klinisk-patologisk oplysninger blev indhentet fra 520 patienter. Frisk colorektal tumor og matchede normale kolorektal mucosa prøver blev opnået fra 21 patienter. Prøver blev hurtigt nedfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil analyse. Histopatologiske analyser blev udført uafhængigt af to patologer. Til brug for klinisk materiale til forskningsformål, godkendelse fra de regionale etiske komitéer, Beijing Cancer Hospital, Kina blev opnået. Skriftligt informeret samtykke er opnået fra alle deltagere. Den kliniske undersøgelse blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen.

2.5 Udvinding af Total RNA og Reverse Transcription-polymerasekædereaktion

SATB1 mRNA-ekspression blev bestemt ved revers transkription-polymerase kædereaktion (RT-PCR). Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, Californien) ifølge producentens instruktioner. cDNA blev syntetiseret ud fra det ekstraherede RNA (4 pg) ved anvendelse af EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (Invitrogen). PCR-amplifikation blev udført under anvendelse af følgende SATB1 og beta-actin genspecifikke primere: SATB1, 5′-AGAGGAAGGCTTGGGAGTA-3 ‘(sense) og 5′-GGGCAGCAGAGCTATGTG-3′ (antisense); og Beta-actin, 5’-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3 ‘(sense) og 5′-ACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’ (antisense). Beta-actin blev anvendt til at normalisere SATB1 genekspression. Otteogtyve PCR-cykler blev udført, hvor hver cyklus bestod af præ-denaturering ved 94 ° C i 3 minutter, denaturering ved 94 ° C i 45 s, annealing ved 55 ° C i 45 s og ekstension ved 72 ° C i 45 s , og efter de 28 cyklusser er en endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 min. PCR-produkter blev separeret ved gelelektroforese på 2% agarosegel farvet med ethidiumbromid. Band intensitet blev målt direkte på en Alpha Imager 2200 analysesystem (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).

2.6 Western blot analyse

Celler og friske væv blev lyseret i 1 × natrium dodecylsulfat (SDS) lyseringsbuffer. Lige mængder af total protein blev separeret ved SDS-PAGE, elektrooverført på polyvinylidendifluorid-membraner (Pall Corporation, Mexico City, Mexico) og inkuberet natten over ved 4 ° C med en SATB1 kanin-polyklonalt antistof (1:500 fortynding PRS4631; Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA). Beta-actin (1:10000, Sigma-Aldrich) blev anvendt som en loading kontrol. Protein bands blev evalueret ved forøget kemiluminescens (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA).

2.7 immunfluorescensfarvning og Laser-scanning konfokalmikroskopi

Celler blev dyrket på dækglas, fikseret med 4 % paraformaldehyd, permeabiliseret under anvendelse af 0,1% Triton X-100, vasket og blokeret med 5% bovint serumalbumin. Cellerne blev inkuberet med SATB1 primært antistof (1:100, PRS4631, Sigma-Aldrich) efterfulgt af inkubation med et rhodamin-konjugeret sekundært antistof (1:50; Zhongshan Golden Bridge Biotechnology, Beijing, Kina). Dækglas blev monteret med Vectashield mounting medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) indeholdende diamidino-2-phenylindol (DAPI) nuklear farvning og undersøgt under et fluorescensmikroskop, så billederne blev konstrueret ved anvendelse af en software (LAS AF 2.2.1 versionen , TCSSP5, Leica, Tyskland).

2.8 Cell Growth

Cellevækst blev evalueret ved 3- (4,5-methylthiozol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay. Celler (3 x 10

3 celler /brønd) blev podet i plader med 96 brønde og dyrket i 24, 48, 72 og 96 timer. MTT (10 pi) blev tilsat til hver brønd, og cellerne blev dyrket i yderligere 4 timer. Dyrkningsmediet blev fjernet, og 200 pi DMSO (Amresco Inc., Solon, OH, USA) blev tilsat til hver brønd. Absorbansen ved 570 nm blev målt med en mikropladelæser (iMark, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Cell vækstkurver blev konstrueret ved at plotte absorbans (slettet af DMSO) mod tiden.

2.9 Apoptose og flowcytometrianalyse

Stabil SATB1-overekspression, SATB1-knockdown, og tomme vektor kontrol celler (1 × 10

6 celler) blev dyrket i 60-mm skåle i 48 timer og høstet. Cellerne blev mærket med propidiumiodid og AnnexinV. Negative kontroller bestod af ikke-mærkede celler og passende isotypekontroller. Et minimum af 10.000 begivenheder for hver prøve blev indsamlet og analyseret ved hjælp af et flowcytometer. (FACSAria, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)

2,10 Cell Cycle Analysis ved flowcytometri

Stabil SATB1 overekspression, SATB1-knockdown, og tomme vektor kontrolceller blev dyrket i 60 mm skåle og serumudsultet i 24 timer. Celler blev derefter dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS i 48 timer. Levedygtige celler blev høstet, fikseret i 70% ethanol og analyseret ved flowcytometri.

2.11 blød agar-kolonidannelse

Stald SATB1-overekspression, SATB1-knockdown, og tomme vektor kontrol celler (3 x 10

3) blev resuspenderet i DMEM indeholdende 3 ml 0,4% agarose, 20% FBS, 0,5 mM natriumpyruvat, 10 m MHEPES, og 1% penicillin /streptomycin og lagt oven på 4 ml 0,8% agarose i DMEM på 60 mm skåle. Efter 3 uger blev kolonier talt og fotograferet.

2.12 sårheling Assay Salg

Stald SATB1 overekspression, SATB1-knockdown, og tomme vektor kontrolceller blev dyrket i 60 mm skåle, indtil cellen tæthed nåede 90% sammenløb. En vandret sår blev oprettet ved hjælp af en steril 10-uL mikrospids. Cellerne blev vasket med phosphatpufret saltvand (PBS) for at fjerne cellerester. Tre forskellige områder i hver skål blev udvalgt til at sammenligne afstanden migrerende celler fra såret oprindelse. Billeder blev taget til fange ved 0 og 24 timer til at vurdere sårlukning.

2.13 Transwell Migration og Invasion Analyser

Stabil SATB1-overekspression, SATB1-knockdown, og tomme vektor kontrol celler (1 x 10

5) blev suspenderet i 200 pi serumfrit medium og podet ind i det øvre kammer i et Transwell insert med en 8-um porestørrelse membran (Corning Costar Corp., Cambridge, MA, USA). DMEM indeholdende 10% FBS blev anbragt i det nedre kammer som en kemoattraktant. Efter inkubation i 24 timer blev ikke-migrerede celler i det øverste kammer i transwell insertet fjernes med en vatpind, og de migrerede celler på undersiden af ​​filtermembranen blev fikseret og farvet med 0,1% krystalviolet. Antallet af migrerede celler blev talt i 5 tilfældigt udvalgte mikroskopiske felter og fotograferet. Den anvendte protokol for invasionen assay var den samme som den, der anvendes for migration assay, bortset fra at transwell insertet blev coatet med Matrigel (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland).

2.14 In vivo Carcinogenesis

Stald SATB1-overudtrykkende og tomme vektor kontrol celler (2 x 10

6) i 100 pi Hanks balancerede saltopløsning (HBSS; GibcoBRL, Life Technologies) blev injiceret i 5 kvindelige 4 uger gamle BALB /c athymiske mus . SATB1-overudtrykkende og tom vektor kontrolceller blev injiceret subkutant i venstre og højre dorsale flanke af hver mus hhv. Tumorvolumener blev målt to gange ugentligt, og musene blev aflivet efter 4 uger. Tumorer blev udskåret, målt og vejet. Tumorer blev fikseret i 10% formalin til histopatologisk analyse eller opbevaret ved -80 ° C til RT-PCR og western blot. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med relevante nationale og internationale retningslinjer. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i Peking University School of Oncology (Permit Nummer: 2012-07). Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

2,15 Xenograft Animal Model of Lung og levermetastaser

Vi bestemmes effekten af ​​SATB1 udtryk på CRC metastaser i xenograft musemodeller for lunge og levermetastaser. I levermetastaser model, encellede suspensioner af stabile SATB1-overudtrykkende og tomme vektor kontrol celler (2 x 10

6) i 100 pi HBSS blev langsomt injiceret i milten hos BALB /c athymiske mus under anæstesi. I lunge metastase, encellede suspensioner af SATB1-overudtrykkende og tomme vektor kontrol celler (2 x 10

6) i 100 pi HBSS blev injiceret i den laterale halevene. Fem mus blev inkluderet i hver behandlingsgruppe. Mus blev aflivet 8 uger efter injektion, og milt, lever og lunger blev kirurgisk udskåret. Antallet og størrelsen af ​​metastatiske foci i leveren og lungen blev dokumenteret. Prøver blev fikseret i 10% formalin eller opbevares ved -80 ° C til fremtidig analyse.

2,16 immunhistokemisk analyse af væv Microarrays

formalin-fikseret, paraffin-indlejret kolorektal tumor og tilstødende normale kolorektal mucosa prøver blev konstrueret i væv microarrays (TMAS). TMA blok sektioner (4 um) blev afparaffiniseret og rehydreret i gradueret alkohol. Antigen genfinding blev udført i en mikrobølgeovn ved EDTA-buffer. Celler blev inkuberet i 3% hydrogenperoxid i 15 min for at blokere endogen peroxidaseaktivitet og derefter i 5% fedtfri mælk for at forhindre ikke-specifik binding. TMA blok snit blev inkuberet natten over ved 4 ° C med en specifik SATB1 kanin-monoklonalt antistof (1:50, ab92307; Abcam, Cambridge, CA, USA) eller en kanin monoklonalt antistof mod SATB2 (1:200, TA307098; OriGene Technologies, Inc .). For de negative kontroller blev primære antistoffer erstattet med PBS. Alle sektioner blev undersøgt mikroskopisk og scoret af to uafhængige patologer, der var blindet for den kliniske information af de emner. I modsætning til almindelige sektioner, SATB1 eller SATB2 immunhistokemisk farvning på væv microarray chips var næsten 100% kernekraft-farvet eller ikke-farvet for tumorvæv eller normal kolorektal slimhinde, så når de vurderer deres farvning, tog vi kun tages hensyn til farvning intensitet af positivt farvede nucleus. Nuklear intensitet blev betegnet som negativ, svagt positiv, moderat positiv eller stærkt positiv. Og når de udfører statistisk analyse, vi kombineret patienterne i svagt positiv, moderat positiv og stærkt positiv farvning som en positiv-farvning gruppe.

2.17 Statistisk analyse

SPSS 16,0 software (SPSS Inc. , Chicago, IL, USA) blev anvendt til at udføre de statistiske analyser. Alle in vitro eksperimenter blev udført tredobbelt og gentaget 3 gange. Uparret 2-tailed

t

tests blev anvendt til gruppe sammenligninger efter at have kontrolleret normalitet og varianshomogenitet. Data i de tal og tekst præsenteres som middel ± standardafvigelse. To-halet chi-squared test (χ

2) eller Fishers eksakte test blev anvendt til at vurdere forholdet mellem SATB1 ekspression og klinisk-patologiske faktorer eller SATB2 ekspression. Kaplan-Meier overlevelse analyse blev anvendt til at evaluere patientens prognose, og p-værdier blev beregnet ved log rank test. Multivariat analyse af Cox proportional hazards regressionsmodel blev anvendt til at bestemme virkningen af ​​SATB1 ekspression og klinisk-patologiske faktorer på patientoverlevelse. En p-værdi på 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

3.1 Angivelse af SATB1 i CRC cellelinier

mRNA og protein udtryk for SATB1 i seks human CRC celle. linjer, er SW480, SW620, HT-29, HCT116, RKO, og LoVo vist i fig. 1A. SATB1 mRNA og proteinekspression blev ikke påvist i SW480, SW620, HT-29, og HCT116-celler. SATB1 mRNA blev påvist i de stærkt metastatiske RKO og LoVo cellelinier. Desuden blev SATB1 protein stærkt udtrykt i RKO og LoVo-celler. Så LoVo og RKO cellelinier blev udvalgt til en række SATB1 Knockdown eksperimenter og SW480 cellelinier for de SATB1 overekspression eksperimenter.

(A) SATB1 mRNA og protein udtryk blev bestemt i (A) 6 CRC cellelinier , SW480, SW620, HT-29, HCT116, RKO, og LoVo; (B) repræsentative kolorektale tumorer og matchet normal slimhinde; (C) moderat og dårligt differentierede tumorer og normal slimhinde; og (D) repræsentative kolorektale tumorer og matchede synkrone hepatiske metastaser foci tumorer. SATB1 mRNA og proteinekspression blev bestemt ved RT-PCR og western blot, henholdsvis og normaliseret for p-actin. T, kolorektale tumorer; N, matchet normal slimhinde; M, synkrone hepatiske metastaser foci tumorer.

3.2 Angivelse af SATB1 i Primary CRC og Nedsat Metastase Foci

Udtrykket niveau SATB1 mRNA og protein blev bestemt i primær CRC tumor og matches non-tumor mucosa prøver. Blandt de 21 matchede tilfælde blev SATB1 mRNA og protein påvist i 17 tumorprøver, men ikke i nogen af ​​de ikke-tumor mucosa prøver (fig. 1B). Endvidere SATB1 mRNA og proteinekspression var højere i dårligt differentieret tumorprøver end i moderat differentierede tumorprøver (fig. 1C). SATB1 mRNA og protein-ekspression i primære CRC var den samme som i matchede synkron hepatisk metastaser foci (fig. 1D).

3.3 Undertrykkelse af SATB1 Expression Reducerer Cell Proliferation, Colony Formation, Migration, og Invasion i Vitro

for at vurdere betydningen af ​​SATB1 i CRC progression blev tre stabile SATB1-knockdown LoVo cellelinjer etableret ved hjælp shRNA. SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, og SATB1-shRNA3 cellelinjer var effektive i nedregulering SATB1 mRNA og protein-ekspression (fig. 2A). Protein ekspression af SATB1 var knap påviselig i SATB1-shRNA1 og SATB1-shRNA2 celler. SATB1 mRNA ekspression blev reduceret med næsten 90% i SATB1-shRNA1 celler, og med 70% og 60% i SATB1-shRNA2 og SATB1-shRNA3 celler, henholdsvis (fig. 2A). Væksthastigheden for alle SATB1-shRNA cellelinjer var langsommere end for de tomme vektor kontrolceller (p 0,05, figur 2B.). Som vist i fig. 2C, SATB1-shRNA1 celler havde en signifikant højere procentdel af apoptotiske celler end kontrolcellerne (45,1% V.S. 20,3%, p 0,01). Men andelen af ​​apoptotiske celler ikke var signifikant forskellig mellem SATB1-shRNA2, SATB1-shRNA3 og kontrol celler (data ikke vist). SATB1 knockdown induceret G1-fasen cellecyklusstop: procentdelen af ​​celler i G0 /G1 fasen var højere i SATB1-shRNA1 (46,4%) og SATB1-shRNA2 celler (45,6%) end i kontrolgruppen celler (36,8%) (p 0,01;. figur 2D). I modsætning hertil procentdelen af ​​celler i G2 /M og S faser var signifikant lavere i shRNA1 og shRNA2 celler end i kontrolgruppen celler (p 0,01;. Figur 2D). ændringer cellecyklus blev ikke observeret i SATB1-shRNA3 celler (data ikke vist). Disse resultater viste, at SATB1 kan spille en vigtig rolle i at fremme væksten og overlevelsen af ​​CRC celler.

(A) Tre stabile SATB1-Knockdown LoVo cellelinjer blev etableret ved hjælp shRNA. Celler transficeret med tom vektor tjente som kontroller. Effekten af ​​SATB1 knockdown blev verificeret ved RT-PCR (øverste venstre panel), western blot (nederste venstre panel) og immunofluorescens (højre panel). β-actin blev anvendt for at sikre lige belastning. (B) Cell spredning af tomme vektor kontrol, blev SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, og SATB1-shRNA3 celler bestemt af MTT-analysen. (C) Apoptose af SATB1-shRNA1 og tomme vektor kontrol celler blev bestemt ved flowcytometri analyse af PI og Annexin V farvning. (D) Flowcytometrianalyse af cellecyklus i tomme vektor kontrol, SATB1-shRNA1, og SATB1-shRNA2 celler. (E) Blød agar koloni dannelse af tomme vektor kontrol, SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, og SATB1-shRNA3 celler efter 3 uger. * P 0,001. (F) Migration af tomme vektor kontrol, blev SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, og SATB1-shRNA3 celler bestemt af sårheling assay (venstre panel) og transwell migration assay (øverst til højre panel). Antallet af migrerede celler i Transwell migration assay blev kvantificeret ved tælling af cellerne på undersiden af ​​filteret membranen i 5 tilfældigt udvalgte mikroskopiske felter (nederste højre panel). * P 0,001, antal af migrerede celler sammenlignet med kontrol. (G) Cell invasion af tomme vektor kontrol, blev SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, og SATB1-shRNA3 celler bestemt af Matrigel transwell invasion assay. Antallet af invaderede celler blev kvantificeret ved at tælle celler på undersiden af ​​filtermembranen i 5 tilfældigt udvalgte mikroskopiske felter. * P 0,001, antal invaderede celler sammenlignet med kontrol

Knockdown af SATB1 udtryk faldt kolonidannelse sats og koloni størrelse (figur 2E.).. I kontrolcellerne, kunne næsten 100 til 120 kolonier iagttages i tilfældigt udvalgte mikroskopiske felter. I modsætning hertil kolonidannelse var langt færre i de tre SATB1-shRNA celler (shRNA1: 28,75 ± 8,5; shRNA2: 34,5 ± 7,8; ​​shRNA3: 40,5 ± 4,5). Knockdown af SATB1 også reduceret celle motilitet som det fremgår af de bredere sår lukninger i de 3 SATB1-shRNA cellelinjer i forhold til dem i kontrol celler (Fig. 2F). Den invasive kapacitet var signifikant lavere i SATB1-shRNA1, shRNA2, og shRNA3 celler end i kontrolgruppen celler (p 0,001;. Figur 2G). Disse resultater var i overensstemmelse med de af transwell migration assay (fig. 2F).

Desuden testede vi vækstraten og migration /invasion evne i RKO cellelinjer. SATB1-knockdown af RKO cellelinjer blev etableret ved hjælp shRNA1 (navngivne SATB1-shRNA1 RKO cellelinjer). Begge mRNA og protein niveauer af SATB1 blev effektivt nedreguleret ved shRNA1 (fig. 3A). I overensstemmelse med SATB1 Knockdown eksperimenter i LoVo cellelinjer, væksten i SATB1-shRNA1 RKO cellelinjer var langsommere end for de tomme vektor kontrol celler (p. 0,05, figur 3B), og SATB1-shRNA1 RKO cellelinjer viste også G1-fasen cellecyklusstandsnings (fig. 3C). Migration assay forudsat beviserne at knockdown af SATB1 gen kan reducere cellens motilitet (p. 0,001 figur 3D). Og i RKO cellelinier, blev den invasive evne signifikant reduceret med nedregulering SATB1 ekspression, som vist på fig. 3E (p 0,001).

(A) SATB1-Knockdown RKO cellelinjer blev etableret ved hjælp shRNA1. Celler transficeret med tom vektor tjente som kontroller. Effekten af ​​SATB1 knockdown blev verificeret ved RT-PCR og western blot. β-actin blev anvendt for at sikre lige belastning. (B) Cell proliferation af tom vektor kontrol, og SATB1-shRNA1 RKO-celler blev bestemt ved MTT-assayet. (C) Flowcytometrianalyse af cellecyklus i tom vektor kontrol, SATB1-shRNA1 RKO celler. (D) Migration af tomme vektor kontrol, blev SATB1-shRNA1 RKO celler bestemt af transwell migration assay. * P 0,001, antal af migrerede celler sammenlignet med kontrol. (E) Cell invasion af tom vektor kontrol, SATB1-shRNA1 RKO-celler blev bestemt ved Matrigel Transwell invasion assay. * P 0,001, antal invaderede celler sammenlignet med kontrol

3.4 Overekspression af SATB1 Fremmer Cell Proliferation, Colony Formation, Migration, og Invasion i Vitro

For yderligere at verificere rolle. af SATB1 i CRC progression blev en SATB1-overudtrykkende cellelinje etableret ved hjælp af dårligt metastatiske SW480 celler. SATB1 overekspression blev verificeret ved Western blot, RT-PCR, og immunfluorescensfarvning (fig. 4A). Vækstraten var højere i SATB1-overekspression celler end i de tomme vektor kontrol celler (p 0,05;. Figur 4B). Procentdelen af ​​apoptotiske celler var lavere i SATB1-overudtrykkende celler end i kontrolcellerne (28,7% V.S. 36,1%, p 0,01;. Figur 4C). Overekspression af SATB1 fremmet cellecyklusprogression fra G0 /G1-fasen til G2 /M og S faser (56,3% G0 /G1-fasen i SATB1-overekspression cellelinier versus 63,6% G0 /G1-fasen i kontrolceller) (Fig. 4D). Kolonidannelse sats og kolonistørrelse var højere i SATB1-overekspression celler (67,5 ± 9,5) end i kontrolgruppen celler (24.75 ± 2,75) (fig. 4E). SATB1 overekspression øget cellemigration som vist ved den fuldstændige sårlukning og mere migrerede celler i SATB1-overudtrykkende celler (fig. 4F). Desuden invasion kapacitet var højere i de SATB1-overudtrykkende celler (109 ± 8,7) end i kontrolcellerne (12,75 ± 4,5) (fig. 4G).

(A) SW480-celler blev transficeret med pcDNA3 .1-SATB1 ekspressionsvektor eller tom vektor. Opregulering af SATB1 mRNA og proteinekspression blev bekræftet ved RT-PCR (øverste venstre panel), western blot (nederste venstre panel) og immunofluorescens (højre panel). β-actin blev anvendt for at sikre lige belastning. (B) Cell proliferation af tom vektor kontrol og pcDNA3.1-SATB1 celler blev bestemt ved MTT-assay. (C) apoptose af tom vektor kontrol og pcDNA3.1-SATB1 celler blev bestemt ved flowcytometri analyse af PI og Annexin V-farvning. (D) Flowcytometrianalyse af cellecyklus i tom vektor kontrol og pcDNA3.1-SATB1 celler. (E) blød agar-kolonidannelse af tomme vektor kontrol og pcDNA3.1-SATB1 celler efter 3 uger. (F) Migration af tom vektor kontrol og pcDNA3.1-SATB1 celler blev bestemt ved sårheling assay (venstre felt) og transwell migration assay (højre panel). * P 0,001, antal af migrerede celler sammenlignet med kontroller. (G) Cell invasion af tomme vektor kontrol og pcDNA3.1-SATB1 celler blev bestemt ved Matrigel Transwell invasion assay (* p 0,001).

3.5 SATB1 Fremmer vækst og metastaser af CRC celler i vivo

Dernæst vi evaluerede effekten af ​​SATB1 overekspression på CRC carcinogenese in vivo, mRNA og protein udtryk for SATB1 var højere i tumorer fra SATB1-overekspression celler end i tumorer fra de tomme vektor celler (fig. 5A). Tumorer fra SATB1-overekspression celler havde en hurtigere vækst end tumorer fra kontrol- celler, som var i overensstemmelse med in vitro-vækstrater (p . 0,01, figur 5A, øverste panel). De tumorvægte fra SATB1-overudtrykkende celler var ca. 5-6 gange tungere end dem fra de tomme vektor celler, hvilket indikerer, at SATB1 kunne fremme væksten af ​​kolorektale tumorer in vivo (fig. 5A, nedre panel).

(A) mRNA og protein udtryk for SATB1 inxenograft tumorer fra tom vektor kontrol og pcDNA3.1-SATB1 celler blev bestemt ved RT-PCR og western blot, henholdsvis (øverste venstre panel). Derefter blev tumorvækst bestemmes ved en in vivo xenograft model. Stabile SATB1-overudtrykkende og tomme vektor kontrol celler (2 x 10

6) injiceret subkutant i venstre og højre dorsale flanke i henholdsvis 5 BALB /c athymiske mus. Tumorstørrelser blev målt to gange ugentligt, og musene blev aflivet efter 4 uger. Tumorvækst i musene injiceret med tom vektor kontrol og pcDNA3.1-SATB1 tumorceller blev bestemt ved væksthastighed assay (øverste højre panel).