PLoS ONE: Mirna Expression Profiler Identificer drivere i kolorektal og pancreas Cancers

Abstrakt

Baggrund og Formål

Ændret udtryk for microRNA (miRNA) kendetegnende mange kræftformer. Studiet af de sammenslutninger af miRNA udtryk profil og kræft fænotype kunne hjælpe med at identificere sammenhængen mellem deregulering af miRNA udtryk og onkogene veje.

Metoder

Expression profilering af 866 menneskelige miRNA i 19 kolorektal og 17 pancreascancer og i matchede tilstødende normale væv blev undersøgt. Klassisk parret t-test og tilfældige skov analyser blev anvendt til at identificere miRNA forbundet med vævsspecifikke tumorer. Netværk analyse baseret på en beregningsmæssige tilgang til mine sammenhænge mellem kræft typer og miRNA blev udført.

Resultater

sammenfletning mellem de to statistiske metoder, der anvendes til at skære de miRNA differentielt udtrykte i kolon og pancreascancer tillod identifikation af kræft-specifikke miRNA ændringer. Ved miRNA-netværk analysen blev vævsspecifikke mønstre af miRNA deregulering spores: de drivende miRNA var

miR-195, miR-1280, miR-140-3p

MIR-1246

i kolorektale tumorer og

miR-103, miR-23a

miR-15b

i pancreascancer.

Konklusion

miRNA udtryk profiler kan identificere kræft -specifikke signaturer og potentielt nyttige biomarkører for diagnosticering af vævsspecifikke kræftformer. miRNA-netværksanalyse at identificere ændret miRNA regulatoriske netværk, der kunne spille en rolle i tumor patogenese

Henvisning:. Piepoli A, Tavano F, Copetti M, Mazza T, Palumbo O, Panza A, et al. (2012) Mirna Expression Profiler Identificer Drivers af colorectal og pancreascancer. PLoS ONE 7 (3): e33663. doi: 10,1371 /journal.pone.0033663

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: November 17, 2011; Accepteret: 14 februar 2012; Udgivet: 30 marts, 2012 |

Copyright: © 2012 Piepoli et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for italienske Sundhed giver RC0903GA51, RC1003GA52, RC1103GA47, RC0903CH47, RC1003CH50, RC1103CH46, RC1003BS14 og RC1102BS45 gennem Forskningsenheden for Gastroenterology, Forskningsenheden for Kirurgi og enhed for Biostatistik; og Casa Sollievo della Sofferenza (IRCCS), San Giovanni Rotondo (FG), Italien. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er små ikke-proteinkodende RNA-molekyler, der regulerer genekspression primært på niveauet af proteinsyntese [1]. De repræsenterer en evolutionær stærkt bevaret, som styrer vigtige cellulære processer, såsom udvikling, differentiering, proliferation, apoptose og metabolisme [2]. Afvigende ekspression af miRNA kan opstå fra deletion, mutation og methylering af miRNA-kodende gener, hvoraf mange placeret på genomiske skrøbelige steder eller regioner ofte slettet eller forstærkede i cancer [3]. Baseret på disse præmisser har de vist sig at interagere med potentielle onkogener eller tumorsuppressorer [4]. Mange miRNA udtrykt i en vævsspecifik måde, med profiler udtrykkes differentielt i enten normale og neoplastiske væv, og i tumorer med særskilte biologiske egenskaber. Desuden er nogle beviser tyder miRNA profiler til at tillade pålidelig identifikation af den celle-of-oprindelse tumorer [5].

Klassisk, differential ekspressionen af ​​miRNA er blevet evalueret enten som enkeltbidrag eller som forudsigende signatur [6 ], [7]. Meget af den videnskabelige indsats er brugt i øjeblikket at belyse deres funktioner: de fleste miRNA kontrol mindst en mRNA, og de fleste mRNA’er styres af mere end én [8] miRNA. Kompleksiteten bag denne sofistikerede mekanisme kan delvis afhjælpes ved viden om bevarelse niveauer af hver miRNA. Faktisk høj bevaringsværdi tværs brede fylogenetiske afstande hjælper begrænse række funktioner, som en miRNA kan spille for at regulere styringen af ​​udviklingen arter og fysiologi.

I denne undersøgelse undersøgte vi ekspressionsmønstre af miRNA i kolorektal (CRC) og kræft i bugspytkirtlen (PC) med den hensigt at identificere miRNA regulatoriske netværk sandsynligvis involveret i onkogene veje ved at evaluere kræft-specifikke signaturer gennem analyse af forholdet mellem miRNA udtryk profil og kræft slægter.

Materialer og metoder

prøver Valg og RNA Extraction

Primær tumor og omkringliggende ikke-tumorform væv blev opnået fra to uddannelse kohorter af 19 CRC patienter og 17 pc-patienter, og fra to validering kohorter af 14 CRC og 21 pc-patienter .. undersøgelsen blev udført med godkendelse af de videnskabelige og etiske udvalg i IRCCS “Casa Sollievo della Sofferenza” Institute, San Giovanni Rotondo, FG (Italien). Patienterne gav informeret skriftligt samtykke i henhold til den italienske lov om beskyttelse af personlige oplysninger (om beskyttelse af personoplysninger), så enkeltpersoner ikke kan identificeres ud fra data eller billeder i denne publikation, og godkendt af de videnskabelige og etiske udvalg i IRCCS ” Casa Sollievo della Sofferenza “Institute. Alle kliniske undersøgelser er udført i henhold til principperne i Helsinki-erklæringen.

Patient kliniske data, tumor placering og iscenesættelse er vist i tabel S1. Vævsprøver blev lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil nukleinsyrer ekstraktion. Ca. 150-200 mg frisk frosne væv blev anvendt til at isolere total RNA ved phenolekstraktion (TRIzol Reagent, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA). RNA koncentration og renhed blev kontrolleret af Nano Drop Specthophotometer. Agilent 2100 Bioanalyzer blev anvendt til at måle mængden, integritet og renhed af små RNA’er og totalt RNA, og kun ikke nedbrudt RNA er karakteriseret ved en RNA integritet nummer 7 uden DNA-kontaminering tegn blev behandlet

miRNA. mikroarrays

mirna udtryk profil blev bestemt ved hjælp af GeneChip® miRNA Array (www.affymetrix.com). Denne matrix indeholder 46,228 sonder omfatter 7.815 probe sæt, herunder kontrol, og dækker 71 organismer såsom mennesker, mus, rotter og hunde. Indholdet er afledt af Sanger miRBase miRNA database V.11 (april 15, 2008 https://microrna.sanger.ac.uk). Probe sæt rettet mod menneskelige snoRNAs og scaRNAs er afledt af snoRNABase (www.snorna.biotoul.fr/coordinates.php) og Ensembl (www.ensembl.org/biomart/martview~~number=plural) arkiver, Kort fortalt 1,5 pg totalt RNA blev mærket ved hjælp af 3DNA Array Detection FlashTag ™ RNA Mærkning Kit (https://www.genisphere.com), i henhold til producentens anbefalinger. Først blev poly (A) hale udført ved 37 ° C i 15 minutter i et volumen på 15 ml reaktionsblanding, som indeholdt 1X Reaction Buffer, 1,5 ml MgCI2 [25mM], 1 pi ATP Mix fortyndet 1:500 og 1 pi PAP enzym. For det andet blev Flash tag Ligering udføres ved stuetemperatur i 30 min ved tilsætning af 4 pi 5X Flash tag Ligeringsblandingen Biotin og 2 pi T4 DNA Ligase i 15 pi reaktionsblanding. For at stoppe reaktionen blev 2,5 pi Stop Solution tilføjet. Prøverne blev hybridiseret, vasket og scannes med en Affymetrix Scanner.

Alle microarray data er MIAME kompatibel og de rå data er blevet deponeret i ArrayExpress (tiltrædelse nummer E-mtab-752 for tyktarmskræft miRNA udtryk profiler og E- mtab-753 for kræft i bugspytkirtlen miRNA udtryk profiler).

Kvantitativ estimering af miRNA ved revers transkription real-Time PCR assay

Kvantitativ realtid polymerasekædereaktion (qPCR) af miRNA blev udført ved hjælp af TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) med ABI-PRISM 7700 Sequence Detection System. En to-trins protokol kræver revers transkription med en miRNA-specifik primer, efterfulgt af en realtids-PCR med TaqMan prober. Analyserne målrette kun modne miRNA, ikke deres forstadier. Kort fortalt, revers transkriptase reaktioner indeholdt 10 ng RNA-prøver, 50 nM stemloop RT-primer, 10X RT-buffer, 0,25 mM af hver af dNTP, 3,33 U /pl MultiScribe RT og 0,25 U /pl RNase inhibitor (alle købt fra cDNA Archive Kit af Applied Biosystems) blev udført i slutvolumen på 15 pi og inkuberet i termal variator i 30 min ved 16 ° C, 30 min ved 42 ° C, 5 minutter ved 85 ° C og derefter holdt ved 4 ° C. Den 20 pi PCR-reaktionsblanding indeholdt 1,3 pi RT produkt (01:15 fortyndingsvandet), 10 pi TaqMan 2X Universal PCR Master Mix (NoUmpErase UNG) og 1 pi TaqMan 20X MicroRNA Assay (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) . Reaktioner blev inkuberet i en 96-brønds optisk plade ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 10 min. Alle analyser blev udført i tre eksemplarer.

Statistisk analyse

Patienternes baseline karakteristika blev rapporteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) eller frekvenser og procentsatser for kontinuerte og kategoriske variabler, henholdsvis.

for hver af de to uddannelser kohorter, microRNA chip data blev normaliseret ved hjælp Robust Multi array Average (RMA) algoritme [9]. For at identificere differentielt udtrykte miRNA mellem parrede normale og tumorvæv blev to tilgange fulgt. For det første er en klassisk parret t-test kontrollerer for forkerte opdagelse sats (FDR) tilladt ranking miRNA efter deres p-værdier. For det andet blev tilfældig skov (RF) analyse [10] anvendes til at detektere miRNA med den bedste kapacitet i diskriminere tumor fra parrede normale væv. En RF er en klassifikatør bestående af et ensemble af træ-strukturerede klassificører. Ifølge denne teknik, blev 100.000 træer bygget til at klassificere væv. Den lærende, der bruges til at vokse hvert træ var en .632+ bootstrap resample af observationerne. Træer lodes vokse til deres fulde størrelse uden beskæring. Den bedste split ved hvert knudepunkt blev valgt fra en tilfældig delmængde af miRNA. De venstre-out observationer (dvs. “ud af posen” observationer) blev derefter forventes at opnå klassificeringen fejlprocent på den betragtede træet. Predictive evne til klassificeringen blev vurderet at lægge de enkelte træ fejlprocenter. Endvidere den tilfældige ramme skoven tilladt os at estimere betydningen af ​​en variabel ved at se på, hvor meget de klassifikation usikkerhed forøges, når “ud af posen” data for denne variabel permuteres mens alle andre forblive uændrede. Betydningen metriske anvendte var gennemsnitligt fald i Nøjagtighed (MDA). MDA er konstrueret ved permutere værdierne for hver variabel af testen sæt, registrering forudsigelse og sammenligne den med den un-permuterede test sæt forudsigelse af den variable. Derfor er det er stigningen i andelen af ​​gange en test sæt fejlklassificeres når variablen permuterede. Vi fulgte Strobl et al. [11] for at undgå mulig skævhed i variabel valg: de enkelte klassificering træer blev bygget ved hjælp af subsampling uden udskiftning og vedtage en betinget permutation ordning [12]. Vi opnåede en miRNA placering i overensstemmelse med den variable betydning foranstaltning. Endelig blev de to miRNA rankings, en fra den klassiske analyse og en fra RF-analyse, fusioneret til opnåelse af en liste over differentielt udtrykte miRNA. Korrelationer mellem miRNA ekspression blev anslået under anvendelse af Spearman koefficient. En p-værdi 0,05 blev anset for statistisk signifikans. Alle analyser blev udført ved hjælp af SAS Frigivelse 9.1 (SAS Institute, Cary, NC, USA) og R for tilfældig skov analyser (

randomForest

pakke).

Kvantitativ real-time PCR (qPCR) assay blev brugt på eksterne validering kohorter at bekræfte microRNA array-resultater, som blev vurderet ved hjælp af Comparative Threshold cyklus (CT) metode og standard tærskel indstillinger. Relative udtryk for miRNA blev beregnet ved 2

-ΔΔCt formel [13] med U6 lille nukleare RNA (RNU6B) som normalisering kontrol. Da 2

-ΔΔCt transformerede værdier ikke var normalfordelt, sammenligninger blev foretaget under anvendelse af ikke-parametriske Wilcoxon signed rank test for at vurdere den statistiske signifikans af den op eller ned regulering. På qPCR validering analyser, vi behandlede en prøvestørrelse på 14 forsøgspersoner til tilvejebringelse af en strøm 90% (med en to-sidet alfa = 0,05) til at detektere en opregulering af mindst 2 eller en nedregulering på højst 0,5 hver miRNA udtryk i form af 2

-ΔΔCt hjælp af ikke-parametrisk Wilcoxon-test og en som nulhypotesen.

Netværk analyse

for hver af de to uddannelse kohorter en ikke-orienteret og vægtet netværk blev bygget, hvor knuder og kanter repræsenterer miRNA og deres korrelationer (når signifikant), hhv. Således er kanter ikke orienteret da korrelation er symmetrisk, og vægtes med Spearman koefficient. Tykkelsen af ​​kanter afspejler størrelsen af ​​vægtene. For at grave kritiske noder ud af både CRC og pc-netværk, vi lånt nogle metoder fra samfundsvidenskab, og vurderet følgende

centralitet

foranstaltninger:

grad

,

betweenness

og

clustering koefficient

[14], [15] for hvert netværk. Endelig har miRNA været rangeret i overensstemmelse hermed.

Alle disse foranstaltninger (eller målinger) er baseret på optælling af links eller korteste veje. I detaljer, lad os definere en sti fra til, med det sæt af knudepunkter, som en alternerende sekvens af knuder og kanter, som begynder med og slutter med, således at hver kant forbinder dens foregående med dens efterfølgende toppunkt. Vi indstille længden af ​​en vej som at være summen af ​​de inverse vægt af kanterne. Ideen er, at stærkt korrelerede miRNA minimere afstanden mellem knuder eller fra et andet perspektiv, de tættere to knuder er, jo mere de er korreleret. Derfor vi beregne afstanden mellem to knudepunkter og, skrevet, da den mindste længde af enhver sti forbinder og i. Per definition, for hver.

Degree

centralitet er baseret på ideen om, at vigtige knudepunkter er dem med det største antal bånd til andre knuder i grafen. Det er ofte tolkes i forhold til øjeblikkelig inddragelse af knuder i relationer, der er etableret gennem netværket. Lad være vægten af ​​kanten, der forbinder knudepunktet med knudepunktet, graden centrale i et knudepunkt er, med det sæt af kanter, hvorefter højere er graden værdi, jo vigtigere (globalt korreleret) er knudepunktet .

Betweenness

centrale måler indflydelse en node har over den indirekte sammenhæng mellem ikke nabo noder. Betweenness i sin basisversion, beregnes som den del af korteste veje mellem node par, der passerer gennem knude af interesse. Dens matematiske udtryk er, hvor er antallet af korteste veje fra til, og er antallet af korteste veje fra til at passere gennem en vinkelspids. Hjørner, der forekommer på mange korteste veje mellem andre knudepunkter har højere betweenness, og derefter højere relevans i indirekte sammenhænge.

Clustering koefficient

er et mål for hvilken grad noder i en graf har en tendens til klynge sammen, eller med andre ord, det kvantificerer knuder på grund af, i hvilket omfang deres naboer er at være en

klike

(komplet graf) med det. Den klyngedannelse koefficient på en node er da givet ved andelen af ​​forbindelser mellem knuderne inden for sit nabolag divideret med antallet af links, der muligvis kunne være mellem dem. Kortfattet, er det udtrykkes som, hvor definerer de umiddelbart forbundne naboer sæt og. Dens ‘vægtet’ formulering bygger på vægtene i

trekanter

centreret om knudepunkter i et netværk. Den defineres ved Horvath og Zhang [16] som hvor er vægten over kanten, og således produktet af vægtene af kanterne, som danner en lukket trekant af knudepunkter. Med udgangspunkt i den lokale definition af klyngedannelse koefficient, rapporterer vi dens gennemsnit formulering af Schank og Wagner [17] for hele netværket som forholdet mellem summen af ​​produkterne af de clustering koefficienter og en generel vægt funktion, og vægten funktionen selv , nemlig hvor er den generelle vægtfunktion. Vægten funktion er som regel valgt blandt de målinger, der bedre indfanger topologi af netværket, der undersøges. En lavere

Gennemsnitlig Vægtet Clustering Koefficient

foranstaltning angiver en vigtigere knudepunkt i forhold til netværket robusthed.

Netværk er blevet udarbejdet og analyseret af en brugerdefineret uafhængige værktøj skrevet i C # og bygget over biblioteket NodeXL 1.0.1.174 [18].

Resultater

Altered miRNA udtryk hos patienter med CRC og PC

Vi sammenlignede miRNA profiler af 36 par af solide tumorer og tilstødende nontumorous væv i uddannelse kohorter (19 CRC og 17 PC) ved hjælp af microRNA mikroarrays. Menneskelige miRNA (

har-miR-

) og væv blev grupperet efter en hierarkisk klyngedannelse analyse (figur 1). Hver plottet sonde blev farvekodet at sidestille niveauet af ekspressionen af ​​miRNA i forhold til dets median udtryk niveau på tværs af de hele vævsprøver, der er (blå, lav, rød, høj). (Figur 1)

miRNA profiler af 36 parrede vævsprøver fra 19 kolorektal cancer (orange boks) og 17 bugspytkirtelkræft (grøn boks) patienter blev grupperet. De 36 parvise prøver er i rækker (farvede søjler) og 866 miRNA er i kolonner. T, tumorvæv; . N, tilstødende normale væv

differentielt udtrykte miRNA i CRC og PC

For at identificere miRNA differentielt udtrykte i parrede normale og tumorvæv blev to tilgange fulgt: en klassisk parret t-test kontrollerer for forkerte opdagelse sats (FDR) og en RF-analyse. Ved den første analyse blev 42 miRNA udtrykkes forskelligt i CRC (tabel 1). Femogtyve af dem blev overudtrykt, med

HSA-miR1246

viser den højeste fold-ændring (12,0 gange). I PC, blev 128 miRNA differentielt udtrykt (se tabel S2). Især af 34 miRNA med en p 0,01, 30 viste højere ekspressionsniveauer i tumorvæv, med

HSA-miR-23a

vise den højeste fold-ændring (9,3 gange), mens 4 flere miRNA blev nedreguleret (tabel 2).

for at fastslå den endelige eksistens orthologer i andre arter, og at bruge dem som intern metodisk kontrol, de menneskelige miRNA fundet ændret i de to faste tumorer blev kontrolleret i 71 andre organismer i array: alle deregulerede orthologer af humane miRNA (fra nu af,

har-miR-

vil blive omtalt som

miR-

) viste en betydelig differentieret udtryk med lignende fold-ændring i disse organismer (tabel S3).

for at kontrollere rigtigheden af ​​RF, blev der rapporteret klassificering forestillinger i diskriminerende tumor fra normalt væv i multidimensional skalering af de estimerede nærhed matrix plots (figur 2) viser ligheder eller uligheder i data. For hver tumortype, i rækken af ​​de vigtigste miRNA, ifølge MDA, blev afledt (Figur 3, panel A og B).

Proximity matricer fra tilfældig skov analyse, hvor

x-

og

y-

akser er den flerdimensionale skalering koordinater. Emner med lignende miRNA udtryk er repræsenteret ved punkter tæt ene til den anden, mens personer med uens miRNA udtryk er repræsenteret ved adskilte punkter. Rød = tumorvæv, Sort = tilstødende normale væv.

gennemsnitligt fald i Nøjagtighed (MDA) som et mål for miRNA betydning ved klassificering tumorvæv fra normale dem anslået ved tilfældig skov analyse. De første 42 vigtigste miRNA i colorectal cancer (panel A) og 50 miRNA i bugspytkirtelkræft (panel B) er vist.

Sammenligning af miRNA detektion signatur metoder

Når resultaterne med t-test og RF blev sammenlagt, blev en betydelig overlapning mellem miRNA påvist i enten CRC og pc væv fundet. Ved at gennemskære de miRNA med P 0,001 ved t-test analyse (tabel 1) med dem med den højeste MDA på RF-analyse (figur 3A) blev ekspressionen af ​​24 miRNA signifikant ændret i CRC (figur 4). Ved en tilsvarende analytisk tilgang (tabel S2, og figur 3B), blev 23 miRNA ændret betydeligt i PC (figur 4).

For både væv en betydelig overlapning mellem fundne miRNA blev fundet ved at sammenlægge t-test og RF resultater. En gruppe på 24 miRNA, hvis ekspression blev ændret signifikant i kolorektale tumorer, blev opnået skærer listen over første 42 miRNA med bedste p-værdier, fra t-test analyse, med dem ved højeste MDA, fra RF-analyse. På samme måde blev 23 miRNA med ændret ekspression valgt i pancreas tumorer. * P 0,001; § RF 4,3; ** P 0,05; # RF . 0,94

Som vist i figur 4, miRNA udtryk var stærkt vævsspecifik; ja, var de fleste miRNA med ændret udtryk i CRC ikke differentiallly udtrykkes i pancreas tumor væv. Den ændrede udtryk for kun to miRNA blev delt af CRC og PC:

miR-145

dukkede 2,2-fold nedreguleret (p 0,001) i CRC, og 5,7-fold opreguleret (p 0,01) i PC, mens

mIR-1280

var 2,1 gange opreguleret (p 0,001) og 2,3-fold nedreguleret (p 0,05) i de tidligere og sidstnævnte kræftformer, (se tabel 1, tabel 2 og tabel S2).

miRNA korrelationer og kræft-miR netværk

Næste vi forsøgte at kontrollere det indbyrdes forhold af tidligere valgte miRNA udtrykkes enten CRC og pc væv ved hjælp af Spearman korrelationskoefficienten metode

for CRC, forskellige

grader

af korrelation blev fundet for 24 miRNA udviser ændret udtryk:.

miR-106a

blev ikke korreleret overhovedet, mens

miR-195

udstillet det største antal bånd og blev taget som rod node med 9 kanter (

grad

15,86); 8 links blev fundet for

miR-28-3p Hotel (

grad

15.66), og 7 links til

MIR-1280

(

grad

13.79) ,

mIR-1246 Hotel (

grad

13,05), og

miR-140-3p Hotel (

grad

12.12) (figur 5, panel A) . Sidstnævnte 3 knuder blev også forbundet med

miR-28-3p

, som viste en høj betweenness værdi. Til denne sidste foranstaltning, blev observeret den højeste værdi for

MIR-1246

node, som mange korteste veje mellem andre knuder forekomme (tabel S4). En anden vigtig knude var repræsenteret ved

miR-18a

med 6 relationer, 3 af dem etableret med flere miRNA tilhører den

miRNA 17-92a

klynge. Når vi målte graden af ​​nodal klyngedannelse (c

lustering koefficient

),

miR-378, miR-10b

miR-31

syntes at være en

cliqu

e med vertice i

miR-28-3p

. For at verificere robusthed af nettet, vi beregnet

gennemsnitlig vægtet clustering koefficient

, og evalueret bidrag en miRNA til den samlede kompakthed af netværket. De laveste score blev observeret for

MIR-1280, miR-195

og

miR-140-3p

som var de knudepunkter af komplet graf (figur 5, panel A og tabel S4).

Grønne punkter skildrer knudepunkterne svarende til 24 miRNA af CRC-netværk og 23 miRNA af PC-netværk. Kanterne karakterisere de signifikante korrelationer, hvis tykkelse afspejler Spearman korrelationskoefficienter (blå og grønne kanter anvendes til positive og negative korrelationer henholdsvis). I CRC-netværk, som vist i panel A, m

iR-195, miR-28-3p, miR-1280, miR-18a

MIR-1246

udvise den højeste

vægtet

grad rang. Ingen korrelation er fundet for

miR-106a

.

MIR-1246

har også den højeste

betweenness

rang. I PC-netværk, som vist i panel B,

miR-103, miR-23a

miR-15b

har den højeste

grader

og er alle forbundet til

miR-199a-3p

samt til hinanden danner en fire noder

klike

. Desuden fjernelsen af ​​disse knudepunkter forårsager dybeste dråbe af gennemsnitlige klyngedannelse koefficient rang.

MIR-384

udviser den højeste betweenness centrale foranstaltning.

Tyve ud af 23 miRNA med en betydelig deregulering i PC væv blev knyttet til andre knudepunkter i netværket ved en række kanter varierende fra en til fem (

grad

: 8,88-1,92); for kun 3 miRNA (dvs.

miR-30d *, miR-1280

miR-493 *

) ingen signifikant korrelation blev observeret (

grad

: 0), ( Figur 5, panel B). Især blev det maksimale antal bånd fundet for

miR-103 Hotel (

grad

: 8,88),

miR-23a Hotel (

grad

: 8,84) og

miR-15b

(

grad

: 8.38). Disse 3 vigtigste knudepunkter blev alle knyttet til

miR-199a-3p Hotel (grad: 6,03), og disse fire miRNA optrådte inter-krydset for at udgøre en fire-node klike. blev observeret Den højeste betweenness centrale mål for

miR-384 Hotel (

betweenness

: 0,31), viser sig at være kritisk placeret i mellem (og dermed er ansvarlige for mange) mellemdistanceraketter sammenhænge. Vi verificerede Væsentlighed af de fire-node

klike

ved at måle den samlede robusthed af netværket (i form af stier redundans) efter at fjerne det. Vi beregnet den

gennemsnitlig vægtet clustering koefficient

for hele netværket ved at fjerne igen en knude. Især efter at udelukke de knudepunkter i

klike

(

miR-103, miR-15b, miR-199a-3p

og

miR-23a

) de laveste rækker , nemlig 5,78, 5,85, 6,05 og 6,14 blev opnået henholdsvis. Dette fund peger på disse knudepunkter som funktionelt relevant og som betydelig bestanddel af sammenhængskraften i netværket (figur 5, panel B og i tabel S4).

Validering qPCR

Blandt betydeligt liberaliserede miRNA i microarray undersøgelsen, 18 blev udvalgt til yderligere validering af kvantitativ real-time PCR (qPCR). Udvælgelse af disse miRNA var baseret på to kriterier: resultatet af den tidligere beskrevne krydset analyse, og /eller deres involvering i colon eller bugspytkirtel tumorigenese (ifølge litteraturen data). Kvantitativ PCR blev anvendt til at analysere ændret ekspression af de udvalgte miRNA, samt den for RNAU6 kontrolprøven ved tumorvæv og normalt væv taget fra en ny validering kohorter af 14 patienter med CRC og 21 PC patienter.

Sammenlignet med normalt væv med et udtryk profil normaliseret til en, i tumor prøver af de 14 CRC patienter, vi observeret en signifikant opregulering i 3 miRNA (

miR-31, miR-21

miR- 708

), og under udtryk i 7 andre (

miR-145, miR-139-5p, miR-486-5p, miR-378, miR-140-3p, miR-143

og

mIR-30c

) (tabel 3). De resterende 8 miRNA (

miR-151-5p, miR-155 *, miR-17, miR-199a-5p, miR-23a, miR-30a-5p, miR-455-3p, og miR-bogstavta- 7i

) ikke udviser signifikant ændret udtryk.

i kohorte af 21 PC-patienter, 13 ud af 18 miRNA blev analyseret af qPCR i tumor væv i forhold til normale prøver. Down-ekspression blev kun observeret for

miR-21

, mens overekspression blev observeret i 12 miRNA (

miR-143, miR-145, miR-151-5p, miR-155 *, miR -199a-5p, miR-23a, miR-30a, miR, 30c, miR-21, miR-455-3p, miR-708

miR-lad-7i

) og kun to var ikke dereguleret i en statistisk signifikant måde (

miR-30a og miR-30c

) (tabel 3).

diskussion

miRNA, der udtrykkes differentielt i forskellige kræftformer kan deltage i fælles ændrede lovgivningsmæssige veje [19]. Således kan viden om deres interagere netværk giver et perspektiv af ændrede miRNA og deres mønster af deregulering (dvs. op- eller nedregulering). I denne undersøgelse, vi profilerede miRNA i to forskellige solide kræft væv, CRC og PC, for at teste, om nogen plausible “underskrifter” kunne påvises. Til dette formål, vi oprindeligt søgte miRNA differentielt udtrykt i tumorer og normalt væv af de to forskellige slægter, og efterfølgende identificeret “vævsspecifikke” miRNA ved anvendelse af en hidtil ukendt statistisk metode, dvs. RF klassificeringen. For hver kræftvæv kunne vi generere en liste over de mest konkrete og markant deregulerede miRNA. Interessant nok i de to lister kun to miRNA gik igen, men med modsatte mønstre af udtryk:

miR-145

og

MIR-1280

. Men mens forskellige mønstre af ekspression af

miR-145

indregnes [20], intet vides om

MIR-1280

og dens adfærd i fast tumor.

En omfattende analyse af interaktive netværk af disse miRNA viste, at deres deregulering mønstre er vævsspecifik, som blev observeret uens forbindelser (dvs. forskellige korrelation mønstre) mellem dem i de to slægter. Desuden har vi bestemt de mest kritiske miRNA og kontrolleret, at de var forskellige i CRC og i pc-netværk.

For at forstå de regulatoriske mekanismer af miRNA forbundet med betydelige forbindelser i begge netværk, vi gennemførte en tre-trins

i-silico

analyse. Først, vi rangeret knudepunkter ved hjælp af kendte centrale indeks: vægtet

grad

betweenness

. Mens førstnævnte indeks forudsat indsigt i den direkte effekt udøves af hver node til nabolandene (i vores tilfælde, deres korrelation), sidstnævnte identificerede knudepunkter afgørende for indirekte sammenhænge, ​​nemlig knudepunkter, der ligger i stier korrelation, og at en eller anden måde bidrager til lang rækkevidde korrelationer. Derfor har vi rangeret noder med

clustering koefficient

indeks, for at måle graden af ​​sammenhæng med de nærmeste naboer. Formålet var at kvantificere robusthed af de netværk, ved at kigge efter de noder, der ellers ville forstyrre netværk arkitektur, når den ikke tages i betragtning. Til dette formål, vi beregnet den klynge koefficienten for hele netværk af cyklisk fjerne en node med tilsvarende kanter, og ved at anvende

vægtet grad

som vægt funktion. Generelt netværk mangler knudepunkter forudsætning for den samlede robusthed udstillet lavere score.

Som sidste skridt, vi valideret vores

i-silico

skøn ved manuelt inspicere target gener og deres signalveje. Med disse fremgangsmåder, observerede vi, at størstedelen af ​​miRNA med lignende deregulering mønstre var forbundet med fælles målgener og /eller regulatoriske pathways (se tabel S5). Især i CRC blev fundet tre vigtigste knudepunkter:

miR-195, miR-18a

, og

MIR-1246

. Den første knude havde en høj forhold til miRNA er involveret i MAPK signalvej, som vist

i-silico

analyse ved hjælp af DIANA-mirPath (https://diana.cslab.ece.ntua.gr/pathways/index_multiple php), undtagen

miR-31 og miR-28-3p

, som tilhører sti Globaliseringsfonden. Den anden node,

miR-18a

, omfattede flere miRNA (

miR-17, miR-19b, miR-92a

), der tilhører samme klynge:

miRNA 17- 92a

.