PLoS ONE: Anti-cancer effekt og de underliggende mekanismer af Gypenosides på human tyktarmskræft SW-480 celler

Abstrakt

Baggrund

Gypenosides (Gyp), de vigtigste komponenter fra

Gynostemma pentaphyllum

Makino, er meget udbredt i traditionel kinesisk medicin. Den foreliggende undersøgelse havde til formål at undersøge den anti-cancer effekt og de underliggende mekanismer Gyp på humane kolorektal kræftceller SW-480.

Materialer og metoder

Den hæmmende effekt af Gyp på SW-480 celler blev vurderet ved MTT-assayet. Apoptotisk celledød blev påvist ved nuklear Hoechst 33342-farvning og DNA-fragmentering analyse. Apoptose blev analyseret ved anvendelse Annexin V-PE /7-amino-actinomycin D farvning. Cellemembranintegritet blev evalueret med flowcytometri efter PI farvning. Ændringer af mitochondriemembranpotential (

Δψ

m) blev påvist gennem flowcytometri analyse af rhodamin 123 (Rh123). Rollen af ​​reaktive oxygenarter (ROS) i Gyp induceret celledød blev undersøgt ved intracellulær ROS-generering og generel ROS scavenger. Sårheling assay blev udført for at undersøge Gyp-hæmmede migration af SW-480 celler

in vitro

. Derudover blev de ændringer i F-actin mikrofilamenter analyseret af FITC-mærket phalloidin toksin farvning og morfologiske ændringer blev evalueret under scanning elektron mikroskop (SEM).

Resultater

Efter Gyp behandling, plasmamembran permeabilitet SW-480 celle den blev forøget,

Δψ

m faldt betydeligt, niveauet af intracellulær ROS niveauet blev forøget, DNA-fragmentering og apoptotisk morfologi blev observeret. Celler behandlet med Gyp øve alvorlig microfilament netværk kollaps samt det betydelige fald i antallet af mikrovilli. Gyp inducerede ændringer i cellernes levedygtighed, cellemigration, intracellulær ROS generation og nuklear morfologi blev lindret naturligvis af NAC.

Konklusion

Resultaterne i denne undersøgelse indebar, at ROS spiller en vigtig rolle i Gyp induceret celletoksicitet og apoptose, og den skade mitokondrier kan være opstrøms for ROS-generering efter Gyp behandling. Resultaterne af denne undersøgelse give nye beviser for anti-tumor mekanismer, som Gyp inducerer apoptose

in vitro

Henvisning:. Yan H, Wang X, Niu J, Wang Y, Wang P Liu Q (2014) Anti-cancer effekt og de underliggende mekanismer af Gypenosides på human tyktarmskræft SW-480 celler. PLoS ONE 9 (4): e95609. doi: 10,1371 /journal.pone.0095609

Redaktør: Nukhet Aykin-Burns, University of Arkansas for Medical Sciences; College of Pharmacy, USA

Modtaget: 16. december 2013; Accepteret: 27 Marts 2014; Udgivet: 21 April, 2014

Copyright: © 2014 Yan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National “tolvte femårsplan” Plan for Videnskab og Teknologi Support (2011BAI06B05). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en førende dødsårsag på verdensplan, med næsten en million nye tilfælde og 500.000 dødsfald fra CRC rundt om i verden hvert år [1], [2]. Der er mange risikofaktorer for CRC, herunder høj alder, inflammatoriske tarmsygdomme, medicinsk historie af godartede adenomatøs polypper, slægtshistoriske af CRC, lavt indtag af grøntsager og frugter, højt indtag af animalsk fedt og forarbejdede kød [3], [4] .

i klinisk CRC behandling, traditionelle behandlingsformer såsom strålebehandling, kemoterapi og kirurgi er ikke den bedste kur metode til det på grund af dårlig prognose og alvorlige bivirkninger. Derfor er yderst presserende søge efter hidtil ukendte anti-tumor-terapeutiske midler. Nu har naturmedicin i kræftbehandling vakt bred bekymring hjemme og i udlandet, på grund af dets sikkerhed, effiiciency og minimale bivirkninger [5].

Gypenosides (Gyp), en populær folkemedicin i Kina, er de vigtigste komponenter i ekstrakter fra

Gynostemma pentaphyllum

Makino. Det eksisterer hovedsagelig som dammarane type- triterpenglycosider (figur 1). Gyp havde været kendt for sine brede gavnlige virkninger til behandling af hepatitis, hyperlipoproteinæmi og hjertekarsygdomme [6] – [8]. Undersøgelser har vist, at Gyp har en aktivitet på anti-inflammatoriske, anti-thrombotisk, antioxidative og anti-cancer aktioner [9] – [12]. Men indtil nu er der ingen rapport om Gyp-induceret anti-tumor effekt på humane kolorektal kræft. Så i den foreliggende undersøgelse, blev cytotoksicitet og apoptose af SW-480-celle induceret af Gyp undersøgt. Rolle af reaktive oxygenarter (ROS) i Gyp celledød blev analyseret ved intracellulær ROS-generering og ROS scavenger. Disse resultater kan give beviser til rollen som Gyp som en potent anti-kolorektal cancer agent i klinisk anvendelse.

Materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

Gyp er venligst leveret af Ankang Pharmaceutical Institute of Beijing University. Pulveret blev opløst i 80% ethanol (EtOH) for at få en stamopløsning på 100 mg /ml, som blev steriliseret ved en 0,22 um membran filtrering. 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltertrazolium bromid tetrazolium (MTT), rhodamin-123 (Rh123), Hoechst 33342, propidiumiodid (PI) og N-acetylcystein (NAC) blev indkøbt fra Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA). 2 ‘, 7’dichlorodihydrofluorescein-diacetat (DCFH-DA) og FITC-phalloidine blev leveret af Molecular Probes Inc. (Carlsbad, CA, USA). Guava nexin Reagens blev opnået fra Millipore Corporation (Billerica, MA, USA). Alle de andre reagenser var kommercielle produkter af analytisk kvalitet.

Cell Culture

De menneskelige tyktarmskræft SW-480 celler blev opnået fra cellen bank af det kinesiske Academy of Science, Shanghai, Kina. Cellelinien blev dyrket i RPMI-1640-medium indeholdende 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin (100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) og 1% glutamin i cellekultur kolbe under en befugtet 5% CO

2 og 95% luft atmosfære ved 37 ° C.

Vurdering af cellelevedygtighed efter Gyp Behandling

for at undersøge effekten af ​​Gyp på SW-480 celleproliferation, celler blev podet i 96-brønds plader. Forskellige koncentrationer (0, 70, 100 og 130 ug /ml; 80% ethanol blev anvendt som opløsningsmiddel kontrol) af Gyp tilsat, og cellerne blev inkuberet i forskellige tidsrum, ved en densitet på 1 x 10

5 celler /ml. Cellelevedygtigheden blev bestemt ved anvendelse MTT-assayet [13]. Absorbansen ved 570 nm blev registreret ved anvendelse af en mikropladelæser (Bio-Tek ELX800, USA). Cellelevedygtigheden af ​​Gyp behandlede prøver blev derefter opnået ved sammenligning med kontrollen.

flowcytometrianalyse af cellemembranintegritet

PI er et fluorescerende membran-impermeabel farvestof, som farver kerner ved interkalerende mellem de stablede baser af nukleinsyre. Siden PI trænger ind i cellen, hvis cellemembranen bliver permeabel, er det meget udbredt i celledød forskning for at måle integriteten af ​​plasmamembranen. Når de bindes til nukleinsyrer, absorptionsmaksimum for PI er 535 nm og maksimalt fluorescens-emissionen er 617 nm [14]. Celler i plader med 24 brønde blev behandlet med den angivne koncentration af Gyp til 6, 12, 24 og 48 t. Derefter blev cellerne høstet og skyllet to gange med PBS, farvet med 5 pg /ml PI i 5 minutter i mørke og analyseret ved flowcytometri. Data blev analyseret ved hjælp af FCS Express V3 (De Novo Software).

Undersøgelse af mitokondrie membranpotentiale (Δψ

m)

For at undersøge

Δψ

m ændringer blev celler farvet med Rh123, som selektivt går ind mitokondrier med en intakt membran potentiale og fastholdes i den mitokondriske [15]. Når potentialet mitokondrier membran er tabt, er Rh123 vaskes efterfølgende ud af cellerne. Celler i plader med 24 brønde blev behandlet med den angivne koncentration af Gyp til 4 og 8 timer. Cellerne blev høstet og skyllet to gange med PBS, resuspenderet i 500 pi 1 ug /ml Rh123 og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter i mørke. Prøverne blev derefter straks detekteret ved flowcytometri. Data blev analyseret ved hjælp af FCS Express V3 (De Novo Software).

flowcytometri analyse af DNA fragmentering

For at analysere DNA-fragmentering, flowcytometrisk detektion af DNA hypoploidy efter tilsætning PI til de døende celler og permeabilisering dem ved frysning-optøning blev udført [14]. Størrelsen af ​​DNA-fragmenter vises som en hypoploid DNA histogram. For at undersøge virkningen af ​​Gyp på DNA beskadigelse af SW-480-celler, udførte vi oligonucleosomal DNA-fragmentering ved flowcytometri. Celler i plader med 24 brønde blev behandlet med forskellige koncentrationer af Gyp til 6, 12, 24 og 48 t. Cellerne blev derefter farvet med 5 ug /ml PI og analyseret for DNA-indhold ved hjælp af flowcytometri.

Hoechst 33342 Farvning

For at observere ændringer i kerner morfologi af tumorceller efter Gyp behandling, Hoechst 33342-farvning blev anvendt. Efter behandling med den angivne koncentration af Gyp til 6, 24 og 48 timer blev celler farvet med 10 pM Hoechst 33342 i 15 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev de farvede celler skyllet tre gange med PBS og iagttaget ved anvendelse af et fluorescensmikroskop med standard excitationsfiltre. Excitationsbølgelængden og emissionsbølgelængde var 346 nm og 460 nm.

Analyse af celleapoptose

Cell apoptose blev påvist efter behandling med den angivne koncentration af Gyp til 12 og 24 timer. Kvantificering af celleapoptose blev målt ved Guava nexin assay som anvender Annexin V-PE til påvisning af phosphatidylserin på den ydre membran af apoptotiske celler. Membranen-impermeabel farvestof, 7-amino-actinomycin D, bruges også som en indikator for cellemembranens integritet. Kort beskrevet blev 100 pi celler af hver prøve suspenderet i en blanding af 100 pi Annexin V-PE og 7-ADD bindingsbuffer. Efter inkubation ved stuetemperatur i 20 minutter blev prøver analyseret ved flowcytometri. Befolkningen blev opdelt i tre grupper: levende celler med lavt niveau fluorescens, de apoptotiske celler i tidligere stadier med grøn fluorescens, og de sene apoptotiske celler med både rød og grøn fluorescens

Sårheling Assay

.

Celler blev podet i 24-brønds plader og inkuberet 24 timer. Derefter celler i individuelle brønde blev såret ved at skrabe med en pipettespids og behandlet med den angivne koncentration af Gyp. Efter 24 timers inkubation blev cellerne fotograferet under fasekontrastmikroskopi.

Microfilament Analyse

Efter forskellig behandling blev cellerne fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved 37 ° C. Celler blev permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i PBS i 7 min og blokeret med 1% BSA i PBS i 1 time ved 37 ° C. Mellem hvert trin ovenfor beskrevet blev celler vasket tre gange med PBS i 5 minutter ved 37 ° C. Efterfulgt blokerende celler blev farvet med 5 pg /ml FITC-phalloidine i 1 time ved 37 ° C i mørke. Billeder blev opnået ved laserscanning konfokal mikroskop (TCS SP5, Leica, Tyskland).

Scanning Electron Microscope (SEM) Observation

Efter 24 timer efter forskellige behandlinger, celler i hver gruppe, er fastsat i phosphatpufret 2,5% glutaraldehydopløsning, skyllet med PBS og dehydratiseret ved gradueret alkohol, kritisk punkt-tørret fra flydende CO

2 og guld katodeforstøvet. Overfladerne af cellerne blev observeret ved scanning elektron mikroskop (S-3400N, Hitachi, Japan).

Påvisning af intracellulære Reaktive Oxygen Species (ROS) Generation og dens rolle i Gyp Forårsaget Cytotoksicitet

for at bestemme ændringer i ROS niveau, vi måler den oxidative omdannelse af den følsomme fluorescerende probe 2 ‘, 7′-dichlorofluorescein-diacetat (DCFH-DA) til fluorescerende 2′, 7’-dichlorofluorescein (DCF). DCFH-DA let diffunderer gennem cellemembranen og enzymatisk hydrolyseres af intracellulære esteraser til dannelse ikke-fluorescerende DCFH, som derefter hurtigt oxideres til dannelse stærkt fluorescerende DCF i nærvær af ROS, og fluorescensintensiteten er proportional med ROS-produktion. Celler i plader med 24 brønde blev behandlet med den angivne koncentration af Gyp til 4 og 8 timer. Cellerne blev høstet og skyllet to gange med PBS, resuspenderet i 500 pi 10 pM DCFH-DA og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter i mørke. Prøverne blev derefter straks detekteret ved flowcytometri. Data blev analyseret ved anvendelse FCS Express V3 (De Novo Software).

Sådan undersøgte rollen af ​​ROS i Gyp induceret celledød og apoptosis, NAC (5 mM) blev anvendt som en ROS-inhibitor sættes til dyrkningsmediet før lastning Gyp af 1 time. Faldet cellernes levedygtighed, intracellulær ROS generation,

Δψ

m tab den nukleare morfologiske ændringer og cellemigration hæmning var specielt analyseret som beskrevet ovenfor.

Statistisk analyse

data er udtrykt som middelværdier ± standardafvigelse af mindst tre uafhængige forsøg. Statistisk analyse blev udført ved envejs variansanalyse. Statistisk signifikans blev etableret i

s

. 0,05

Resultater

Effekter af Gyp på Cell Levedygtighed

Figur 2 viste, at Gyp hæmmede SW-480 celleproliferation i en dosis- og tidsafhængig måde. Den levedygtighed blev signifikant nedsat, da Gyp dosis 70 mg /ml eller derover (

s

0,01) og den langvarige inkubation forbedret tabet levedygtighed. IC50-værdierne var omkring 91,77 og 83,8 ug /ml, når cellerne blev inkuberet med Gyp i 24 og 48 t.

SW-480 blev podet i 96-brønds plader og behandlet med 0, 70, 100 og 130 ug /ml Gyp for 24 og 48 timer. Cellelevedygtighed blev målt ved MTT-assayet. Hver værdi er udtrykt som et gennemsnit ± S.D. af mindst tre uafhængige bestemmelser. Envejs ANOVA blev anvendt til sammenligninger af multipel gruppe betyder efterfulgt af Dunnetts t-test. **

P

0,01 versus kontrol. (Fejllinjer = SD, n = 3).

Gyp-induceret plasmamembran Skader af SW-480 Celler

PI farvning kombineret med flowcytometri blev brugt til at evaluere Gyp-induceret beskadigelse af cellemembranen. I SW-480-celler, skader membran som et tidligt tilfælde af Gyp induceret cellebeskadigelse (figur 3). Efter inkubation i 6 timer, procentdelen af ​​celler med højere PI-fluorescens steg gradvist fra 10.07% til 21,93%, når cellerne blev eksponeret for Gyp dosisområde fra 70 til 130 ug /ml. Celler eksponeret for 70 ug /ml Gyp viste ikke meget forøget skade cellemembranen med forlænget inkubationstid. Mens celler efter 100 ug /ml og 130 ug /ml Gyp behandling blev skade cellemembranen stærkt forøget ved forlænget inkubationstid, ca. 46,27% og 67,87% af cellerne viste høj PI-fluorescens ved 48 timer efter behandling, henholdsvis.

Cellerne blev behandlet med Gyp til 6, 12, 24 og 48 (lodret akse) vs. PI fluorescens (vandret akse).

Gyp-inducerede Δψ

m Tab i SW-480 Celler

Rh123 farvning kombineret med flowcytometri blev anvendt til at evaluere Gyp-induceret

Δψ

m ændringer. Som vist i figur 4, det viser, at Gyp inducerede tabet af

Δψ

m ganske tidligt og forårsagede faldet i

Δψ

m på en dosis- og tids- afhængig måde. Efter 4 timers inkubation, procentdelen af ​​celler med

Δψ

m tab steg fra 9,9% til 28,8%, når Gyp steg fra 70 ug /ml til 130 ug /ml. Når inkubationstiden steget fra 4 til 8 timer, procentdelen af ​​celler med

Δψ

m tab steg fra 16,65% til 20,95%, når Gyp var 100 mg /ml.

Celler blev behandlet med Gyp til 4, 8 timer og mærket med rhodamin 123 og analyseret ved flowcytometri. Histogrammer viser antal celle-kanal (lodret akse) vs. rhodamin 123 fluorescens (vandret akse).

Gyp-induceret DNA Opsplitning af SW-480 Celler

For at bestemme DNA skade aktivitet af Gyp blev procentdelen af ​​beskadigede celler analyseret ved anvendelse af PI-farvning ved flowcytometri som beskrevet i fremgangsmåderne. Som vist i figur 5, Gyp inducerede DNA-fragmentering var på en dosis- og tidsafhængig måde. Ingen signifikant DNA-fragmentering blev påvist ved anden dosis af Gyp efter behandling 6 timer, medens en betydelig mængde af store DNA-fragmentering blev observeret ved den højere dosis Gyp (100, 130 ug /ml) efter 12 h inkubation, og DNA’et skader i lavere Gyp dosis (70 ug /ml) behandlede celler ikke forbedret med forlænget inkubationstid. Efter 48 h inkubation, DNA-fragmentet af kontrolgruppen er 2,37%, steg til 10,03%, 26,33% og 56,07%, når Gyp concertration var 70, 100 og 130 ug /ml.

Celler blev behandlet med Gyp til 6, 12, 24 og 48 (lodret akse) vs. PI fluorescens (vandret akse).

GUF-induceret morfologiske ændringer af SW-480 Cells

Figur 6 viste resultaterne af Hoechst 33342-farvning i SW-480-celler behandlet med Gyp. Svagt blå og homogen celle blev observeret i kontrolgruppen. Celler i Gyp behandlede grupper udviste forbedring af Hoechst 33342-farvning og skift af cellemorfologi i en Gyp-dosis og inkubationstid-tidsafhængig måde. Da Gyp koncentrationen var over 100 mg /ml, blev SW-480 celler alvorligt skadet med lyse blå nukleare farvning og fase billeder angivne celler var skrumpet til unormal runde type, og cellen nummer blev signifikant nedsat.

Celler blev behandlet med Gyp i de angivne koncentrationer i 6, 24, 48 “Materialer og metoder”.

Påvisning af Cell Apoptose under anvendelse af flowcytometri

apoptotiske blev målt ved Annexin V -PE og 7-ADD farvning efter 12,24 h efter forskellige behandlinger. Fraktionerne af celler i hver kvadrant blev analyseret ved kvadrantlinierne statistikker [16]. Som vist i figur 7, de procentdele af celler med Annexin V-positiv farvning steg gradvist i en koncentrationsafhængig måde efter Gyp behandling, hvilket antyder, at Gyp kunne inducere apoptotisk respons i SW-480-celler. I ubehandlede kontrolgruppe, 94.85% celler var levedygtige, 1,45% cellepopulationen var i den tidlige fase af apoptose (nederst til højre) og 2,95% cellepopulation var i den sene fase af apoptose (øverst til højre). Mens, efter 12 timers inkubation med Gyp, den apoptotiske celle population (nederste højre + øverst til højre) steg fra 25,40% til 38,70%, når lægemiddelkoncentrationen steg fra 70 ug /ml til 130 ug /ml. Når inkubationstiden steget fra 12 til 24 timer, den apoptotiske cellepopulation steg fra 29,45% til 41,70%, når Gyp var 100 ug /ml.

Dot plots af Annexin V og 7-AAD-optagelse efter angivne koncentrationer i SW-480-celler. Celler blev analyseret på 12, 24 timer efter behandling.

Gyp Hæmmet Migration af SW-480 In vitro

For yderligere at verificere hæmmende virkning af Gyp på SW-480 celle migration, en sårhelende assay blev udført (figur 8). Den sårhelende evne af celler afspejler deres bevægelse og migration på den overflade, hvorpå de er forankret til for vækst. Sammenlignet med 0 timer efter sårdannelse, Efter 24 timers inkubation, meget tætte celler i kontrol voksede gradvist til mellemrummet af såret, celler i 70 ug /ml Gyp behandlede gruppe udviste lille forskel med kontrol forskel med kontrol, mens celler i 100 ug /ml og 130 ug /ml Gyp behandlede grupper voksede sjældent til mellemrummet af såret, og celletætheden blev alvorligt nedsat.

celler i plader med 24 brønde blev såret ved at skrabe med en pipettespids, og cellerne blev inkuberet med Gyp i 24 timer. Cellerne blev fotograferet under fase-kontrast mikroskopi (× 200 forstørrelse).

Microfilament Analyse

Det er velkendt, at cytoskeleton elementer tæt knyttet til celle bevægelse [17], [ ,,,0],18]. Ændringerne af F-actin mikrofilamenter organisation i SW-480-celler efter Gyp behandlet blev undersøgt ved fluorescensmikroskopi under anvendelse FITC-mærket phalloidin toksin. Som vist i figur 9, viste kontrolceller en regelmæssig række af definerede actinfilamenter stede langs cellerne, jævnt fordelt i cytoplasmaet, medens celler i 100 ug /ml Gyp viste en desorganisering af actinfilamenter, en stigning på actin stree fibre og grøn fluorescens pletter blev observeret. Celler behandlet med 130 ug /ml Gyp demonstrerede en absolut beskadigelse af actin netværk og fuldstændig forsvinden af ​​actinfilamenter.

Celler blev farvet med phalloidin (grøn) til F-actin. Scale barer, 10 um.

SEM Observation

blev observeret morfologiske ændringer under SEM (figur 10). I kontrolgruppen, celler dukkede epitel i form med talrige mikrovilli over overfladen af ​​cellen. Mens i 70 ug /ml, viste cellerne en signifikant reduktion i antallet af mikrovilli, overfladen af ​​mange celler bliver relativt glat med nogen indlysende mikrovilli. Da Gyp dosis var over 100 ug /ml, blev SW-480-celler alvorligt skadet med tilsyneladende deformation, indskrumpet til unormal runde type, og celletallet blev signifikant reduceret. Mens i 130 ug /ml blev nogle papillous fremspring observeret på overfladen af ​​celler, hvor cytoplasmaet syntes at have ekstruderes gennem membranen grænsen.

Forstørrelse af billederne var 1500 og 5000 × hhv. Scale barer:. 30, 10 um

ROS Involveret i Gyp-induceret SW-480 Cytotoksicitet

Den intracellulære ROS produktionen blev analyseret ved flowcytometri med DCFH-DA farvning. De i figur 11 data tyder den intracellulære ROS-niveauer blev forøget efter Gyp behandling, ved 4 timer efter behandling, der var omkring 13,97%, 21% og 13,07% af cellerne i 70, 100 og 130 ug /ml Gyp behandlede grupper udviste lyse DCF fluorescens, mens kun 5,43% af celler i kontrolgruppen udviste lyse DCF fluorescens. Når inkubationstiden øget fra 4 til 8 timer, procentdelen af ​​celler med lyse DCF fluorescens steg til 29,77%, 35.97% og 33,43%, når Gyp var 70, 100 og 130 ug /ml. Vi fandt ROS-generering blev først steg med stigende Gyp koncentration og faldt derefter lidt ved meget højere Gyp dosis, hvilket kan skyldes flere cellelyse forårsaget af Gyp behandling ved højere medikamentkoncentration.

Celler blev behandlet med Gyp for 4 blev 8-DA og fluorescensintensiteten af ​​det oxiderede produkt DCF i individuelle celler påvises ved flowcytometri. Procentdelen af ​​fluorescerende celler i hver gruppe blev vist.

For yderligere at undersøge, om intracellulær ROS elevation var involveret i Gyp-induceret celledød, vi udførte efterfølgende analyser. Resultat i figur 12A viser, at den faldt cellelevedygtighed forårsaget af Gyp høj grad blev reddet af NAC (

s

0,05). Derudover Gyp forårsagede intracellulære ROS-generering, chromatinkondensering og cellemigration inhibering blev alle synligt forhindret af NAC (Figur 12B-D). Men den faldt,

Δψ

m skyldes Gyp blev ikke forhindret af NAC (figur 12E). Disse resultater indikerer, at ROS var involveret i Gyp-induceret skade i SW-480 celler og

Δψ

m tab kan være en vigtig opstrøms aktivator af ROS generation, og den øgede ROS kan blive stimuleret af den beskadigede mitokondrier.

(A) Cell levedygtighed, (B) intracellulære ROS generation, (C) nukleare morfologiske ændringer, (D) cellemigration, (E)

Δψ

m tab var specielt analyseret som beskrevet i “Materialer og metoder”.

diskussion

Kræft er en kompleks sygdom, og de traditionelle behandlinger mod kræft har ikke udviklet sig betydeligt i de sidste par år. De vigtigste begrænsninger ved kirurgi, kemoterapi og strålebehandling er at de forårsager alvorlige bivirkninger og dårlig prognose som følge af toksicitet af ikke-kræftvæv og kemoresistens [19]. Imidlertid har naturmedicin vakt bred bekymring inden for cancer kemoterapi på grund af sikkerhed, effektivitet og anti-multiresistens.

Gyp er blevet brugt som traditionel kinesisk urtemedicin i hundreder af år på grund af sine mange forskellige sundhed fordele [20] – [22]. I den foreliggende undersøgelse Gyp induceret apoptose i humane kolorektal cancer SW-480-celler blev undersøgt.

Resultaterne viste, at Gyp faldt procentdelen af ​​levedygtige celler i SW-480-celler. I mellemtiden har tidligere undersøgelser vist, at den cytotoksiske virkning af Gyp på normale PBMC-celler var meget mindre [23]. Resultaterne antyder, at Gyp er stand til at udøve forskellige alternative cytotoksicitet i kræftceller og normale celler, som kan være potentielt nyttig som en kræft forebyggende eller behandlingsmiddel.

Cellelinien SW-480, etableret fra den primære adenocarcinoma opstår i tyktarmen, var Duck scene B (Dukes ‘B betyder, at kræften er vokset gennem musklen lag af tyktarmen eller endetarmen, invaderet gennem skål væg, men lymfeknuder klare) [24]. Spread er gennem lokal invasion gennem skålen væg og via lokale lymfekarrene, blod (portal vene i leveren) og transcoelomic. Derfor metastase er en af ​​de største udfordringer for en vellykket cancerbehandling [25] og forebyggelse af cancermetastase er så vigtigt mål for forbedring af en patients prognose. I denne undersøgelse undersøgte vi, om Gyp kunne inhibere migreringen af ​​SW-480-celler. Resultater i figur 8 foreslog Gyp inhiberede migration af celletypen i et Gyp dosisafhængig måde. Actincytoskelettet er en strukturel netværk af proteiner, der er væsentlige for flere biologiske funktioner, herunder celle sammentrækning, cellemotilitet og vesikeltrafik et al [26], [27]. Ændringerne i cellulære rum kan påvirke dynamikken i celleadhæsion [18]. Figur 9 eksponeret ændringerne i microfilament, uordnede arrangement af F-actin og fuldstændig forsvinden af ​​microfilament netværk blev observeret i 100, 130 ug /ml Gyp. Desuden, som vist i figur 10, at antallet af mikrovilli blev signifikant nedsat, når Gyp dosis var 70 pg /ml eller derover. Resultaterne tyder Gyp inducerer microfilament netværk sammenbrud, og i sidste ende, skade celleform og migration evne.

Apoptose spiller en vigtig rolle i homøostase og kan induceres og reguleres af mange signal stimulus pathways [28], [29 ]. Dysregulering af apoptose betragtes som en væsentlig kræft adelsmærke, så apoptose induktion er velsagtens den mest potente forsvar mod kræft [30], [31]. Mange undersøgelser har vist, at forskellige forbindelser ekstraheret fra planter kunne inducere apoptose i mange cancerceller [29], [32], [33]. DNA-fragmentering og nogle morfologiske karakteristika, herunder membranblæredannelse, cellulær krympning, chromatin kondensering og dannelse af apoptotiske legemer er typiske biokemiske træk ved apoptose [34], [35]. I nærværende undersøgelse, Gyp kunne forårsage åbenbar DNA fragmentation i SW-480-celler på en dosis- og tidsafhængig måde. Desuden Hoechst 33342 farvning assay viste nogle morfologiske karakteristika efter Gyp behandling såsom celle svind, kromatin kondensering med marginering af kromatin til kernemembranen og fragmenteret punktformig blå nukleare fluorescens i SW-480 celler. Endelig figur 7 foreslå Gyp kunne øge de apoptotiske celler og mindske de levedygtige celler, der angiver apoptotiske respons blev markant forstærket efter Gyp i SW-480 celler. Derfor indikerer resultaterne Gyp kunne inducere apoptose i SW480 celler.

beskadigelse af cellemembranen systemet vil medføre membran depolarisering, disturbe asymmetri af membran er lipider, fremkalde hæmning af membran enzymer, forårsager tabt af plasma membran integritet [36 ], og disse cellulære funktioner kan i sidste ende inducere celle apoptose ved ansættelse af dødsreceptorer [37]. Farvning med PI og analyseret ved flowcytometri viste, at Gyp forårsagede skader cellemembranen var en tidlig begivenhed. Vi spekulere, at mekanismen for gypenosides i plasma skader membran måske på grund af aglyconerne af gypenosides [38] har dets virkningssted på cellemembranen og dermed skade cellemembranen eller ankommer celler til at forhindre tumorvækst.

mitokondrier spiller en vigtig rolle i progressionen af ​​apoptose [39]. Derfor mitokondrier membranpotentialet ændringer efter forskellige koncentration af Gyp behandling i SW-480 celler blev målt. I undersøgelsen, faldt

Δψ

m var på tidligt 4 timer efter Gyp behandling og forbedret ved stigende koncentration af Gyp, hvilket tyder Gyp induceret celle apoptose i SW-480 celler kan være mitokondrier afhængige.

Desuden Enhancement af ROS produktion er blevet forbundet med den apoptotiske respons induceret af flere pro-apoptotiske forbindelser [40]. Vores resultater viste Gyp behandling signifikant stimulerede ROS-generering i SW-480-celler. NAC, et scavenger af ROS, blev anvendt til at bekræfte virkningen af ​​ROS efter Gyp behandling. NAC reddet Gyp induceret SW-480 cytotoksicitet, intracellulær ROS generation, nukleare morfologiske ændringer og cellevandring hæmning, men væsentligt ikke

Δψ

m fald, hvilket indebærer ROS spillede en vigtig rolle i Gyp induceret SW-480 celletoksicitet og celle apoptose, og ROS-generering var nedstrøms for mitokondrier skader efter Gyp behandling, og den øgede ROS produktionsomkostninger blive stimulere de beskadigede mitokondrier i vores eksperimentelle system.

som konklusion den foreliggende undersøgelse evaluerede cytotoksicitet af Gyp i SW-480 celler, viste, at Gyp kan forårsage cellemembranen integritet skader, mindske

Δψ

m niveau, inducerer DNA-fragmentering og initiere apoptotisk respons i SW-480 celler. ROS genereret i SW-480-celler spiller en vigtig rolle i Gyp induceret celledød. Og, spekuleres det, at Gyp induceret celle apoptose i SW-480-celler kan være dødsreceptorer pathway og mitokondrier afhængig. Derudover vores undersøgelse viste også, at Gyp kunne udøve en hæmmende virkning på celle migration

in vitro

og alvorlig microfilament netværk kollaps samt det betydelige fald i antallet af mikrovilli. Disse resultater tyder Gyp fremkalde microfilament netværk kollaps og sårer cellens form og migration evne. Disse undersøgelser antyder Gyp kan have stor værdi i humane kolorektale kræftbehandling. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at forklare de molekylære mekanismer i Gyp i cancerbehandling.