PLoS ONE: PSMB9 codon 60 Polymorfier har ingen indflydelse på aktiviteten af ​​Immunoproteasome katalytiske subunit B1i Udtrykt i flere typer af Solid Cancer

Abstrakt

proteasomet er en vigtig regulator af cellulær protein homeostase og er en klinisk valideret anticancer target. Den immunoproteasome, en undertype af proteasom hovedsageligt udtrykt i hæmatopoietiske celler, blev oprindeligt anerkendt for sin rolle i antigenpræsentation under immunresponset. For nylig er immunoproteasome været impliceret i flere sygdomstilstande, herunder cancer og autoimmune sygdomme, men mange af de faktorer, der bidrager til disse patologiske processer fortsat ukendt. Især codon 60 polymorfi af

PSMB9

gen kodende for β1i immunoproteasome katalytiske subunit er blevet undersøgt i forbindelse med en række sygdomme. På trods af dette, har tidligere undersøgelser hidtil rapporteret inkonsistente resultater vedrørende effekten af ​​denne polymorfi på proteasom aktivitet. Således har vi satte os for at undersøge virkningen af ​​

PSMB9

codon 60 polymorfi på ekspressionen og aktiviteten af ​​det β1i immunoproteasome underenheden i et panel af menneskelige kræftceller. Den β1i-selektive fluorogent substrat Acetyl-Pro-Ala-Leu-7-amino-4-methylcoumarin blev anvendt til specifikt at måle β1i katalytisk aktivitet. Vores resultater viser, at codon 60 Arg /His polymorfi ikke væsentligt ændrer ekspressionen og aktiviteten af ​​β1i blandt de testede cellelinier. Derudover undersøgte vi også ekspressionen af ​​β1i i kliniske prøver fra colon og pancreas kræftpatienter. Vores immunhistokemiske analyser viste, at -70% af kliniske prøver tyktarmskræft og ~53% af kræft i bugspytkirtlen prøver har påviselig β1i udtryk. Tilsammen vores resultater viser, at β1i subunit af immunoproteasome ofte udtrykkes i colon og pancreascancer men at codon 60 genetiske varianter af β1i udvise lignende katalytiske aktiviteter og er usandsynligt, at bidrage til den signifikante inter-cellelinje og inter- individuelle variabilitet i immunoproteasome aktivitet

Henvisning:. Park JE, Ao L, Miller Z, Kim K, Wu Y, Jang ER, et al. (2013)

PSMB9

Codon 60 Polymorfier har ingen indflydelse på aktiviteten af ​​Immunoproteasome katalytiske subunit B1i Udtrykt i flere typer af Solid Cancer. PLoS ONE 8 (9): e73732. doi: 10,1371 /journal.pone.0073732

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: May 10, 2013; Accepteret: 20 Jul 2013; Udgivet: 9. september, 2013 |

Copyright: © 2013 Park et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Cancer Institute tilskud, R15CA156601 og R01CA128903 og Kentucky Lung Cancer Research Program. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

proteasomet er ansvarlig for nedbrydningen af ​​målrettede proteiner og er en central aktør i opretholdelsen af ​​cellulære protein homeostase og regulering af cellulære processer, der er afgørende i udviklingen af ​​kræft og progression [1], [2]. Den immunoproteasome, en alternativ form af proteasomet, findes i celler af hæmatopoietisk oprindelse, men dets ekspression kan også induceres under inflammatoriske og stress betingelser i andre celletyper [3]. Den immunoproteasome dannes, når de tre typer katalytiske subunit fundet i konstitutive proteasomet, β1 (Y,

PSMB6

), β2 (Z,

PSMB7

) og β5 (X,

PSMB5

), erstattes af tre homologe immun-underenheder: β1i (LMP2,

PSMB9

), β2i (MECL-1,

PSMB10

) og β5i (LMP7,

PSMB8

). Sammenlignet med den konstitutive proteasomet er immunoproteasome sig at have lidt ændrede proteolytiske specificiteter, som er stand til at producere peptider mere egnet til binding til den dominerende histokompatibilitetskompleks I-molekyler og dermed letter antigenpræsentation [4]. seneste undersøgelser viser dog, at immunoproteasome kan have vigtige funktioner ud over det adaptive immunrespons. For eksempel er det immunoproteasome sig at blive udtrykt i ikke-betændte, immun-previleged væv (f.eks nethinden og hjernen [5], [6]) og i forbindelse med flere sygdomstilstande (fx cancer, neurodegenerative sygdomme, autoimmune sygdomme, [3], [7] og referencer deri). På trods af disse observationer, er den biologiske betydning af immunoproteasome i sådanne sygdomstilstande ikke fuldt forstået.

β1i underenhed af immunoproteasome er kodet af

PSMB9

gen placeret på kromosom 6. Dette gen rummer en almindeligt forekommende genetisk R /H polymorfi ved codon 60 (p.60R H; c.179G a; rs17587) med H allelfrekvenserne på 1,1% til 34%, varierende på tværs af etniske grupper ([8] og referencer deri) . Adskillige undersøgelser har rapporteret potentielle associationer mellem codon 60

PSMB9

polymorfi status og øget følsomhed over for forskellige sygdomme, såsom insulinafhængig diabetes mellitus, rheumatoid arthritis og dissemineret sklerose [8] – [16]. Det er dog vanskeligt at dechifrere fra tidligere undersøgelser, om de observerede associationer er direkte relateret til den ændrede aktivitet β1i subunit som følge af R /H aminosyre variation. Dette er til dels skyldes den gensidige afhængighed af proteasom-underenheder og manglen på egnede molekylære prober. En tidligere undersøgelse af Mishto et al. [17] undersøgte nærmere på virkningen af ​​denne polymorfi på proteasom aktivitet i alderen hjernen ved hjælp af fluorogene peptidsubstrat N-succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Suc-LLVY-AMC). Resultaterne fra denne undersøgelse antydede, at H allel resulterer i en nedsat proteasomaktivitet i den ældede hjerne [17]. Men da Suc-LLVY-AMC almindeligvis anvendes til at måle de samlede chymotrypsin-lignende (CT-L) proteolytiske aktivitet af proteasomet og således kan hydrolyseres af flere underenheder af både immunoproteasome og den konstitutive proteasomet, denne nedgang i hydrolysen af Suc-LLVY-AMC ikke nødvendigvis indikere ændringer i β1i funktion. Desuden en efterfølgende undersøgelse af den samme gruppe anvendelse af rekombinante peptider efterligner endogene substrater angivet ingen forskelle i underlaget hydrolyse profiler mellem codon 60 genotyper [18].

Meget af uoverensstemmelsen vedrører den funktionelle virkning af de PSMB9 codon 60 polymorfi skyldes manglen på et værktøj til specifikt at observere funktion β1i underenhed. I denne henseende Lin et al. [19] og Blackburn et al. [20] for nylig rapporteret om udviklingen og anvendelsen af ​​det fluorogene substrat Acetyl-Pro-Ala-Leu-7-amino-4-methylcoumarin (Ac-PAL-AMC), som hydrolyseres selektivt ved β1i. Denne roman værktøj har gjort det muligt at vurdere den direkte funktionelle konsekvenser af

PSMB9

codon 60 polymorfi på β1i underenhed. I vores nuværende undersøgelse undersøgte vi ekspressionen af ​​β1i i kliniske colon og pancreas cancer væv samt i etablerede humane cancercellelinier. Brug af β1i-selektive fluorogent substrat Ac-PAL-AMC, vurderede vi også den katalytiske aktivitet af β1i i multiple cancercellelinier bærer forskellige genotyper ved kodon 60. Vores resultater indikerede, at β1i er ofte udtrykt i kolon og pancreascancer, men kodonet 60

PSMB9

polymorfi har nogen væsentlig indvirkning på den katalytiske aktivitet af β1i udtrykt i flere typer af kræft cellelinjer.

Materialer og metoder

Cell kultur og reagenser

Etableret cellelinjer afledt af forskellige typer af humane kræftformer (kolon, HCT-8, DLD-1, HCT-116, SW480, lunge, H23, H358, H460, H727, H1299, prostata, PC-3, DU145; bugspytkirtel, BxPC-3, PANC-1, AsPC1, bryst, MCF-7, Hs578T, MDA-MB-231) blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC) og holdt under de anbefalede betingelser. De fluorogene substrater Suc-LLVY-AMC og Ac-PAL-AMC blev custom-syntetiseret efter standard peptidsyntese strategi. Proteasominhibitorer UK-101 og epoxomicin blev syntetiseret og oprenset som tidligere beskrevet [21], [22]. Renset 20 S konstituerende proteasom og immunoproteasome blev købt fra Boston Biochem.

immunhistokemisk analyse

Tissue mikroarrays indeholdende de-identificerede, arkivering tilfælde af human kolon og bugspytkirtelkræft vævsprøver blev opnået fra US Biomax. Brugen af ​​de-identificerede væv array-prøver fra en kommerciel kilde til den aktuelle undersøgelse blev anset for at være undtaget fra det menneskelige subjekt forordningen af ​​Institutional Review Board. En streptavidin-biotin-immunperoxidase-assay blev udført efter antigenet hentning procedure (citratbuffer, pH 6) ved anvendelse af et monoklonalt antistof mod β1i (1:100 fortynding, Enzo Life Sciences) ifølge den tidligere rapporterede protokol [23]. Immunreaktion blev visualiseret ved anvendelse af 3,3′-diaminobenzidin (DAB), og kerner blev modfarvet med hematoxylin. Specificiteten af ​​immunoreaktive signaler blev verificeret ved at udelade enten det primære eller sekundære antistof. De immunofarvede væv microarray sektioner blev analyseret af en erfaren patolog (Dr. Eun Y. Lee). Intensiteten af ​​immunfarvning blev tildelt på en skala fra 0 til 2 eller 3.

Bestemmelse af

PSMB9

polymorf status i codon 60

PSMB9

genotyper ved codon 60 blev indledningsvist bestemt ved anvendelse af standard PCR metoder og DNA enzymatiske fordøjelser som tidligere rapporteret [24]. Den amplicon dækker hele åbne læseramme blev efterfølgende klonet og analyseret ved direkte sekventering til at kontrollere, at cellelinier ikke indeholde yderligere genetiske variationer i PSMB9 genet.

Immunoblotting Analyse

Et tilsvarende beløb af væv eller celleekstrakter blev løst i polyacrylamidgeler og overført til PVDF-membraner. Membraner blev blokeret i 5% skummetmælk og undersøgt med anti-β1i (1:1000, Abcam) og anti-β-actin (1:1000, Novus) antistoffer. Efter vask blev blottene inkuberet med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer. blev påvist bundne antistoffer ved anvendelse af et forøget kemiluminescens-substrat (Pierce Biotechnology). For at sammenligne de relative ekspressionsniveauer af β1i mellem flere cellelinjer, blev serielt fortyndede H23 celleekstrakter anvendes som kalibreringsstandarder og båndintensiteter blev densitometrisk kvantificeret ved hjælp af mængden One software (Bio-Rad).

Proteasome aktivitetsassays

den katalytiske aktivitet af β1i blev bestemt ved at overvåge hydrolysehastigheden af ​​fluorescerende 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) fra Ac-PAL-AMC [20]. Kort fortalt blev oprensede proteasomalaktivitet præparater eller celleekstrakter indeholdende tilsvarende samlede proteinmængde (10 ug) blev tilsat til plader med 96 brønde og justeret til et endeligt volumen på 50 pi ved anvendelse assaybuffer (20 mM Tris /Cl, 0,5 mM EDTA, pH 8,0). Reaktionen blev initieret ved tilsætning af Ac-PAL-AMC (100 uM) og fluorescensen af ​​frigivet AMC blev overvåget i 90 min under anvendelse af en SpectraMax M5-pladelæser (Molecular Devices, excitation 360 nm og emission 460 nm). For at verificere, at substrathydrolyse medieres af β1i, yderligere sæt af celleekstrakter eller oprensede proteasomalaktivitet præparater blev forbehandlet med proteasominhibitorer UK101 eller epoxomicin i 1 time, hvorefter fluorescerende signaler blev overvåget. I separate eksperimenter blev hydrolysen af ​​Suc-LLVY-AMC (100 uM) overvåges for at vurdere den samlede CT-L proteolytisk aktivitet.

Statistisk analyse

Værdier fra data blev udtrykt som betyder med standardafvigelser. En sammenligning mellem grupperne blev udført ved hjælp af Students

t

-test og p 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Hyppig ekspression af β1i i Colon og kræft i bugspytkirtlen væv.

Ved vurderingen af ​​ekspressionen af ​​β1i i tyktarmskræft, vi først udnyttet fire par tyktarmskræft og ikke-maligne tilstødende colon væv fra matchende donorer. Vores immunoblotting analyser indikerede, β1i niveauer blev stærkt forhøjet i alle fire kliniske tyktarmskræft væv sammenlignet med de parrede ikke-maligne colonvæv (figur 1A). For yderligere at vurdere hyppigheden af ​​β1i udtryk i tyktarmskræft, vi udførte immunhistokemiske analyser på en tumor array med 153 evaluerbare tyktarmskræft eksemplarer af alle kliniske faser. Intensiteten af ​​β1i farvning blev evalueret på en skala fra 0 til 3, og vores resultater viste, at hovedparten (ca. 70%, n = 107 ud af 153 totale enheder) for tyktarmskræft væv var positive (farvningsintensiteten ≥1) for β1i farvning (figur 1B). Tilsvarende analyser blev udført ved hjælp af en tumor array med 43 evaluerbare bugspytkirtelkræft eksemplarer af alle kliniske faser. På grund af den begrænsede stikprøvestørrelse blev intensiteten af ​​β1i farvning vurderet på en skala fra 0 til 2, og vores resultater viste, at ca. 53% (n = 23 ud af 43 i alt prøver) af kræft i bugspytkirtlen væv havde positive (farvningen intensitet ≥ 1) β1i farvning (figur 1C). For begge væv arrays, vi vurderet, om der er nogen sammenhæng mellem β1i udtryk og tilgængelige clinicopathologic faktorer (fx køn og tumor kvalitet). Men resultaterne ikke afsløret tydelige associationer.

(a) Immunoblotting analyse for β1i hjælp proteinlysater fremstillet af ikke-malign (N) og kræft (T) colon væv fra de samme donorer (n = 4 par) . β-actin blev anvendt som en loading kontrol. De båndintensiteter for β1i og β-actin blev densitometrisk analyseret og anvendt til at opnå den relative β1i ekspression normaliseret til p-actin niveauer. (B) Immunohistokemisk farvning for β1i bruger tumor array med 153 evaluerbare tumor kolon vævsprøver. Intensiteten af ​​β1i positiv farvning blev vurderet på en skala fra 0 til 3. Ca. 70% (46 prøver havde intensiteten af ​​klasse 1, 38 med grad 2 og 8 med grad 3, ud af 153 total tumor prøver) af kolorektale væv har positive (farvningen intensitet ≥1) β1i farvning. (C) Immunohistokemisk farvning for β1i bruger tumor array med 43 evaluerbare tumor pancreas vævsprøver. Intensiteten af ​​β1i positiv farvning blev vurderet på en skala fra 0 til 2. Ca. 53% (9 prøver med intensitet klasse 1, og 14 med grad 2, ud af 43 total tumor prøver) af kræft i bugspytkirtlen væv havde ≥1 β1i farvningsintensitet .

katalytiske aktivitet af β1i i et panel af menneskelige kræftceller bærer forskellige codon 60 polymorfe varianter

Tidligere Blackburn et al. [20] rapporterede, at Ac-PAL-AMC (figur 2A) kan anvendes som en selektiv probe til måling af katalytisk aktivitet af β1i. Forud for brugen af ​​Ac-PAL-AMC i vores undersøgelse, vi yderligere bekræftet, at hydrolysen af ​​Ac-PAL-AMC selektivt blev medieret af β1i hjælp oprensede præparater af immunoproteasome og konstitutive proteasom. Faktisk blev Ac-PAL-AMC let hydrolyseres af den immunoproteasome, men ikke af den konstitutive proteasomet (figur 2B). Forbehandling med UK101, en β1i-selektiv proteasominhibitor [21], inhiberede fuldstændigt Ac-PAL-AMC hydrolyse, yderligere validering Ac-PAL-AMC som β1i-selecitve probe (figur 2B). Tilsvarende blev ca. 90% af hydrolyse af Ac-PAL-AMC hæmmet i Panc-1 celleekstrakter af UK-101 forbehandling (Figur 2C). I modsætning hertil blev hydrolysen af ​​Suc-LLVY-AMC kun delvis blokeret af UK101 forbehandling i Panc-1 ekstrakter, hvilket antyder, at Suc-LLVY-AMC hydrolyseres af andre end β1i proteasom-underenheder (dvs. β5 eller β5i) (figur 2C).

(a) Kemisk struktur af Ac-PAL-AMC. (B) Ac-PAL-AMC hydrolyse over tid ved renset konstitutive proteasomet (cross), renset immunoproteasome (lukket cirkel), eller renset immunoproteasome forbehandlet med UK101 (åben firkant). En lineær stigning blev set på kun immunoproteasome-holdige brønde. (C) Satsen for hydrolyse af Ac-PAL-AMC eller Suc-LLVY-AMC i tilstedeværelse af Panc-1 celle ekstrakt (10 ug). Hydrolyse af Ac-PAL-AMC blev næsten fuldstændig inhiberet af UK101 forbehandling (10 uM). Hydrolyse af Suc-LLVY-AMC blev delvist hæmmet af UK-101 forbehandling. Epoxomicin (EPX, 10 uM), en bredt virkende proteasominhibitor, blev anvendt som en positiv kontrol.

Efter validering af Ac-PAL-AMC som β1i-selektiv probe, vi derefter vurderet den β1i aktivitet i et panel af menneskelige kræftceller. Disse cellelinjer blev screenet for deres

PSMB9

genotyper ved codon 60 (n = 6 for dem, der udfører HH eller HR-genotype, n = 11 for dem, der udfører RR genotype) og verificerede ikke at have nogen yderligere variationer i

PSMB9

gen ved direkte sekventering (tabel S1). Vores resultater viste, at de katalytiske aktiviteter af β1i vurderes af hydrolysehastigheden af ​​Ac-PAL-AMC væsentlige varierer blandt disse cellelinier, men disse forskelle ikke synes at være forbundet med kodon 60 polymorfe status (figur 3).

(a) Den katalytiske aktivitet af β1i målt ved hastigheden af ​​hydrolyse af Ac-PAL-AMC i menneskelige kræftceller med H /H eller R /H genotype (tomme søjler) og /R genotype R (fyldte søjler). Variabel aktivitet blev observeret blandt cellelinjer. (B) Sats for Ac-PAL-AMC hydrolyse i cellelinjer med H /H eller R /H genotype (åbne cirkler) eller /R genotype R (lukkede firkanter). Sats for hydrolyse viste ingen statistisk signifikant forskel mellem H + og H-cellelinjer.

β1i Expression i menneskelige kræftceller bærer forskellige codon 60 polymorfe varianter

Som det næste skridt undersøgte vi, om de β1i ekspressionsniveauer påvirkes af codon 60 polymorfe status i de testede cancercellelinier. For at kvantificere β1i protein niveauer, som viser betydelig variation på tværs af forskellige cellelinjer, brugte vi seriefortyndet H23 celleekstrakter som kalibreringsstandarder (Figur 4). En sammenligning af cellelinier med H-allel til dem, der mangler den H-allelen viste ingen statistisk signifikante forskelle i β1i ekspression (figur 5A). I stedet fandt vi en meget signifikant korrelation mellem den katalytiske aktivitet β1i og dets ekspression niveau (figur 5B, r

2 = 0,86, p 0,0001, er individuelle værdier i tabel S1). Disse resultater antydede, at de forskellige ekspressionsniveauer af β1i sandsynligvis udgør størstedelen af ​​variation hos β1i aktivitet på tværs af forskellige cellelinier.

Et tilsvarende beløb (10 ug) af celleekstrakter blev underkastet immunoblotting med et antistof at β1i sammen med serielt fortyndede H23 celleekstrakter (kalibrering standarder). Densitometriske analyser af båndintensiteter blev udført for at kvantificere de relative ekspressionsniveauer af β1i. Cellelinier ekspressionsniveauer høje niveauer af β1i er vist i (A) og cellelinier med lav ekspression af β1i er vist i (B).

(a) β1i ekspression i cellelinjer med H /H eller R /H (åben cirkel) og R /R genotyper (lukket firkant). β1i ekspression viste ikke statistisk signifikant forskel mellem H + og H- cellelinier. (B) Korrelation af Ac-PAL-AMC hydrolyse med β1i udtryk i alle testede cellelinier. En stærkt signifikant korrelation blev noteret mellem ekspressionsniveauerne af β1i og dets katalytiske aktivitet (R

2 = 0,86, p 0,0001).

Diskussion

I vores aktuelle undersøgelse undersøgte vi virkningen af ​​

PSMB9

codon 60 polymorfier på β1i underenhed af immunoproteasome udtrykt i flere kræftceller ved hjælp af en nylig rapporteret β1i aktivitet sonde, Ac-PAL-AMC. Vores resultater viste, at codon 60 polymorfi har nogen stor indflydelse på ekspressionsniveauerne eller katalytiske aktiviteter β1i i panel af humane testede cancer cellelinjer. Disse resultater er forskellige fra tidligere resultater, der indikerede, at hjernevæv fra alderen individer bærer codon 60 H allel var faldet proteasom aktivitet sammenlignet med væv fra dem, der ikke bærer codon 60 H allel [17]. En mulig årsag til disse åbenbare afvigelser kan være relateret til de forskellige substrater anvendes til at vurdere proteolytisk aktivitet. Det fluorogene substrat Suc-LLVY-AMC brugt af Mishto et al. [17] er almindeligt anvendt til at måle den samlede chymotrypsin-lignende aktivitet af proteasomet. Men da dette substrat kan hydrolyseres af både immunoproteasome (β1i og β5i) og konstitutive proteasomet (β5) [25], de opnåede resultater ved brug Suc-LLVY-AMC kan ikke drille den direkte bidrag fra β1i genetisk polymorfi. Vores nuværende resultater blev opnået ved anvendelse af nylig rapporteret substrat Ac-PAL-AMC som selektivt spaltes af β1i subunit (Figur 2) [20]. Vores resultater er i overensstemmelse med den tidligere rapport, som

PSMB9

codon 60 polymorfi ikke havde nogen indflydelse på nedbrydning profiler af en 28-mer peptid (Kloe 258) og en rekombinant form af IkBα, en vigtig regulator af klassisk NF -κB vej og velkendte proteasom substrat [18]. Selvom vi ikke helt kan udelukke muligheden for, at virkningen af ​​codon 60 polymorfi kan variere efter substrat og sygdom typer, resultaterne fra den igangværende undersøgelse og andre foreslår, at codon 60 polymorfi ikke sandsynligt vil bidrage til inter-individuel variation i β1i katalytiske aktivitetsniveau.

med de bemærkelsesværdige kliniske succeser bortezomib og carfilzomib i behandling af myelomatose og andre blodkræftsygdomme, er proteasomet nu anerkendt som et vigtigt kemoterapeutisk mål. Men uønskede toksiciteter begrænser bred anvendelse af de aktuelt tilgængelige proteasom målretning narkotika. For at overvinde disse begrænsninger har immunoproteasome, en alternativ form for den konstitutive proteasomet, blevet udforsket som et alternativ terapeutisk mål. Denne indsats har givet lovende immunoproteasome målretning forbindelser med anticancer effekt og forbedrede toksicitetsprofiler [7], [23], [26], [27]. Ved at udforske immunoproteasome-målretning metoder til kræftbehandling, er det vigtigt at overveje immunoproteasome udtryk på tværs af forskellige typer kræft. Mens immunoproteasome vides at blive opreguleret i hæmatologiske maligniteter, ekspressionen af ​​immunoproteasome i fast cancer er ikke blevet grundigt undersøgt. I den aktuelle undersøgelse rapporterer vi, at den β1i underenhed ofte udtrykkes i kliniske vævsprøver fra kolon og pancreascancer samt et panel af humane cancercellelinier afledt fra colon, lunge, prostata og bryst væv. Selvom lignende resultater er blevet rapporteret af vores gruppe og andre [21], [23], [28], [29], vores nuværende undersøgelse giver mere robust oplysninger om udtryk for β1i i de fleste kliniske tyktarm og bugspytkirtelkræft væv testet . Det skal bemærkes, at nedregulering af immunoproteasome underenheder også er blevet rapporteret i nogle typer af cancer [30] – [34] og det er muligt, at udtrykket status immunoproteasome kan være afhængig af sygdomstilstande typer og deres patogene mekanismer. På den anden side bør det bemærkes, at vore resultater på frekvenserne af β1i polymorfier for kræft cellelinier afledt fra forskellige organer afspejler ikke nødvendigvis af de af disse kræftformer. Dette er til dels på grund af den lille prøvestørrelse og det eksperimentelle design i vort aktuelle undersøgelse. Især vores eksperimentelle design involverede udelukkelsen af ​​flere cellelinjer huser yderligere polymorfier i generne kodende β1i og /eller andre immunoproteasome underenheder såsom β5i for at minimere potentielle compounding faktorer. Vores resultater tyder på, at codon 60 polymorfier er ikke sandsynligt at være ansvarlig for den observerede variabilitet i β1i ekspression /aktivitet blandt de testede cellelinier. I yderligere validering vores resultater, kan det være vigtigt at ansætte en større stikprøve for kræft cellelinjer eller kliniske prøver, der stammer fra de samme organer, måske sammenligning af prøver med sammenlignelige β1i ekspressionsniveauerne. Derudover er genetiske associationsstudier undersøge den β1i polymorfi i codon 60 i forbindelse med kræft udviklingen og progressionen også berettiget.

Som konklusion vores resultater viser, at β1i subunit af immunoproteasome ofte udtrykkes i colon og pancreas kræft og eventuelt i andre typer af faste cancere. Derudover genetisk polymorfi i codon 60 synes at have nogen væsentlig indvirkning på ekspressionen og katalytiske aktivitet af β1i i cancerceller. Tilsammen kan disse resultater giver nyttig indsigt til udvikling af immunoproteasome målretning anticancer-midler. Derudover disse resultater udelukker codon 60 polymorfe status som potentiel faktor, der bidrager til variabel følsomhed over for immunoproteasome hæmmere målrette β1i.

Støtte oplysninger

tabel S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0073732.s001

(DOCX)