PLoS ONE: Transkriptionel Suppression, DNA-methylering, og histondeacetylering af regulator af G-protein Signaling 10 (RGS10) Gene i ovariecancerceller

Abstrakte

RGS10 regulerer ovariecancer cellevækst og overlevelse, og RGS10 udtryk undertrykkes i celle modeller af kræft i æggestokkene kemoresistens. Imidlertid er de mekanismer, der styrer RGS10 udtryk i kræft i æggestokkene dårligt forstået. Her rapporterer vi RGS10 undertrykkelse i primær ovariecancer og CAOV-3 ovariecancerceller forhold til udødeliggjort æggestokkene overflade epitel (IOSE) celler, og i A2780-AD kemoterapi celler i forhold til forældrenes A2780 celler. RGS10-1 og RGS10-2 transkripter udtrykkes i ovariecancerceller, men kun RGS10-1 undertrykkes i A2780-AD og CAOV-3-celler, og RGS10-1 promotoren er unikt beriget i CpG-dinukleotider. Farmakologisk hæmning af DNA-methyl-transferaser (DNMTs) øget RGS10 udtryk, hvilket tyder på potentiel regulering af DNA methylering. Bisulfit sekventering analyse identificeret en region i RGS10-1 promotor med markant forbedret DNA methylering i kemoterapi A2780-AD-celler i forhold til forældrenes A2780 celler. DNA-methylering i CAOV-3 og IOSE celler svarede til A2780 celler. Mere markante forskelle blev observeret i histonacetylering af RGS10-1 promotoren. Acetyleret histon H3 associeret med RGS10-1 promotor var signifikant lavere i A2780-AD-celler i forhold til forældrenes celler, med en tilsvarende stigning i histon deacetylase (HDAC) enzym forening. Ligeledes acetylerede histon niveauer på RGS10-1 promotor var markant lavere i CAOV-3 celler i forhold til IOSE celler, og HDAC1 binding blev fordoblet i CAOV-3 celler. Endelig viser vi, at farmakologisk hæmning af DNMT eller HDAC-enzymer i kemoterapi A2780-AD-celler øger RGS10 udtryk og øger cisplatin toksicitet. Disse data antyder, at histon deacetylering og DNA-methylering korrelerer med RGS10 undertrykkelse og kemoresistens i ovariecancer. Markører til tab af RGS10 udtryk kan identificere kræftceller med unik respons på terapi

Henvisning:. Ali MW, Cacan E, Liu Y, Pierce JY, Creasman WT, Murph MM, et al. (2013) Transkriptionel Suppression, DNA-methylering, og histondeacetylering af regulator af G-protein Signaling 10 (RGS10) Gene i æggestokkene cancerceller. PLoS ONE 8 (3): e60185. doi: 10,1371 /journal.pone.0060185

Academic Redaktør: James Porter, University of North Dakota, USA

Modtaget: 20. november 2012; Accepteret: 22 Februar 2013; Udgivet: 22 Mar 2013

Copyright: © 2013 Ali et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansiering af dette arbejde blev leveret af tilskud fra National Institutes of Health (NIH) (CA151006 til SBH og MM, CA131200 til Ste), American Cancer Society (til SFG), og Marsha Rivkin center for kræft i æggestokkene Research (til SBH). (Www.nih.gov/, www.cancer.org/, www.marsharivkin.org/) De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræftceller udnytter multiple vækst receptor-medieret og overlevelse signalveje at unddrage normale hvile og celledød svar. Amplifikation af disse veje er en almindelig mekanisme ved cancer progression. Aktivering af G-protein-koblede receptorer, som ligander lysophosphatidsyre (LPA), endothelin, stromal vækstfaktor-1 (SDF1), prostaglandiner, og thrombin bidrager til udviklingen af ​​forskellige cancertyper, og lægemidler, der blokerer disse receptorer, er for tiden forskellige stadier af kliniske undersøgelser som kræftmedicin [1]. Disse GPCR’er initiere vækst og overlevelse signaleringskaskader ved at aktivere cellulære G-proteiner. G-protein-aktivitet afsluttes ved regulator af G-protein-signalering (RGS) proteiner, der hurtigt deaktivere G-proteiner og kontrollerer styrken og varigheden af ​​GPCR-initierede pathways [2]. RGS-proteiner der undertrykker onkogene signaler medieret af GPCR-ligander er klar til at inhibere cancervækst. Faktisk har specifikke RGS proteiner blevet vist at undertrykke receptor-stimuleret vækst og overlevelse signalering i bryst-, prostata- og ovariecancer [3] – [5]

Ovariecancer er den hyppigste dødsårsag fra gynækologiske cancere. og den femte mest almindelige årsag til cancer dødsfald hos kvinder. Mindre end 50% af patienter med ovariecancer overlever fem år efter deres diagnose [6]. Selvom kræft i æggestokkene er karakteriseret ved en høj svarprocent på kemoterapi, dens høje dødelighed skyldes i høj grad udviklingen af ​​resistens over for de første linje kemoterapeutiske stoffer [7]. De fleste af de patienter, som oprindeligt reagerer på kemoterapi vil tilbagefald med kemoterapi sygdom inden for to år [8]. Forståelse af de molekylære og genetiske ændringer, der driver ovariecancer progression og udviklingen af ​​erhvervet kemoresistens kan føre til strategier til at forudsige og forebygge forekomsten af ​​refraktær sygdom.

Vi har vist, at endogene RGS proteiner undertrykke ovarie vækst cancercelle, migration, og MAP-kinase-aktivering som respons på LPA, en væsentlig autokrin vækstfaktor i ovariecancer [3], [9]. På det seneste har vi identificeret RGS10 som en vigtig regulator af celleoverlevelse og kemoresistens. RGS10 udskrift udtryk nedreguleres i flere modeller for erhvervet kemoresistens i kræft i æggestokkene, og RGS10 ekspressionsniveauerne ændre æggestokkene kræftcelle følsomhed over for cisplatin og taxan cytotoksicitet [10]. Disse iagttagelser antyder, at undertrykkelse af RGS10 ekspression kan bidrage til ovariecancer progression og udvikling af kemoresistens ved at amplificere GPCR-medieret vækst og overlevelse signalveje. Men er ikke fastlagt mekanismen for undertrykkelse af RGS10 udtryk i kræft i æggestokkene.

RGS proteinekspression er dynamisk reguleret i neurale og hjerte-kar-systemer [11] og i kræft progression [12], der giver mulighed for komplekse kontrol over GPCR signalveje. Transkriptionel og post-translationelle mekanismer til kontrol af RGS udtryk er veldefinerede [13] – [16], mens epigenetisk styring af RGS udtryk ved kovalente modifikationer DNA eller histoner har været stort set uudforsket. Gene silencing ved DNA-methylering og histondeacetylering er en veletableret mekanisme i progression af mange cancere [17], herunder ovariecancer [18] – [20]. Tilsætningen af ​​methylgrupper til CpG-dinukleotider ved DNA methyl transferase (DNMT) enzymer og fjernelse af acetylgrupper på lysinrester i histonproteiner ved histon deacetylase (HDAC) enzymer koordineret undertrykke transkriptionsaktivitet [21]. DNA methylering og DNMT udtryk stigning i ovariecancer progression [22], og histondeacetylaser (HDAC) er også overudtrykt i kræft i æggestokkene væv [23]. Dette antyder, at epigenetisk regulering af RGS gener også kan bidrage til deres dynamiske udtryk i kræft progression.

I den aktuelle undersøgelse, undersøgte vi epigenetisk regulering af RGS10 udtryk i æggestokkene cancerceller. Vi fokuserer på to modeller af RGS10 undertrykkelse – CAOV-3 ovariecancerceller forhold til godartede ovarieepitelceller og kemoterapi A2780-AD-celler og deres chemosensitive stamcellerne. Vi identificerer betydelige stigninger i DNA methylering i kemoterapi celler og markante fald i histonacetylering og stigninger i HDAC1 forening på RGS10 promotor i både CAOV-3 og A2780-AD-celler. Vores resultater antyder, at epigenetiske histon modifikationer kan bidrage til tab af RGS10 ekspression i ovariecancerceller, og at DNA-methylering kan bidrage til yderligere tab af ekspression under erhvervet kemoresistens.

Eksperimentelle procedurer

Celler og reagenser

CAOV-3 og SKOV-3-celler blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC) og opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (ATCC) og McCoys 5A-medium (Mediatech, Inc.), henholdsvis suppleret med 10% FBS (PAA Laboratories, Inc.). Den chemosensitive A2780 parental cellelinje og dens multiresistente datter counterpart A2780-AD-celler (afledt som beskrevet [24]) blev generøst tilvejebragt af Dr. Bob Brown, Imperial College London. Disse celler blev opretholdt i RPMI 1640-medium (ATCC) suppleret med 10% FBS og 5 mM L-glutamin. Kemoresistent celler blev yderligere opretholdt i 1,5 uM cisplatin. Immortaliserede ovarie overflade epitelceller (IOSE-80, [25]) blev generøst leveret af Dr. Nelly Auersperg (University of British Columbia) og opretholdt i medie 199: MCDB 105 (01:01) suppleret med 15% FBS. Alle celler blev dyrket i 5 mM penicillin-streptomycin ved 37 ° C med 5% carbondioxid.

5-Aza-2′-deoxycytidin og cisplatin blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Antistoffer, der genkender histon H3 og acetylerede histon H3 var fra Millipore (Lake Placid, NY). Antistof, der genkender histon H3 (acetyl K18) var fra Abcam (Cambridge, MA). Antistoffer, der genkender RGS10 og HDAC1 blev opnået fra Santa Cruz (Santa Cruz, CA).

cellulær levedygtighed Assays Salg

1 × 10

4 A2780 eller A2780-AD-celler blev podet i tre eksemplarer plader med 96 brønde og fik lov til at fæstne i 24 timer før behandling med de angivne koncentrationer af cisplatin i 48 timer. Cellelevedygtighed assay blev udført i serumfrit medium indeholdende CellTiter-Blue® reagens (Promega Corporation) som tidligere beskrevet [10].

Kvantitativ realtids-PCR

mRNA blev isoleret under anvendelse af Trizol-reagens ( Invitrogen) og cDNA blev syntetiseret fra 2 ug totalt RNA ved anvendelse af høj kapacitet revers transkriptase cDNA kit (Applied Biosystems /Life Technologies). Kvantitativ real-time polymerasekædereaktion blev udført under anvendelse af Superscript III kit til RT-PCR (Invitrogen) og Power SYBR Green reagens (Applied Biosystems). Reaktioner blev normaliseret under anvendelse af housekeeping-genet GAPDH og beregninger blev udført i overensstemmelse med 2

-ddCT metode. Gange ændring i ekspression blev bestemt tre gange i tre uafhængige forsøg, og eksperimentelle replikater blev testet for signifikante forskelle mellem grupper med parrede t-test. Anvendte primere var baseret på algoritmen-genererede sekvenser fra Primer Bank (https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). RGS10 Fremad: GAC CCA GAA GGC GTG AAA AGA, RGS10 Reverse: GCT GGA CAG AAA GGT CAT GTA GA, RGS10 variant-1 Fremad: CCC GCG GCG ATG TTC AAC C, RGS10-variant-1 Reverse: CTC CAG GGA TGC CGC CCA TT, RGS10-variant-2 Fremad: TGC GTG GAA CTT CTC AGG TGG ACA, RGS10 variant-2 Reverse: CCG CCC ATT TGG CTG TGC TCT, RGS2 Fremad: AAG ATT GGA AGA CCC GTT TGA G, RGS2 Reverse: GCA AGA CCA TAT TTG CTG GCT, RGS5 Fremad: CCC ACT CAT GCC TGG AAA GG, RGS5 Reverse: CTT GGC TGG TTT CTC TGG CT, GAPDH Fremad: GCC AAG GTC ATC CAT GAC AAC T, GAPDH Reverse: GAG GGG CCA TCC ACA GTC TT.

for at bestemme virkningen af ​​5-aza-2′-deoxycytidin eksponering på RGS transkript ekspression, 7 × 10

5 SKOV-3-celler blev udpladet i 100 mm vævskulturplader og fastgøres natten. Den følgende dag blev mediet aspireret og erstattet med 20 pM 5-aza-2′-deoxycytidin i DMSO eller DMSO vehikelkontrol. Efter 3, 5, 7 og 9 dage af lægemiddel inkubation blev medierne aspireret, og 7 ml Trizol-reagens (Invitrogen) blev tilsat. RNA isolering, DNA-syntese, og QRT-PCR blev udført som ovenfor.

Isolering på kræft i æggestokkene celler fra Peritoneale Ascites

Peritoneale ascites fra æggestokkene kræftpatienter på Medical University of South Carolina (MUSC ) blev opnået under MUSC Institutional review Board (IRB) protokol # 18.983, som omfattede en gennemgang af etik undersøgelsen og specifikt godkendt undersøgelsen. Denne protokol indebærer anvendelse af de identificerede humane prøver til undersøgelse af ekspression og modifikation af proteiner involveret i cellesignalering og lægemiddelresistens i primære ovariecancerceller. Fjernelse af peritoneal ascites er en standard for pleje af patienter med ovariecancer og ascites normalt kasseres. Alle prøver modtaget, blev de-identificeret inden levering til laboratorie personale. Patienterne blev informeret om muligheden for at deltage i undersøgelsen og mundtlige samtykke blev opnået ved lægen. Skriftligt samtykke blev anset en risiko til patient fortrolighed af IRB siden underskrive en samtykkeerklæring om tilladelse til at anvende en de-identificerede prøve ville være den eneste referat af patientens identitet og deltagelse, og derfor den eneste risiko for brud i patient fortrolighed. En registrering af prøver modtaget i laboratoriet blev logget kun af indsamlingsdagen. Fjernelse af peritoneal ascites er en standard for pleje af patienter med ovariecancer. Ingen patient identificerende information blev opnået af forskere i laboratoriet. Peritoneale ascites blev centrifugeret ved 1000 rpm i 10 minutter ved stuetemperatur, og cellepellets blev vasket med phosphatbufret saltvand (PBS). Røde blodlegemer blev lyseret i RBC lysis buffer (eBioscience, San Diego, CA) i 5 minutter ved stuetemperatur. Lysepuffer blev fortyndet med PBS, cellerne centrifugeret som ovenfor og resuspenderet i RPMI-medium med 10% FBS. Cellerne blev inkuberet i 1 time ved 37 ° C med 5% CO2 for at tillade fastgørelse af fibroblaster og makrofager. Fastgjorte epiteliale celler blev fjernet og inkuberet separat i komplet RPMI medium indeholdende 10% føtalt bovint serum.

Rgs10 Immunoblots Salg

At evaluere RGS10 ekspression i primære ascites og IOSE celler, cellelysater blev dannet i RIPA puffer (50 mM Tris pH 7,4, 10% glycerol, 150 mM NaCl, 1% Triton X100, 0,5% SDS, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 5 mM Na4P2O7, 40 mM β-glycerophosphat, 50 mM NaF, 2 mM phenylmethylsulfonylfluorid fluorid og aprotinin). Efter sonikering og centrifugering blev lige store mængder af opløseligt protein kørt på en 10-12% SDS PAGE-gel, overført til nitrocellulose, og immunblottet med RGS10 antistof. Til bedømmelse RGS10 ekspression i cellelinjer blev 10

5-celler lyseret i SDS-PAGE-prøvebuffer. Lysaterne blev kogt i fem minutter og analyseret under anvendelse af SDS-PAGE. Membraner blev inkuberet med RGS10 primære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) og HRP-konjugeret kanin sekundære antistoffer (Pierce) og fremkaldes med ECL-reagenser (Pierce). Membraner blev efterfølgende blottet med GAPDH antistoffer (Life Technologies) som en belastning kontrol.

Bisulfite Sequencing

Methprimer hjemmeside [26] (https://www.urogene.org/methprimer/index1 .html) blev anvendt til at analysere CpG indholdet af RGS initiativtagere og at designe primere rettet mod forskellige regioner i RGS10-1 promotor. Fire forskellige primerpar designet, RGS10-BS1, RGS10-BS2, RGS10-BS3 og RGS10-BS4: RGS10-BS1forward: AAG AAA ATG GGG GTT AAT GAT ATT T, RGS10-BS1reverse: TAC CTC TAA CAA AAC CTT CAA ACT C , RGS10-BS1 forstærkning region: -121.303.236–121.303.086. RGS10-BS2forward: TGT TTT TAA AGT TAG AGA AGT GTT T, RGS10-BS2reverse: CAC AAA CTA AAA AAC CTA AAC CTC, RGS10-BS2 forstærkning region: -121.303.076–121.302.726. RGS10-BS3forward: GAG GAG GTA AAG GTT ATA GGT TGG, RGS10-BS3reverse: AAA TAC ACT AAC CCA AAA AAA ACC CC, RGS10-BS3 forstærkning region: -121.302.800–121.302.514. RGS10-BS4forward: GTT TGG TTA GGA GGA GG, RGS10-BS4reverse: CTC CAA TCT AAA AAA TAC CAC, RGS10-BS4 forstærkning region:. -121.302.327–121.301.988

Genomisk DNA blev høstet fra celler og bisulfite- omregnet ved hjælp af EZ DNA Methylering-Direct Kit (Zymo Research Corp). ZymoTaq ™ DNA-polymerase (Zymo Research Corp) blev anvendt til at amplificere forskellige regioner i RGS10 promotor af bisulfit-behandlet genomiske DNA og PCR-produkter blev analyseret med 2,5% DNA-agarose geler og oprenses under anvendelse PureLink Quick Gel Extraction og PCR Purification Combo Kit (Invitrogen ). De oprensede produkter blev ligeret i plasmider ved anvendelse StrataClone PCR Cloning Kit (Agilent Technologies), som derefter blev transformeret til kompetente bakterier. 20 individuelle kolonier blev isoleret fra carbenicillin LB-agarplader og udvidet. Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Sample Assay Technologies) blev anvendt til at oprense plasmider fra hver koloni, som derefter blev sendt til sekventering under anvendelse af T7 og /eller T3-promotor sekventeringsprimere på UGA Genomics Facility. Klon sekvenser blev underkastet skærme for kvalitet og fuldstændig omdannelse, og opstilles med genomisk RGS10 promotor-DNA under anvendelse BiQ Analyzer software [27].

chromatin immunoprecipitation (chip) Assay Salg

Celler blev udpladet ved en densitet på 2,5 x 10

6 i 15 cm-vævskulturplader og tværbundet med 1% formaldehyd i 8 minutter ved stuetemperatur. Tværbindingsreaktionen blev afbrudt ved tilsætning af 0,125 M glycin i fem minutter ved stuetemperatur. Cellekerner blev isoleret og opkoncentreret ved lysering i frisk SDS lysis buffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8,0, dH

2O) plus proteaseinhibitorer i 25 minutter på is, efterfulgt af flash frysning i flydende nitrogen. Kerner blev ultralydsbehandlet ved hjælp af en Bioruptor vandbad sonikator i 30 sek “On”, 30 sek “Off” 3X til at generere et gennemsnit på 500 bp af klippede DNA. DNA klipning blev bekræftet ved at underkaste lysater til 1% agarosegelelektroforese og visualisering af SYBR sikker farvning. Sonikerede lysater blev derefter klaret med laksesperma-/agaroseperler (Upstate) og 5% af det samlede lysat blev lagret som input til normalisering. Halvdelen af ​​det resterende lysat blev immunudfældet med 5 ug angivne antistof natten over ved 4 ° C og den anden halvdel blev immunpræcipiteret med kontrol antistof. Efter yderligere to time immunpræcipitering med 60 pi laksesperma-overtrukne agaroseperler blev alle prøver vasket med hver af følgende puffere: lavsaltbuffer (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, dH2O), puffer med højt saltindhold (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl, dH2O), LiCI (0,25 M LiCI, 1% NP40, 1% DOC, 1 mM EDTA, 10 mM Tris pH 8,0, dH2O), og 1xTE. DNA blev elueret med SDS elueringspuffer (1% SDS, 0,1 M NaHCO3, dH2O). Efter eluering blev tværbindinger vendes natten over med 5 M NaCl ved 65 ° C og immunpræcipiteret DNA blev isoleret ved anvendelse phenol: chloroform: isopropanol-blanding (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Isolerede DNA blev kvantificeret ved Real time PCR på en ABI prisme 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA) under anvendelse af følgende primere og probe til RGS10: fremad, 5′-GGA ACC GCG AGT CCT CAC-3 ‘, reverse, 5’ -CCC GGA GCT CTA GGT CCC-3 ‘og probe, 5′-TGG CTA GGA GGA GGG CGG CG-3′; og for GAPDH: sende, 5’-AAT GAA TGG GCA GCC GTT A-3 ‘, reverse, 5′-TAG CCT CGC TCC ACC TGA CT-3′ og probe, 5’-CCT GCC GGT GAC TAA CCC TGC GCT CCT -3 ‘. Værdier genereret fra Real time PCR reaktioner blev beregnet ud fra standardkurver genereret, blev kørt i tredobbelte reaktioner, og blev analyseret ved hjælp af SDS 2.0 programmet.

Resultater

undertrykkelse af Rgs10 Expression I kræft i æggestokkene Celler

Vores tidligere data viste nedregulering af RGS10 udskrifter i æggestokkene kræft cellelinjer med erhvervet kemoresistens [10]. For at bestemme om RGS10 også nedreguleres i primære ovariecancerceller, vi immunblottet lysater fra den godartede, udødeliggjort IOSE celle og fra seks primære epiteliale ovariecancer celleprøver isoleret fra patientens ascites (figur 1A). RGS10 proteinekspression var markant lavere i celler fra hver patient, hvilket antyder, at RGS10 ekspression undertrykkes i klinisk ovariecancer. Da patientprøver er heterogene og ikke-vedvarende, deres anvendelse i at definere mekanismer for undertrykkelse er begrænset. At etablere en vedvarende, homogen celle model af tabet af RGS10 udtryk i kræft i æggestokkene, vi sammenlignet RGS10 udtryk i IOSE celler og serøse epitelial kræft i æggestokkene cellelinje CAOV-3 (figur 1B, C). RGS10 udskrift og protein var signifikant lavere i CAOV-3 celler sammenlignet mister kontrollen celler.

A. Ovariecancerceller blev isoleret fra patientens maligne ascites og RGS10 ekspressionsniveauer blev sammenlignet med IOSE celler via western blotting. B.-C. RGS10 transkript (B) og protein (C) ekspressionsniveauer blev sammenlignet i CAOV-3 ovarian cancer cellelinjer og IOSE godartede ovarieepitelceller under anvendelse QRT-PCR og western blotting. D. Cisplatin dosisresponskurver blev bestemt ved anvendelse CellTiter-Blå levedygtighed assays A2780 og A2780-AD-celler. E.-F. RGS10 transkript (E) og protein (F) niveauer blev sammenlignet i kemoresistent A2780-AD-celler i forhold til deres parentale chemosensitive cellelinie A2780. **: P 0,01, ***: p. 0,0001

Vores tidligere observation, at RGS10 undertrykkes i kemoterapi celler blev lavet i offentliggjorte udskrift udtryk datasæt fra chemosensitive og kemoterapi æggestokkene kræftcelle par [ ,,,0],10]. For den aktuelle undersøgelse, vi opnåede A2780 ovariecancerceller og deres multiresistent derivat A2780-AD. A2780-AD-celler blev afledt fra parentale A2780 celler via kronisk eksponering for lave doser cytotoksisk lægemiddel, og således udgør en model for erhvervet kemoresistens [28], [29]. Vi bekræftede tab af følsomhed over for cisplatin-induceret cytotoksicitet i A2780-AD-celler, og viste, at RGS10 transkript og proteinekspression reduceres i A2780-AD-celler sammenlignet med parentale A2780 celler (figur 1 D-F). Tilsammen er RGS10 transkript og proteinekspression reduceret i primære ovariecancerceller og CAOV-3 cancercellelinje forhold til immortaliserede ovarieepitelceller, og i A2780 celler i forhold til parentale celler. Vi fokuserede følgende undersøgelser på disse to sammenligninger.

Rgs10 Initiativtagere

Den menneskelige RGS10 gen findes på den negative streng af kromosom 10 og indeholder to transkriptionelle start- sites, der giver anledning til to forskellige udskrifter og genprodukter (figur 2A, B). Varianterne har unikke første exoner, og deler fire fælles exons. Jo længere transskript RGS10-1 giver anledning til en 21 kDa-protein RGS10a indeholdende 181 aminosyrer. Den kortere transkript variant RGS10-2 giver anledning til en 19,5 kDa protein RGS10b består af 167 aminosyrer. Kun en enkelt RGS10 immunoreaktivt bånd er påviselig i ovarieceller, og er i overensstemmelse med den forudsagte molekylvægt på RGS10a (figur 1). For at bestemme om begge transkripter er påviselige og ligeledes undertrykkes i ovariecancer, udførte vi QRT-PCR under anvendelse af variant-specifikke primere. Både lange og korte udskrifter blev påvist i alle cellelinier ved QRT-PCR, men RGS10-2 blev udtrykt ved meget lavere niveauer end RGS10-1. RGS10-1 transkript ekspression i CAOV-3 ovariecancerceller er ca. 20% af ekspressionsniveauet set i IOSE celler, der kan sammenlignes med den fold-reduktion observeret for total RGS10 transkript. Men den kortere afskrift, RGS10-2, er ikke signifikant forskellig mellem de to cellelinjer (figur 2C). Endvidere blev RGS10-1 udskrift udtryk nedreguleret i kemoterapi A2780-AD derivat cellelinje, mens RGS10-2 niveauer blev forøget (figur 2D). Disse resultater antyder, at undertrykkelse af RGS10 transkript i CAOV-3 og A2780-AD ovariecancerceller er unik for RGS10-1, og foreslår, at mekanismen kan målrettes til den unikke promoter region.

A. Den RGS10 genet (geneID: 6001) er placeret på den negative streng af kromosom 10 (NCBI tiltrædelse: NC_000010.10) ved position -121.302.222–121.259.339. To transskription varianter RGS10-1 (tiltrædelse: NM_001005339) og RGS10-2 (tiltrædelse: NM_002925) er blevet rapporteret til RGS10 baseret på alternative startsteder, der resulterer i distinkte første exoner. B. Den resulterende proteinisoformer RGS10a (tiltrædelse: NP_001005339) og RGS10b (tiltrædelse: NP_002916) varierer fra kun de første 18 eller tre aminosyrer. Den konserverede RGS domæne er understreget. C.-D. Udtrykket af den samlede RGS10 udskrift (RGStot), blev RGS10-1, og RGS10-2 bestemt i IOSE og CAOV-3 celler (C) og i forældrenes A2780 celler og kemoterapi A2780-AD-celler (D). **: P 0,01, ***: p. 0,0001

Dna methylering af Rgs10 Initiativtagere In ovariecancerceller

Initiativtagere indeholder G-C rig “CpG øer” typisk har lave niveauer af methylering i normale væv, men bliver hypermethyleret under cancer progression [30], [31], hvilket antyder, at gener med CpG-øer i deres promotorer er potentielle mål for transkriptionel inaktivering af promotor-DNA-methylering i cancerceller. Analyse af et område 1 kilobase opstrøms for de transkriptionelle startsteder og 0,5 kilobase nedstrøms for start- steder i RGS10-1 og RGS10-2 transkripter afslører en slående forskel i CG-indhold og antallet af CpG-dinukleotider mellem de to RGS10 promotorregioner ( Figur 3A). Promotorregionen RGS10-1 indeholder 60-80% CG-indhold og omfatter ca. 120 CpG-dinukleotider, mens RGS10-2 promotoren indeholder mindre end 30. Til sammenligning analysen af ​​RGS2 promotoren har CpG-indhold svarende til RGS10-1, mens promotoren for RGS5 indeholder få CpG-dinukleotider.

A. De promotorområder af RGS10-1, RGS10-2, RGS2, og RGS5 blev analyseret for CpG indhold ved hjælp af hjemmesiden Methprimer. For hver promotor, en region af genomisk DNA 1000 basepar 5 ‘for transkriptionelle startsted og 500 basepar 3’ for startstedet blev bedømt for procent GC-indhold og individuelle CpG-dinukleotider. Nukleotidposition er angivet langs x-aksen og GC-indholdet tegnes på y-aksen; CpG øer er angivet med skravering. Hver CpG-dinukleotidet er angivet med en hash varemærke under nukleotidnummereringen, og det transkriptionelle startsted er indikeret med en pil. Forstærkning regioner for fire bisulfit sekventering primerpar er angivet med vandrette bjælker (BS10-1, BS10-2, BS10-3, BS10-4). B. SKOV-3-celler blev behandlet med vehikel eller DNMT inhibitor 5-aza i ni dage, og transkriptet niveauer af de angivne RGS og GAPDH kontroller blev målt ved 3, 5, 7, og 9 dages behandling. Den RGS udskrift blev normaliseret til GAPDH, og tegnes i forhold til udtryk i bærerbehandlede kontrol ved hvert tidspunkt.

Den høje koncentration af CpG-dinukleotider i RGS10-1 promotor antyder, at RGS10 genet er et potentielt mål for regulering af DNMT enzymer og kan undertrykkes i æggestokkræft progression ved forbedret DNA methylering. For at teste denne forudsigelse, vi bestemt en hæmmende effekt på DNA methylering på RGS10 udtryk. Den DNMT inhibitor 5-aza-2′-deoxycytidin (5-Aza) blokke Tilsætningen af ​​methylgrupper til CpG-dinukleotider i nyligt syntetiseret DNA fra prolifererende celler [32]. Således er virkningerne af 5-aza om DNA-methylering og genekspression er tydelige efter multiple runder af celledeling. Cellerne blev behandlet med køretøj eller 5-Aza for i alt ni dage, og effekten på afskriften niveauer af RGS10-1, RGS2 og RGS5 blev bestemt hver to dage. I overensstemmelse med CpG ø forudsigelser, er RGS5 udtryk ikke ændre sig med 5-Aza behandling, mens RGS10-1 og RGS2 transkriptniveauer er cirka 8 gange højere i 5-Aza behandlede celler i forhold til vehikelbehandlede celler (figur 3B). Dette resultat tyder på, at DNMT enzymer sandsynligvis bidrager til undertrykkelse af RGS10-1 transkriptniveauer.

Bisulfite sekventering af Rgs10-1 Initiativtagere

Vi yderligere forudsagt, at hyppigheden af ​​methylering i RGS10-1 initiativtagere ville være højere i ovariecancerceller med lavere RGS10-1 ekspressionsniveauer. Methylerede og un-methylerede cytosinrester kan skelnes ved behandling med bisulfit, som omdanner ikke-methyleret, men ikke methyleret, cytosinbaser til uracil. Vi uropført bisulfit sekventering for at sammenligne hyppigheden af ​​DNA-methylering på RGS10-1 initiativtagere mellem forældrenes A2780 og A2780-AD kemoterapi celler. Behandlet med bisulfit genomisk DNA blev amplificeret ved anvendelse af fire overlappende primerpar udformet til fuldstændigt at dække et område fra 1000 basepar opstrøms til 200 basepar nedstrøms for det RGS10-1 transskriptionsstartstedet. Isolerede kloner af bisulfit behandlede genomiske DNA blev sekventeret og opstilles med genomisk DNA under anvendelse BiQ Analyzer software til at bestemme status for methylering af hvert CpG-sted i RGS10-1 promotoren i mindst 10 kloner. De opnåede med primerparret BS10-2 Resultaterne er vist i figur 4, og de opnåede resultater under anvendelse BS10-1, BS10-3, og BS10-4 er vist i figur S1.

RGS10 promotor genomisk DNA blev justeret med individuelle sekvenser af klonede PCR-produkter fra primerparret BS10-2 amplifikation af bisulfit behandlede genomisk DNA fra de angivne cellelinjer. Sekvenser blev udsat for kvalitetskontrol analyse og justeret ved hjælp BiQ Analyzer software. I denne konventionelle ‘slikkepind’ repræsentation er hver CpG sted i regionen (-121.303.076 → -121.302.726) angivet med en cirkel; udfyldte cirkler er methyleret, ikke-udfyldte cirkler er umethyleret. Lollipop repræsentationer af status methylering af hvert CpG websted i RGS10-1 promotorområder forstærkes af BS10-1, BS10-3, og BS10-4 primer sæt er tilgængelige i Støtte Information.

Brug af bisulfit sekventering data, vi bestemt hyppigheden af ​​methylering af CpG websteder på tværs af RGS10-1 promotor i A2780 og A2780-AD-celler (figur 5, tabel S1). Hyppigheden af ​​methylering på CpG websteder på tværs af RGS10-1 promotor var lav; størstedelen af ​​CpG sites var helt methyleret eller blev methyleret i 10-20% af klonerne. En undtagelse var dinukleotidet i position -121.030.162, som var stærkt methyleret i begge cellelinier. Over hele promotor, satsen for methylering var lidt højere i A2780-AD-celler end i forældrenes A2780 celler (figur 5A, indsat). Denne forskel var mere udtalt i flere tilstødende CpG steder i regionen -121.303.155 → -121.303.007 (angivet med stiplet vandret stang, figur 5A). Den samlede sats for methylering tværs af denne region blev fordoblet i de kemoterapi celler i forhold til forældrenes celler (figur 5A, indsat). Disse data antyder, at lokal forstærket DNA-methylering i en region ca. 800 basepar opstrøms for det transkriptionelle startsted korrelerer med tab af RGS10 ekspression i erhvervet kemoresistens. Vi næste udført den samme analyse på RGS10-1 initiativtagere i IOSE og CAOV-3 celler. Methylering satser på tværs af hele RGS10-1 promotoren og i regionen identificeret ovenfor var ens i IOSE og CAOV-3-celler (figur 5B).