PLoS ONE: Evodiamine inducerer G2 /M Arrest og apoptose via Mitochondrial og endoplasmatisk reticulum Pathways i H446 og H1688 human småcellet Cancer Cells

abstrakt

Målet med denne undersøgelse var at evaluere evnen hos EVO at falde cellelevedygtighed og fremme cellecyklusstop og apoptose i småcellet lungecancer (SCLC) celler. Lungekræft har den højeste forekomst og dødelighed blandt alle kræftformer. Kemoterapi er den primære behandling for SCLC; imidlertid lægemidler, der for tiden anvendes til SCLC er mindre effektive end dem, der anvendes til ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Derfor er det nødvendigt at udvikle nye lægemidler til behandling af SCLC. I denne undersøgelse blev virkningerne af Evodiamine (EVO) på cellevækst, cellecyklusstop og apoptose undersøgt i de humane SCLC cellelinjer NCI-H446 og NCI-H1688. Resultaterne repræsenterer den første rapport, at EVO væsentligt kan hæmme levedygtighed både H446 og H1688 celler i dosis- og tidsafhængige manerer. EVO induceret standsning af cellecyklus ved G2 /M-fasen, induceret apoptose ved opregulering af ekspressionen af ​​caspase-12 og cytochrom C-protein, og inducerede ekspression af Bax mRNA og ved nedregulering af ekspressionen af ​​Bcl-2 mRNA i begge H446 og H1688-celler. Der var imidlertid ingen effekt på protein ekspression af caspase-8. Tilsammen kan de inhiberende virkninger af EVO på væksten af ​​H446 og H1688-celler kunne tilskrives G2 /M standsning og efterfølgende apoptose gennem mitochondrier-afhængige og endoplasmatisk reticulum stressinducerede pathways (iboende caspase-afhængige veje), men ikke gennem den dødsreceptor-induceret pathway (extrinsic caspase-afhængige vej). Vores resultater tyder på, at EVO er en lovende ny og potent antitumor lægemiddelkandidat til SCLC. Desuden cellecyklus, mitokondrierne og ER stress veje er rationelle mål for den fremtidige udvikling af et EVO levering system til at behandle SCLC

Henvisning:. Fang C, Zhang J, Qi D, Fan X, Luo J, Liu L, et al. (2014) Evodiamine inducerer G2 /M Arrest og apoptose via mitokondrie og endoplasmatisk reticulum Pathways i H446 og H1688 human småcellet cancerceller. PLoS ONE 9 (12): e115204. doi: 10,1371 /journal.pone.0115204

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, USA

Modtaget: May 7, 2014 Accepteret: November 19, 2014; Udgivet: 15 December, 2014

Copyright: © 2014 Fang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskuddet CSTC2012JJB10027 fra Chongqing Videnskab og Teknologi Udvalg, Chongqing, Folkerepublikken Kina. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den mest almindelige form for kræft, der tegner sig for 12,5% af alle årlige tilfælde nydiagnosticerede kræft på verdensplan. Foruden en høj prævalens, lungecancer har den højeste dødelighed blandt alle cancertyper [1]. Lungekræft kan inddeles i småcellet lungecancer (SCLC) og ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) baseret på histopatologiske træk ved sygdommen. Ca. 10% til 15% af alle lungekræfttilfælde SCLC [2]. Klinisk er SCLC skelnes fra NSCLC af hurtig vækst tumor og udbredt metastaser. I henhold til retningslinjerne for American Cancer Society [2], kemoterapi er den vigtigste behandling for SCLC, og cisplatin, etoposid, carboplatin og irinotecan er de hyppigst anvendte lægemidler. Imidlertid har disse stoffer kun begrænset effekt og forårsage alvorlige bivirkninger [3]. Faktisk de fem-årige overlevelsesrate for SCLC er ret lav (3~8%) sammenlignet med de fem-årige overlevelsesrate for alle former for lungekræft ( 15%) [4]. Nye og effektiv antitumor lægemidler med færre og mindre alvorlige bivirkninger er et presserende behov for at forbedre de kliniske resultater.

Evodiamine (EVO), en stor quinazolinecarboline alkaloid i

Evodia rutaecarpa

, har cytotoksiske virkninger på forskellige typer af humane cancerceller, såsom glioblastomceller [5], gastriske cancerceller [6], brystcancerceller [7], blære cancerceller [8] og lungecancerceller. Konkret EVO udstillet cytotoksiske virkninger på forskellige NSCLC cellelinjer, herunder A549 lungeadenokarcinom celler [9], H1299 celler [10], CL1 celler [11] og H460 stor celle lungecarcinomceller [12], [13]. I modsætning til de cytotoksiske virkninger af EVO på forskellige cancerceller [14], EVO har ringe effekt på normale humane perifere blodceller eller på legemsvægten af ​​tumorbærende mus ved sin effektive dosis [15].

på den anden side er nogle lægemidler, der har cytotoksiske virkninger på NSCLC har også indlysende virkninger på SCLC, såsom wentilactone A, som er cytotoksisk for både H460 og H446 [16], og glucosamin, som er cytotoksisk for A549 og H446 celler [17 ]. Derfor, selv om der har været nogen rapport af effekten af ​​EVO på SCLC til dato, kan EVO være en potentiel ny lægemiddelkandidat til behandling af SCLC.

I denne undersøgelse af virkningerne af EVO på cellelevedygtighed, cellecyklus og apoptose i de humane SCLC cellelinjer NCI-H446 og NCI-H1688 blev undersøgt, og de underliggende mekanismer blev yderligere udforsket. Vores resultater viste, at de inhiberende virkninger af EVO på væksten af ​​H446 og H1688-celler skyldtes G2 /M standsning og efterfølgende apoptose gennem mitokondrier-afhængige og endoplasmatisk reticulum (ER) stressinducerede caspaseaktivering pathways (iboende caspase-afhængige veje ), men ikke ved dødsfaldet receptor-induceret caspaseaktivering pathway (extrinsic caspase-afhængige vej). Hidtil har intet lægemiddel er rapporteret at inducere apoptose i SCLC celler via ER stress pathway. Vores resultater repræsenterer den første rapport, EVO inducerer apoptose i H446 og H1688 SCLC-cellelinier via ER stress-vejen. Desuden har der ikke været nogen tidligere rapport af et lægemiddel, der samtidig inducerer cellecyklusstop og apoptose i SCLC celler via mitochondrier-medieret og ER stress veje. Vi rapporterer for første gang, at EVO inducerede G2 /M anholdelse og apoptose via både mitokondrier-medierede og ER stress veje i H446 og H1688 SCLC-cellelinjer.

Materialer og metoder

2.1 Forbindelse

Evodiamine (EVO) blev købt fra Yuancheng Technology Development Co, Ltd (Wuhan, Kina), renhed 99,13%. EVO blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) til fremstilling af en 40 mM stamopløsning, som blev fortyndet med Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium (Grand Island Biological Company, Grand Island, NY, USA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS ) før hvert eksperiment. Den endelige DMSO-koncentration var ikke mere end 0,025% i denne undersøgelse.

2.2 Cell Culture

Den menneskelige NCI-H446 og NCI-H1688 SCLC-cellelinjer blev købt fra det kinesiske Academy of Medical Sciences (Beijing, Kina) og det kinesiske videnskabsakademi (Shanghai, Kina), hhv. H446 og H1688-celler blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS, 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Gibco Co., Grand Island, NY, USA). Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2.

2.3 cellelevedygtighed Assays Salg

H446 eller H1688-celler blev podet ved en densitet på 2 x 10

3 celler /brønd i 96-brønds mikroplader (Corning Incorporated, NY, USA). Cellerne blev dyrket i 12 timer, og mediet blev erstattet med RPMI 1640-medier indeholdende forskellige koncentrationer af EVO (1,25, 2,5, 5, 10 og 20 uM). Efter afslutningen af ​​den angivne inkubationstid (24 timer, 48 timer og 72 timer) blev mediet udskiftet med frisk medium indeholdende 20 pi 5 mg /ml methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) opløsning (Sigma). Efter inkubering i 4 timer blev MTT-opløsningen fjernet og erstattet med 150 pi DMSO, og mikropladerne blev rystet i 5 min. Absorbansen blev målt ved 490 nm med en Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Cellen levedygtighed blev beregnet som følger: Cellelevedygtighed (%) = OD

testgruppen /OD

kontrolgruppe × 100%, hvor OD

testgruppen var den optiske densitet (OD) i EVO eller DMSO behandlingsgruppe og OD

kontrolgruppe var den optiske densitet af den negative kontrolgruppe. Ubehandlet H446 eller H1688-celler blev anvendt som en negativ kontrolgruppe. IC

50 refererer til koncentrationen af ​​lægemiddel kræves for at dræbe 50% af cellerne [18]. Celle- levedygtighed af forskellige EVO koncentrationer blev analyseret ved OriginPro 7 software (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA), og derefter blev opnået IC

50 værdier. De morfologier af H446 celler inkuberet med EVO til 24 timer blev visualiseret under et omvendt fluorescens mikroskop (ECLIPSE Ti-S, Nikon Instruments Inc., Tokyo, Japan).

2.4 Cell Cycle og apoptose Analyser

H446 eller H1688 celler blev dyrket i 25 cm

2 kolber og behandlet med 10 pM EVO til 24 timer. Cellerne blev høstet ved trypsinzation og centrifugering, og derefter fikseret med 70% ethanol ved 4 ° C i 12 timer. Efter skylning to gange med phosphatbufret opløsning (PBS) blev cellerne resuspenderet i en DNA-farvning opløsning indeholdende 40 ug /ml propidiumiodid (PI) og 0,1 mg /ml RNase ved 25 ° C i mørke i 30 min. Cellerne blev analyseret med et FACSVantage flowcytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) udstyret med CellQuest software [18]. Derefter blev cellecyklusfordeling bestemt og analyseret.

Apoptotisk celle kvantificering blev bestemt under anvendelse af et Annexin V-FITC /PI apoptose detektion kit (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Kina). Induktionen af ​​apoptose blev påvist i H446 eller H1688 celler efter 24 timers behandling med 10 pM EVO ifølge Annexin V-FITC /PI-farvning metode. De H446 celler blev observeret under et Nikon Eclipse Ti inverteret fluorescens mikroskop.

2.5 Reaktive Oxygen Species (ROS), Intracellulær Gratis Calcium (Ca

2+), og mitokondriemembranen Potential (ψ

m )

ROS, Ca

2+ og ψ

m blev bestemt med en FACSVantage flowcytometer anvendelse af følgende tre fluorochromer: 2 ‘, 7’-dichlorofluorescin diacetat (DCF-DA) (Beyotime Institut for Bioteknologi, Haimen, Jiangshu, Kina), Fluo-3 /AM (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Kina), og JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Jiangshu, Kina), henholdsvis [19]. Kort fortalt, H446 eller H1688 celler podet ved en densitet på 1 x 10

6 celler /brønd i plader med 6 brønde (Corning Inkorporering, NY, USA) blev behandlet med 10 pM EVO til 24 timer. Cellerne blev opsamlet, centrifugeret og resuspenderet i en farvningsopløsning indeholdende 10 uM DCF-DA (5 uM Fluo-3 /AM eller 5 ug /mL JC-1) ved 37 ° C i 30 min (45 min eller 20 min) og derefter analyseret ved hjælp af en FACSVantage flowcytometer.

2.6 caspase-3, -8 og -9 aktivitet assay

caspase-3, -8 og -9 aktivitetsniveauer blev målt ved hjælp af aktivitet assay kits (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Jiangsu, Kina). Kort fortalt blev H446 eller H1688 celler høstet efter at være blevet behandlet med 10 pM EVO i 24 timer (48 h eller 72 h). Derefter blev cellerne vasket med koldt PBS, resuspenderes i lysepuffer (100 pi per 2 × 10

6 celler), efterladt på is i 15 minutter og derefter centrifugeret ved 18.000 x

g dele på 4 ° C i 10 min. Analyserne blev udført i 96-brønds mikrotiterplader ved inkubation af en blanding sammensat af 10 pi cellelysatet, 80 pi reaktionsbuffer og 10 pi caspase-3 (-8 eller -9) substrat (Ac-DEVD-pNA) ved 37 ° C i 4 timer. Caspase-3 (-8 eller -9) aktivitet i prøverne blev kvantificeret under anvendelse af et Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) ved en absorbans på 405 nm.

2.7 Western Blot analyser

cytochrom C (Cyt C), caspase-12, -8, -9 og -3, faktor associeret selvmord (Fas) og tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (Trail) blev målt ved proteinniveauet ved Western blotting. H446 celler behandlet med 10 pM EVO til 48 h blev indsamlet og inkuberes i radio immunopræcipitationsassay (RIPA) lysepuffer (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Jiangshu, Kina) i 60 min på is. Cellelysaterne blev centrifugeret ved 13000 g i 15 minutter, og proteinet koncentrationer i lysaterne blev bestemt ved anvendelse af Bio-Rad proteinassay Dye (Bradford) Reagent (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Lige store mængder proteiner blev opløst ved sulfat-polyacrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) og blottet på Immobilon-P overføringsmembraner (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA).

Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri mælk i TBST-buffer (20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI og 0,05% Tween 20). CYT C, caspase-12, -8, -9 og -3, Fas og Trail blev påvist med primære antistoffer (kanin-anti-cyt C, caspase-12, -8, -9 og -3, Fas og Trail) og sekundære antistoffer (gede anti-kanin IgG (H + L), peberrodsperoxidase-konjugeret). Alle antistoffer blev købt fra Beijing Biosyntese Biotechnology Co., LTD., Beijing, Kina og de blev fortyndet 1:200 med 5% skummetmælk TBST (Sigma) før brug. Slutkoncentrationen af ​​antistofferne var 20 ug /ml. Ligeledes blev Cyt C og caspase-12 og -8 målt i H1688-celler behandlet med EVO i 48 timer ved Western blotting.

2.8 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

I alt cellulært RNA fra frisk isolerede H446-celler blev isoleret ved anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). CDNA’et blev syntetiseret under anvendelse af revers transkriptase (Genecopoeia Inc., Rockville, MD, USA). Den specifikke genprodukt blev amplificeret ved PCR med Taq-DNA-polymerase (Fermentas, Waltham, MA, USA). De primer sæt til PCR var som følger:

Bax sense-strengen: 5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCCA-3 ‘;

Bax antisense-streng: 5′-CCAGCCTTGAGCACCAGTTT-3′.

Bcl-2 sense-strengen: 5′-ACTTCGCCGAGATGTCCAGC-3 ‘;

Bcl-2 antisense-strengen: 5′-GCACCTACCCAGCCTCCGTTAT-3′;

2.9 Statistisk analyse

hvert forsøg i denne undersøgelse blev gentaget 3 gange. Alle data er vist som middelværdi ± standardafvigelse (SD) med mindre andet er anført. Analyserne blev udført ved hjælp af statistiske pakke for Social Sciences (version 13.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Students t-test blev anvendt til bestemmelse af den statistiske signifikans af forskellene mellem de eksperimentelle grupper. Statistisk signifikans blev etableret i

P

. 0,05

Resultater

3.1 inhibitoriske virkninger af Evodiamine på cellevækst

De hæmmende virkninger af EVO på humane SCLC H446 og H1688 celle vækster blev evalueret ved hjælp MTT cytotoksicitetsassays. Som vist i fig. 1A, EVO inhiberede human SCLC H446 vækst på en dosis- og tidsafhængig måde. Levedygtigheden på H446-celler behandlet med 10 pM EVO til 24 timer (~66%) faldt med ~16% i forhold til den for celler behandlet med 1,25 uM EVO (~82%). Levedygtigheden på H446-celler behandlet med 10 pM EVO i 72 timer (~35%) faldt med -22% i forhold til den for celler behandlet med 1,25 uM EVO (~57%). IC

50 værdier for EVO-behandlede H446-celler i 24 timer, 48 timer og 72 timer var 20 uM, 18.07 uM og 1,80 uM

cellelevedygtigheden blev målt ved MTT-assayet. . Cellerne blev fotograferet under anvendelse af mikroskop. Hvert eksperiment blev gentaget 3 gange. Data præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (n = 3). *

P

0,05 viste signifikant forskel mellem to grupper. Ubehandlet H446 eller H1688-celler blev anvendt som en negativ kontrolgruppe. 0 pM EVO gruppe indeholdt 0,025% DMSO. DMSO 0,025% blev anvendt til fremstilling 20 uM EVO (den maksimale koncentration af EVO opløsning i undersøgelsen). *

P

0,05 sammenlignet med den tilsvarende EVO behandlede gruppe ved 24 timer.

#

P

. . 0,05 i forhold til tilsvarende EVO behandlede gruppe på 48 h

EVO hæmmede human SCLC H1688 cellevækst i en lidt anden måde (Fig 1B ): (1) EVO inhiberede human SCLC H1688 cellevækst i en dosisafhængig måde inden for 72 timer. Levedygtighed satser H1688-celler behandlet med 10 pM EVO (~49% ved 24 timer, ~33% efter 48 timer og -30% efter 72 timer, henholdsvis) med ~19%, 19% og 21% sammenlignet med den behandlede med 1,25 uM EVO (~68% i 24 timer, ~52% i 48 timer og ~51% i 72 timer, henholdsvis). (2) EVO inhiberede H1688 vækst i en tidsafhængig måde i koncentrationer fra 1,25 uM til 10 uM inden for 48 timer og ved en koncentration på 20 pM i 72 timer. (3) De hæmning satser efter behandling i 48 timer var næsten de samme som dem efter 72 timers behandling med EVO i koncentrationer fra 1,25 uM til 10 uM. (4) IC

50 værdier af EVO i H1688 celler faldt fra 8,14 uM (ved 24 h) til 2,08 uM (ved 48 h) eller 1,37 uM (ved 72 h).

Efter behandling med 10 uM EVO levedygtighed satser H446 eller H1688 celler var ~66% eller ~49% (24 timer), ~56% eller ~33% (48 timer), og 35% eller -30% (72 timer), henholdsvis . På grund af den åbenlyse inhiberende virkning af 10 uM EVO på H446 eller H1688 celler, den mellemliggende dosis EVO (dvs. 10 pM) blev udvalgt til at blive anvendt i alle de følgende prøver, medmindre andet er angivet.

Fig. 1C viste, at morfologier af H446-celler behandlet med forskellige koncentrationer af EVO i 24 timer i det væsentlige er blevet ændret. Når EVO koncentration forøges, blev mere H446 celler rundt og løsrevet fra kulturen plade som deres pseudopodia gradvist trukket tilbage. EVO inhiberede H446 cellevækst i en dosisafhængig måde, bortset fra at H446-celler behandlet med EVO ved 5 uM, 10 uM eller 20 uM i 24 timer havde lignende cytotoksiske virkninger.

Tilsammen den naturlige plantestoffer bestanddel EVO væsentligt hæmmede de levedygtighed af H446 og H1688 SCLC celler i dosis- og tidsafhængige manerer.

3.2 effekter af Evodiamine om Cell Cycle og Apoptose

for at undersøge forstyrrelser af cellecyklussen var ansvarlig for EVO-medierede cellevækstinhiberingen, studerede vi fordelingscellen-cyklus. Som vist i fig. 2A og 2B, EVO selektivt stop for cellecyklus ved G2 /M-fasen (dvs. den før-mitotisk /mitotisk fase). Efter behandling med 10 pM EVO til 24 timer, antallet af EVO-behandlede H446 eller H1688 celler i G2 /M (~63% eller -50%) var ca. 5 gange eller 2,5 gange den for de ubehandlede celler (blank kontrol , ~13% eller 20%). I mellemtiden numrene (-31% eller ~29%) af EVO-behandlede H446 eller H1688 celler i S-fase (syntesen fase, hvor kromosomerne replikeres) var næsten de samme som for de ubehandlede celler (-30% eller ~29%).

Cell cyklus blev opdaget af PI assay. Apoptose blev detekteret ved anvendelse af et Annexin V /PI dobbelt farvning-assay. De H446 celler farvet med Annexin V /PI blev observeret under et omvendt fluorescensmikroskop. Hvert eksperiment blev gentaget 3 gange. Data præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (n = 3). *

P

0,05 sammenlignet med tilsvarende kontrolgruppe. Ubehandlede H446 eller H1688-celler blev anvendt som en negativ kontrolgruppe.

Apoptose også omtalt som cellulær selvmord eller programmeret celledød. For at bestemme om EVO induceret apoptose i SCLC H446 og H1688-celler blev apoptose satser detekteret ved Annexin V-FITC /PI dobbelt farvning. Efter behandling med EVO til 24 timer, som angivet i fig. 2C og 2D, den apoptose på EVO-behandlede H446 (-15%) eller H1688 (~11%) celler var meget højere end for de ubehandlede celler (blank kontrol, -5% eller ca. 4%); som vist i fig. 2E, typiske træk ved apoptose, såsom kromatin kondensering og marginalisering, nuklear segmentering og apoptotisk krop dannelse, blev observeret i EVO-behandlede H446 celler. Kort sagt, EVO signifikant apoptose i både H446 og H1688-celler. Det skal bemærkes, at i vore indledende forsøg, vi vurderede de apoptotiske virkninger af lavere doser af EVO (såsom 1,25 pM og 2,5 pM). De apoptose satser SCLC H446 celler behandlet med 1,25 uM EVO eller 2,5 uM EVO var næsten den samme som for de tilsvarende blindprøvekontrol (data ikke vist).

3.3 Virkninger af Evodiamine på ROS, Ca

2+ og ψ

m niveauer

ROS, Ca

2+ og ψ

m niveauer var kritiske faktorer, der angiver mulige aktivering af apoptose veje. De fleste ROS er frie radikaler, der forårsager DNA, protein og biomembran skader [18]. Intracellulært calcium er en vigtig intracellulær signalering faktor. Ψ

m er en vigtig indikator for celle sundhed, fordi det er relateret til ATP produktionskapacitet af celler. I denne undersøgelse ROS, Ca

2+ og ψ

m blev målt med fluorescerende prober bruger FACSVantage flowcytometer [18]. Efter behandling med EVO til 24 timer, sammenlignet med kontrolgrupperne, (1) at ROS niveauer i EVO-behandlede SCLC H446 celler steget med mere end en fjerdedel (-28%), og i H1688 celler, ROS niveauer mere end fordoblet (~104%) (fig 3A og 3B.); (2) den intracellulære Ca

2 + niveauer i både H446 og H1688-celler steg med halvdelen (~51% eller ~48%) (fig 3C og 3D.); (3) ψ

m niveauer faldt med næsten en tredjedel (~32%) og ved en syvendedel (~14%) i H446 og H1688 celler, henholdsvis (fig. 3E og 3F). Resultaterne antyder, at EVO øgede ROS-niveauer i SCLC celler. Overskydende ROS ikke beskadiges kun DNA, men det beskadigede også mitokondriemembranen og forøget mitochondriemembranpermeabilitet. Mere calcium blev frigivet fra mitokondrier og indtastet cytoplasmaet. Den calciumkoncentration intracellulære øget, og den mitochondriemembranpotential blev delvist depolariseret. EVO induceret apoptose i både SCLC H446 og H1688 celler gennem ROS-medierede mitokondrie vej.

ROS, Ca

2+ og ψ

m blev separat opdaget af DCF-DA, Fluo-3 /AM- og JC-1 assays. Hvert eksperiment blev gentaget 3 gange. Data præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (n = 3). Ubehandlet H446 eller H1688-celler blev anvendt som en negativ kontrolgruppe. *

P

. 0,05 sammenlignet med tilsvarende kontrolgruppe

3.4 Effekter af Evodiamine på Caspase-8, -9 og -3 aktivitetsanalyse

Caspaser er proteolytiske enzymer, der er kritiske formidlere af apoptose. Aktiviteterne af caspase-8, -9 og -3 blev bestemt ved spektrofotometri. Sammenlignet med de tilsvarende kontrolgrupper, signifikante stigninger i aktiviteterne i caspase-8, -9 og -3 blev fundet i H446-celler behandlet med 10 pM EVO til 24 timer, 48 timer og 72 timer, med undtagelse af stigningen i caspase -8 aktivitet i EVO-behandlede celler efter 24 timer, hvilket ikke var statistisk signifikant. De højeste niveauer af caspase-8 (~213%, fig. 4A) blev og caspase-9-aktivitet (~240%, fig. 4B) observeret efter behandling med EVO i 48 timer, mens det højeste niveau af caspase-3-aktivitet ( ~564%) blev observeret ved 24 timer (fig. 4C). Men de højeste caspase-8 og -9 aktiviteter var stadig lavere end den caspase-3-aktivitet (~278%) i EVO-behandlede celler ved 48 timer. Disse resultater antyder, at EVO apoptose gennem caspase-afhængige veje.

Cellelysater blev analyseret ved en kolorimetrisk assay af Ac-DEVD-pNA. Hvert eksperiment blev gentaget 3 gange. Data præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (n = 3). Caspase aktiviteter blev givet som arbitrære enheder (AU) pr milligram protein. Ubehandlede H446 celler blev anvendt som en negativ kontrolgruppe. *

P

0,05 sammenlignet med den tilsvarende kontrolgruppe.

#

P

0,05 sammenlignet med tilsvarende EVO behandlede gruppe på 24 timer.

P

. 0,05 sammenlignet med tilsvarende EVO behandlede gruppe på 48 h

3,5 Virkninger af Evodiamine på Protein Expression af Cyt C, Caspase-12, – 8, -9 og -3, Fas og Trail

Cyt C er en mitokondrie protein involveret i initiering af mitokondrier-medieret apoptose. Caspaser er cystein-asparaginsyre-proteaser, der er essentielle for apoptose. Caspase-12 er lokaliseret til ER og involveret i ER-medieret apoptose. Caspase-8 medierer signaltransduktion nedstrøms for dødsreceptorer (DV) placeret på plasmamembranen og er således involveret i DR-medieret apoptose. Interaktionen af ​​DR med sine naturlige ligander (såsom FasL and Trail) inducerer aktiveringen af ​​caspase-8. Caspase-9 er en asparaginsyre-protease. Caspase-3 er en bøddel caspase ansvarlig for chromatinkondensation og DNA-fragmentering i apoptose. CYT C og caspase-12 og -8 udløse aktivering af caspase 9 (initiator caspase) og caspase-3 (effektor caspase) før de endelig induceret apoptose.

I EVO-behandlede H446 eller H1688 celler, sammenlignet med deres tilsvarende kontrolgrupper (niveauet blev fastsat som 100% i hvert af kontrollerne), (1) proteinet ekspressionsniveauer af Cyt C blev forøget markant med ~220% og ~367% (se fig. 5A og 5B) henholdsvis , (2) den proteinekspression niveauer af caspase-12 blev forøget signifikant med ~248% og ~190% (se fig. 5C og 5D), henholdsvis, og (3) proteinet ekspressionsniveauer af caspase-8 var næsten uændret ( ~94% og ~112%, henholdsvis) (se fig. 5E og 5F). Yderligere undersøgelse af H446-celler behandlet med EVO afslørede, at den markante forhøjelse af niveauet af Cyt C resulterede i øget caspase-9 og -3 ekspression ved ~275% og 204%, henholdsvis (se fig. 5G og 5H). Endvidere FasL and Trail, som er caspase-8 aktivatorer, var ikke uændret (~102% og ~105%, henholdsvis) (se fig. 5I og 5J). Western blot Resultaterne antydede, at EVO øgede Cyt C og caspase-12 niveauer i både H446 og H1688 SCLC celler, således EVO induceret apoptose gennem både mitokondrierelateret og ER-medierede veje. Endvidere den forhøjede proteinekspression af caspase-9 og -3 angivet, at EVO apoptose gennem en caspase-3-afhængige vej. Modsat, EVO havde nogen effekt på protein ekspression af caspase-8 i enten H446 eller H1688 SCLC celler, hvilket antyder, at det ikke inducerer apoptose via en DR-medieret vej.

Cellelysater blev analyseret ved Western-blot . Hvert eksperiment blev gentaget 3 gange. Data præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (n = 3). Ubehandlet H446 eller H1688-celler blev anvendt som en negativ kontrolgruppe. *

P

0,05 sammenlignet med tilsvarende kontrolgruppe. Fas: faktor i forbindelse selvmord; Trail: tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand; CYT C: cytochrom C.

3.6 Virkninger af Evodiamine på mRNA-ekspression af Bax og Bcl-2

BAX er også kendt som Bcl-2-lignende protein 4 eller Bcl- 2-associeret X; Bcl-2 står for B-celle lymfom 2. Bax fremmer apoptose ved antagonisering bcl-2, som er specifikt betragtes som en vigtig anti-apoptotisk protein. Samtidig BAX og Bcl-2 separat kodet af Bax og Bcl-2-gener. Her blev ekspressionsniveauerne af Bax og Bcl-2-gener bestemt ved RT-PCR. Sammenlignet med deres tilsvarende kontrol, (1) mRNA ekspressionsniveauer af Bax i H446 eller H1688 celler behandlet med EVO blev forøget betydeligt med ~215% eller ~135% (ved 24 timer), ~397% eller ~172% (ved 48 h) og ~514% eller ~185% (ved 72 timer), (fig. 6A og 6B). (2) Tværtimod mRNA ekspressionsniveauer af Bcl-2 i EVO-behandlede H446 eller H1688 celler blev signifikant reduceret med -10% eller ~11% (ved 24 timer), -60% eller -28% (ved 48 h), og ~66% eller ~53% (ved 72 timer), (fig. 6C og 6D). Tilsammen EVO øgede forholdet Bax /Bcl-2 på det transskriptionelle niveau, som forventes at stige yderligere forholdet Bax /Bcl-2 på proteinniveauet og i sidste ende fremme apoptose.

Cellelysater blev analyseret ved RT-PCR. Hvert eksperiment blev gentaget 3 gange. Data præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (n = 3). Ubehandlet H446 eller H1688-celler blev anvendt som en negativ kontrolgruppe. *

P

0,05 sammenlignet med kontrolgruppen.

#

P

0,05 sammenlignet med tilsvarende EVO behandlede gruppe på 24 timer.

P

0,05 sammenlignet med tilsvarende EVO behandlede gruppe på 48 h

Diskussion

I denne undersøgelse viser vi for første gang. at EVO hæmmer signifikant levedygtigheden af ​​SCLC celler. IC

50 værdier af EVO i H446 celler faldet fra 20 uM (24 h) til 18,07 uM (48 h) eller 1,80 uM (72 h); og i H1688-celler, IC

50 faldt fra 8,14 pM (24 h) til 2,08 uM (48 h) eller 1,37 uM (72 h). EVO udøvede hæmmende effekt på H446 og H1688 celler i koncentrations- og tidsafhængig manerer. Det er tidligere beskrevet, at IC

50 værdier af EVO i humane NSCLC celler var 12 uM (48 h, H460 celler) [13], 13,2 uM (72 timer, (R) -EVO, H460 celler) [12] , 2,6 uM (72 H, (S) -EVO, H460 celler) [12], og 100 um (72 h, A549-celler) [9]. Kort sagt, EVO udviste antitumoraktivitet i SCLC foruden NSCLC-celler. I de fleste tilfælde, EVO hæmmede væksten af ​​H446 SCLC celler mere effektivt end H460 og A549 NSCLC-celler.

Undersøgelsen af ​​fordelingen cellecyklus viste, at afbrydelse af cellecyklussen var ansvarlig for EVO- medieret cellevækstinhiberingen. Antallet af H446 og H1688-celler i S-fase var næsten uændret efter EVO behandling sammenlignet med kontrollen. Men EVO udløste en anholdelse ved G2 /M-fasen, dvs. EVO-behandlede H446 og H1688 celler akkumuleret i G2 /M-fasen. En anholdelse af celler i G2 /M-fasen som respons på genotoksisk stress (såsom oxidativt stress og DNA-interkalerende midler) kan inducere DNA-skade i både en p53-afhængig (via ROS) [20] og p53-uafhængig måde [21].

Det er tidligere dokumenteret, at EVO induceret apoptose i forskellige humane kræftceller via forskellige veje. For eksempel i NSCLC H1299-celler apoptose blev induceret ved undertrykkelse af den nukleare faktor (NF) -κB aktiveringsvej [10]; og i pancreas SW1990 celler, blev apoptose induceret via regulering af PI3 K /Akt vej [22], i 253J og T24-blære cancerceller, apoptose blev induceret gennem mTOR /S6K1-medieret nedregulering af Mcl-1 [8]. Apoptose induktion af EVO i H446 eller H1688 SCLC celler var præget af Annexin V-FITC /PI dobbelt farvning, og morfologiske ændringer var tydelige i H446 celler. Derudover viser resultaterne af den foreliggende undersøgelse tyder på, at G2 /M-fase-cellecyklusstandsnings standset H446 og H1688 cellevækst og til sidst førte til celledød ved apoptose gennem to iboende caspase-afhængige veje, men ikke gennem den ydre caspase-afhængige vej (Fig . 7):

Apoptose blev induceret gennem mitokondrier-medierede caspaseaktivering vej. Resultaterne viste, at EVO udløste mitokondrisk apoptose ledsaget af ophobning af ROS. I denne undersøgelse ændringen af ​​mitochondriemembranpermeabilitet induceret af ROS-generering førte til aktivering af intracellulær calcium frigivelse, tabet af mitochondriemembranpotential, og den efterfølgende frigivelse af Cyt C. At være en apoptose faktor, Cyt C udløste aktivering af yderligere caspase 9 (initiator caspase) efterfulgt af aktiveringen af ​​caspase-3 (effektor caspase), induktionen af ​​PARP-spaltning og den endelige induktion af apoptose [23].