PLoS ONE: prognostiske værdi Analyse af Mutationsanalyse og klinisk-patologisk Faktorer i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Introduktion

Målretning aktivering onkogene driver mutationer i lungeadenokarcinom har ført til forlænget overlevelse hos patienter huser disse specifikke genetiske ændringer. Den prognostiske værdi af disse mutationer endnu ikke er blevet belyst. Forekomsten af ​​nyligt afsløret ikke-kodende somatisk mutation i promotor-regionen i

TERT

gen også skal valideres i lungekræft. Formålet med denne undersøgelse er at vise forekomsten, sammen med clinicalpathological funktioner og prognostisk værdi af disse faktorer.

Metoder

I en kohorte af patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) (n = 174, herunder 107 lunge adenocarcinom og 67 lunge pladecellekræft),

EGFR

,

KRAS

,

HER2

BRAF

var direkte sekventeret i lunge adeoncarcinoma blev ALK fusioner screenet ved hjælp af FISH (fluorescens

in situ

hybridisering).

TERT

promotor-regionen blev sekventeret i alle de 174 NSCLC prøverne. Sammenslutninger af disse somatiske mutationer og klinisk-patologiske træk, samt prognostiske faktorer blev evalueret.

Resultater

EGFR

,

KRAS

,

HER2

,

BRAF

mutation og

ALK

fusion blev muteret i 25,2%, 6,5%, 1,9%, 0,9% og 3,7% af lunge adenokarcinomer. Nej

TERT

promoter mutation blev valideret ved omvendt-sidet sekventering. Lung adenocarcinom med

EGFR

KRAS

mutationer viste ingen signifikant forskel i sygdomsfri overlevelse (DFS) og total overlevelse (OS). Cox Multi-variate analyse viste, at kun N scenen og

HER2

mutation var uafhængige prædiktorer for dårligere samlet overlevelse (HR = 1,653, 95% CI 1,219-2,241,

P

= 0,001; HR = 12,344, 95% CI 2,615 til 58,275,

P

= 0,002).

konklusioner

Vi har endvidere bekræftet, at

TERT

promoter mutation kan kun eksistere i en meget lille brøkdel af NSCLCs. Disse resultater indikerer, at dividere lungeadenokarcinom i molekylære undertyper ifølge onkogene driver mutationer ikke forudsiger overlevelse forskel af sygdommen

Henvisning:. Li C, Hao L, Li Y, Wang S, Chen H, Zhang L et al. (2014) prognostiske værdi Analyse af Mutationsanalyse og klinisk-patologisk Faktorer i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 9 (9): e107276. doi: 10,1371 /journal.pone.0107276

Redaktør: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: Juni 2, 2014, Accepteret: August 8, 2014; Udgivet: 8 September, 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Den oprindelige datablad af vores eksperimentets resultater kan findes i den understøttende oplysninger

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81302001 til CG Li og 81201649 til BS Sun, http: //www.nsfc.gov.cn), Kina Postdoc Science Foundation (2014M550147 til CG Li, https://res.chinapostdoctor.org.cn/BshWeb/index.shtml), Key Program for Anti-cancer Forskning i Tianjin Municipal Videnskab og Teknologi Kommissionen (12ZCDZSY15400 til CL Wang, https://www.tstc.gov.cn/) og Key Program for Application Foundation, Tianjin Municipal Videnskab og Teknologi Kommissionen (12JCYBJC17800 til CL Wang, https://www.tstc.gov .cn /). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de mest ødelæggende sygdomme og den hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), som udgør ca. 85% af lungekræft tilfælde er yderligere opdelt til histologiske undertyper af adenocarcinom (ADC), pladecellecarcinom (SCC) og storcellet carcinoma. Adenocarcinom er blevet den mest almindelige lungecancer-undertype [2]. Det 5-års overlevelsesraten for NSCLC er fortsat lav som 15-16%, på trods af en forbedring af behandlingen i de seneste årtier [1], [3]. Bedre forståelse af NSCLC tumorigenese og faktorer i forbindelse med er brug prognose.

Afdækning af aktiverende mutationer i tyrosin kinase domæne af

EGFR

har ført til udvikling og udbredt brug af gefetinib og erlotinib, som har vist sig at være effektiv i behandlingen af ​​en del af

EGFR

muterede lunge adenocarcinomer [2], [4]. Ifølge specifikke onkogene driver mutationer, er lunge adenocarcinom opdelt til molekylære undertyper såsom

EGFR

,

KRAS

,

ALK

,

HER2

,

BRAF

og så videre [5], [6]. De fleste af disse driver gener har specifikke målrettede lægemidler i brug eller kliniske forsøg. Sammenlignet med adenocarcinom, viden om genetiske ændringer af lunge pladecellekarcinom er begrænset. Hyppig mutation, forstærkning eller tab af

FGFR1

,

PTEN

,

PIK3CA

,

NFE2L2

,

NRF

er blevet identificeret i omfattende genomisk undersøgelse i lunge pladecellecarcinom [7]. Fordi den stort set udefineret mutations spektrum og lave frekvenser af disse gener, er målrettede behandlinger i lunge pladecellekræft halter bagefter og trange til kliniske forsøg.

For nylig har human cancer genomsekvensering undersøgelser afslørede somatiske mutaitons i kernepromotoren af human telomerase revers transkriptase (

hTERT

)

Gene, som koder den katalytiske subunit af telomerase [8] -. [10]. Enten C228T eller C250T af

hTERT

promotorsekvenser mutationer forhøjet transkriptionsaktivitet

hTERT

gen i luciferase reporter assays [8]. De tumortyper med hyppige

hTERT

promotorsekvenser mutationer inkluderet melanom (71%), gliom (51%), Myxoid liposarkom (79%), urothelial carcinoma i blæren (66%) [8], [9]. Beviser i ovennævnte undersøgelser antydet, at

hTERT

promoter mutationer potentielt fungere som chauffør gen i melanom. Men forekomsten af ​​

hTERT

promoter mutation i lungekræft kliniske prøver er fraværende i disse undersøgelser. Det er nødvendigt at vise forekomsten af ​​

hTERT

promoter mutation i NSCLC prøver som lungekræft aktier driver muterede gener med melanom, såsom

BRAF

NTM

[8], [9], [11].

i denne undersøgelse, vi havde til formål at vise de omfattende molekylære og klinisk-patologiske funktioner i NSCLC, samt den prognostiske værdi af disse egenskaber.

Metoder

patienter og væv

Primære tumor prøver blev indhentet fra 174 patienter, som gennemgik potentiel kurativ pulmonal resektion ved Tianjin Medical University Cancer Hospital fra jan 2004 gennem jan 2008. Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board af Tianjin Medical University Cancer Institute og Hospital. Alle deltagere gav skriftligt informeret samtykke. Patienterne blev inkluderet i denne specifikke undersøgelse baseret på følgende kriterier: de havde en patologisk diagnose af lunge adenocarcinom eller planocellulært karcinom, deres tumor prøve indeholdt mindst 50% tumorceller som bestemt ved undersøgelse patologer, de ikke har modtaget neoadjuverende kemoterapi, og de havde tilstrækkelig væv til molekylær analyse. Klinisk-patologisk funktioner og prognose oplysninger blev indsamlet.

DNA isolation og mutationsanalyse

Genomisk DNA blev isoleret fra formalin-paraffinindlejret (FFPE) prøver i henhold til standard protokoller (TIANquick FFPE DNA Kit, Tiangen Inc, Kina).

EGFR

(exon 18-22),

HER2

(exon 20),

KRAS

(exon 2 til 3),

BRAF

(exon 15 ) og

TERT

promotorregion blev PCR amplificeret under anvendelse af DNA og gælder sekventeret. Multiplex-PCR-analyse blev udført med rTaq-DNA-polymerase (Toyobo, Osaka, Japan). Primere anvendt i disse eksperimenter er anført i tabel S1. ALK fusioner blev screenet ved hjælp af FISH med FFPE dias.

Statistisk analyse

Foreninger mellem mutationer og kliniske og biologiske egenskaber blev analyseret af

χ

2

eller Fishers eksakte test . Overlevelseskurver blev tegnet ved Kaplan-Meier-metoden. Cox proportional hazards regression (fremad likelihood ratio model) blev anvendt til multivariate overlevelse analyser. Alle data blev analyseret ved hjælp af statistiske pakke til Samfundsvidenskab Version 16.0 Software (SPSS Inc., Chicago, IL). De to-sidet signifikansniveau blev sat til

P

. 0,05

Resultater

Patient Karakteristik

Et hundrede og syv lunge ADC og 67 SCC patienter blev indrulleret i denne undersøgelse, herunder 105 mænd og 69 kvinder (gennemsnit 58 år, range, 39-77 år). Der var 109 rygere og 65 ikke-rygere, der tegner sig for 63% og 37%, hhv. Antallet af patienter i etaper I-III var 57, 46 og 69, henholdsvis. To prøver var med udefineret tidspunkt. De detaljerede oplysninger er anført i tabel 1.

EGFR, KRAS, HER2

BRAF

Mutation status og ALK fusioner

Af de 107 lungeadenokarcinom prøver, 25,2% (27/107) af tumorer blev fundet at huse

EGFR

kinasedomæmemutationer. Blandt disse 17 var deletioner i exon 19 og 6 var L858R missense ændringer. Andre ændringer omfattede 1 exon 20 insertion, exon 20 D807N og T790A mutationer, 1 exom 18 R705K mutation. Seks prøver (5,6%) havde en

KRAS

mutation, herunder fem G12V mutationer og en I36M missense mutation. To prøver nærede

HER2

exon 20 mutation, herunder en 776-779 YVMA indsættelse og en S789P mutation. Kun én

BRAF

L588F missense mutation blev identificeret i disse tumorprøver (figur 1). ALK fusioner blev påvist i 4 (3,7%) prøver. Fordi mutationer af

EGFR, KRAS, HER2, BRAF

, samt

ALK

fusioner er blevet godt etableret for at blive eksisteret i lunge adenocarcinom [5], [12] – [14], disse mutation og fusionsgener at “drev ‘lungeadenokarcinom ikke blev screenet i lunge pladecellekræft.

De mutationsrater af

EGFR, KRAS, HER2

BRAF

var 25,2, 5,6, 1,8 og 0,9%, henholdsvis.

5 ‘ikke-kodende region mutationer af

TERT

gen i NSCLC

Hverken C228T heller C250T mutationer var valideret i de 174 NSCLC prøverne efter omvendt sekventering. Disse resultater viste, at

TERT

promoter mutation kan kun eksistere i en meget lille brøkdel af primære NSCLC prøver.

Survival Analysis

Ved univariat analyse, avanceret klinisk iscenesættelse (

P

= 0,018), lymfeknude metastaser (

P

0,001), ≥2 station af metastatisk lymfeknude (

P

0,001) modtog adjuverende kemoterapi (

P

= 0,004) var forbundet sygdomstilbagefald (tabel 2).

EGFR

KRAS

mutation status var ikke forbundet med tilbagefald overlevelse (

P

= 0,600) eller samlet overlevelse i lunge adenocarcinom (

P

= 0,873) (figur 2). Cox multivariat frem trinvis analyse (korrigeret for alder, køn, rygning historie, klinisk fase, histologiske undertyper og mutationsstatus) viste, at kun lymfeknude fase (N etape) og

HER2

mutation var uafhængige prædiktorer for dårligere samlet overlevelse ( HR 1,653, 95% CI 1,219-2,241;

P

= 0,001; HR 12,344, 95% CI 2,615 til 58,275;

P

= 0,002). Detaljeret mutations og overlevelse oplysninger anført i tabel S2.

EGFR

KRAS

mutation status var ikke forbundet med tilbagefald overlevelse (

P

= 0,600) eller samlet overlevelse (

P

= 0,873) i lungeadenokarcinom; c-d. Lymfeknude fase (N etape) var signifikant associeret med tilbagefald overlevelse (

P

= 0,001) eller samlet overlevelse (

P

= 0,001) i NSCLC.

diskussion

NSCLC er en heterogen sygdom, resultat adskiller selv hos patienter med identiske clinicopathologic funktioner. Identifikation af onkogene driver mutationer i lungeadenokarcinom har i høj grad fremmet klinisk brug og udvikling af målrettede lægemidler [5], [6], [15], [16]. Selvom

EGFR

KRAS

mutationer er blevet etableret som prædiktive og prognostiske markører for patienter, der modtager

EGFR

-TKIs [4], [17], [18], resultater på den prognostiske værdi af disse forandringer på genomisk niveau i patienter, der ikke modtager

EGFR

-TKIs blev sjældent rapporteret.

Vi har screenet forekomsten af ​​kendte driver mutationer af

EGFR

,

KRAS

,

HER2, BRAF

ALK

i en kohorte af 107 lunge adenocarcinom prøve med komplet prognostisk information.

EGFR

mutation,

KRAS

mutation og

EGFR-service /

KRAS

vildtype grupper viste ingen signifikant forskel i både tilbagefald overlevelse og samlet overlevelse i den foreliggende undersøgelse. Alle de deltagende patienter i dette studie ikke fik små molekylære lægemidler rettet mod

EGFR

. Vores resultater tyder på, at bestemt driver mutation af

EGFR

eller

KRAS

gen ikke forudsige overlevelse fordel eller ulempe, når disse patienter ikke modtog specifikke mål behandlingsformer. I den multivariate analyse,

HER2

mutationen blev identificeret som uafhængig prædiktor for ugunstig prognose. Fordi kun to prøver nærede

HER2

mutation, yderligere undersøgelse med større antal prøver er nødvendige for at bekræfte dette resultat. Baseret på disse kendsgerninger, konkluderer vi, at at opdele lungeadenokarcinom i molekylære undertyper kun forudsiger terapi svar, men ikke overlevelse fordel hos patienter, som ikke fik disse lægemidler.

Den nye af somatiske mutationer af

hTERT

gen 5 ‘promotor-regionen i melanom har givet en anden lovende kandidat driver gen for lungekræft. Flere undersøgelser har identificeret hyppige

hTERT

5 ‘promotor-mutationer i melanom [8], [10], gliomer, samt fra relativt lave selvstændige fornyelse væv som liposarkomer, hepatocellulære carcinomer, urothelial carcinomer, planocellulært carcinomer i tungen og medulloblastomer [9], [19]. Vi screenede

hTERT

5 ‘promotor-regionen i 174 NSCLC FFPE prøver at udforske mutation sats og potentiel prognostisk værdi. Vi identificerede kun tre C250T mutationer fra de 174 prøver, men ingen af ​​disse blev valideret ved omvendt sekventering, som kunne eventuelt forårsaget af DNA-beskadigelse i processen med formalin fiksering og paraffinindlejring. Disse resultater bekræftede, at

hTERT

5 ‘promotor-mutationer kan kun eksistere i en meget lille brøkdel af NSCLC tilfælde.

Begrænsningen af ​​denne undersøgelse bør drøftes. For at udforske den prognostiske betydning, vi brugte FFPE prøver, som har fuldstændig overlevelse oplysninger. Imidlertid er følsomheden af ​​sekventeringsresultaterne påvirket af den relativt lave kvalitet af FFPE prøver, hvori DNA nedbrydes og kunstigt muteret. Mutationsraten af ​​velkendte driver gener er lavere end tidligere undersøgelser under anvendelse af høj kvalitet lynfrosset prøver [20], [21], og de kunstige mutationer optrådte i

hTERT

5′-promotorområdet. Selvom hinanden følgende prøver med komplette overlevelsesdata er ikke altid tilgængelige, vores undersøgelse forudsat mutationen spektrum og prognostisk sammenslutning af disse genetiske ændringer med tilgængelige prøve og teknikker.

Som konklusion, illustrerede vores arbejde mutationen spektrum af

EGFR

,

KRAS

,

HER2, BRAF

ALK

i lunge adenocarcinom, samt bekræftet, at h

TERT

5 ‘promotor region mutation sjældent forekom i NSCLC prøver. Vi har også bekræftet, at disse driver mutationer mangler prognostisk værdi i lungeadenokarcinom patienter, som ikke modtager EGFR TKI-behandling, og undertyper divideret med disse onkogene driver mutationer ikke forudsige signifikant overlevelse forskel.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Liste over primere, der anvendes til polymerasekædereaktion forstærkning af EGFR, KRAS, HER2 og BRAF gen

doi:. 10,1371 /journal.pone.0107276.s001

(DOCX)

tabel S2.

Mutationsanalyse og overlevelse information af 174 NSCLC patienter. Sex, 1 han, 2 kvinder; Rygning, 0 ikke-ryger, 1 ryger; sti, patologi; WT, vildtype; DEL, sletning; INS, indsættelse; NEG, negativ; . POS, positiv

doi: 10,1371 /journal.pone.0107276.s002

(XLS)