PLoS ONE: Den int6 Cancer Gene og MEK signalveje Converge under zebrafisk Development

Abstrakt

Baggrund

Int-6

(integration sted 6) blev identificeret som et onkogen i en skærm af tumorigen musebrysttumor (MMTV) indrykninger.

int6

udtryk ændres i humane kræftformer, men den præcise rolle forstyrret

int6

i tumorigenese er fortsat uklart, og en dyremodel til at studere

Int-6

fysiologiske funktion har manglet.

vigtigste resultater

Her skaber vi et

in vivo

model af int6 funktion i zebrafisk, og gennem genetiske og kemiske-genetiske metoder implicerer int6 som et væv -specifik modulator af MEK-ERK-signalering. Vi finder, at int6 er påkrævet for normal ekspression af MEK1-protein i humane celler, og for Erk signalering i zebrafisk embryoer. Tab af enten int6 eller Mek signalering forårsager defekter i kraniofacial udvikling, og int6 og Erk-signalering har overlappende områder af væv udtryk.

Betydningen

Vores resultater giver ny indsigt i den fysiologiske rolle af hvirveldyr int6, og få konsekvenser for behandling af humane tumorer, der udviser ændret

int6

udtryk

Henvisning:. Grzmil M, Whiting D, Maule J, Anastasaki C, Amatruda JF, Kelsh RN, et al . (2007)

int6

Cancer Gene og MEK signalveje Converge under zebrafisk Development. PLoS ONE 2 (9): E 959. doi: 10,1371 /journal.pone.0000959

Academic Redaktør: Thomas Zwaka, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: August 3, 2007; Accepteret: September 2, 2007; Udgivet: 26 September, 2007

Copyright: © 2007 Grzmil et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af en MRC tilskud til EEP, og ved tilskud fra CRUK og AICR til CJN. Funders havde ingen rolle i udformningen eller gennemførelse af undersøgelsen, i indsamling, analyse, eller fortolkning af dataene, eller i forberedelsen, anmeldelser, eller godkendelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklærede, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

fosterudviklingen og tumor udvikling ofte deler underliggende molekylære mekanismer-et koncept illustreret ved identifikation af gener forstyrret af den musebrysttumorvirus- (MMTV) i mammary cancere [1]. Et vigtigt eksempel,

Int-1

gen, som er en fælles integration site for MMTV i brystkirtler tumorer, koder for homolog af

Drosophila vingeløse

gen [2], [3] og blev efterfølgende navngivet

Wnt1

(vingeløse /Int) i erkendelse af denne bevarede funktion. Wnt signalering vides nu at blive forstyrret i mange humane tumortyper, især tyktarmskræft [4]. Andre

Int

gener, såsom

Int-2

og

4

(Fgf3, 4), og

Int-3

(Notch4), indkode mitogener og myndigheder i udvikling, der også misactivated i mange kræftformer [1], [5].

i de fleste tilfælde, MMTV aktiverer

Int

genekspression som følge af proviral integration opstrøms af promotorregionen. Bemærkelsesværdigt, alle tre MMTV insertioner fundet i

Int-6

, som koder for en komponent i den eukaryote oversættelse initation faktor 3 (eIF3), viste sig at ligge inden introner, og i den modsatte transkriptionelle orientering til

Int-6

genet, hvilket skaber en afkortet

Int-6

mRNA [1], [6]. Ektopisk udtryk for tilsvarende afkortet

Int-6

kan omdanne cellekulturer [7], [8], og fremme vedvarende mamma alveolær hyperplasi og tumorigenese i transgene mus [9].

På trods af vigtige beviser til fordel for en rolle for int6 i human tumorudvikling [10] – [12], den molekylære basis for int6 i udvikling af kræft er stadig uløst. Stærkt konserveret i eukaryoter, indeholder int6 et PCI domæne, der findes i proteiner af 19S regulerende låget af proteasomet, den COP9 signalosom (CSN), og eIF3 translationsinitiering kompleks; alle tre komplekser deler overordnet strukturel lighed, og int6 er fundet forbundet med hver [13]. Når overudtrykt i gær, int6 inducerer multiresistens ved at aktivere en AP-1 transkriptionsfaktor [14], [15], og i humane celler, rækken af ​​int6 funktion omfatter ordnet udvikling gennem mitose [16], regulering af proteasomet -afhængige stabilitet MCM7 [17] og HIF2α [18], og vrøvl medieret mRNA henfald [19].

med ingen dyremodel for int6 tab af funktion til rådighed, vi begrundet, at en forståelse af

int6

under udvikling vil give nye indsigt i int6 funktion i normale celler fra hvirveldyr, hvilket giver et nyt perspektiv på int6 funktion i dannelsen af ​​kræft. Her bruger zebrafisk og pattedyrceller beskriver vi den første int6 tab af funktion fænotype i et dyr, og forbinde int6 med en signalvej, der ligesom de udføres af andre

Int

gener, er afgørende for både udvikling og kræft.

Resultater

int6 er afgørende for zebrafisk embryogenese

Vi valgte at studere den fysiologiske rolle af zebrafisk int6 under udvikling, ved hjælp af morpholino oligonukleotider (MOS) for at reducere int6 protein, samt en

int6

hi2470

insertionel mutant linje (venligst stillet til rådighed af N. Hopkins, A. Amsterdam og S. Farrington. MIT). Zebrafisk int6 er over 90% identisk i dets aminosyresekvens til humant int6 (

Ensembl

ENSDARG00000002549) og under anvendelse af en int6 antistof rejst mod N-terminalen af ​​det humane int6 [20] vi fastslået, at

int6

MO resulterede i tab af int6 (figur 1A). Som int6 er blevet impliceret i G2 /M-fase-cellecyklus kontrol, vi først udrettet al-mount immunhistokemi med den sene G2 /M-fasen markering, phospho-histon H3, og fandt kun lidt reduceret antal celler i sene G2 /M-fase i

int6

morphant sammenlignet med kontrolgruppen (Figur S1). Vigtigt er det, fandt vi, at embryoner injiceret med

int6

MO havde specifikke udviklingsmæssige defekter (figur 1B-N), især reduceret melanisation 2 dage efter befrugtningen (dpf:

int-6

MO n = 51/53; con MO n = 0/35;

int-6 5MM

n = 3/31); malplacerede pigment celler i halen 3 dpf (

int-6

MO n = 46/49; con MO n = 3/30); og unormal kæbe morfogenese, med brusk elementer reduceret eller udformet forkert ved 4 og 5 dpf (

int-6

MO n = 81/85 4 dpf, n = 76/83 5 dpf, con MO 1/67 4 dpf , n = 1/61 5 dpf). De kraniofaciale og pigment celle defekter observeret i

int-6

morphant og

hi2470

mutant tyder på, at

int-6

kan bidrage til udvikling af neural crest-celler (NCC ) derivater. Vi brugte flere markører for NCC’erne og deres derivater til at vurdere, hvornår disse fænotyper opstår, og fundet int6 syntes ikke at være behov for specifikationen eller organisation premigratory og migrerende brusk forstadier (Figur S2). I modsætning hertil alcian blå brusk farvning afslørede et konkret tab af de fem ceratobranchial brusk elementer i

int6

morphants, mens Meckel s, palatoquadrate, og hyoid brusk var alle til stede, omend misdannet (5,5 dpf

int6

MO n = 45/53; con MO n = 1/34; Figur 1I-L, fig S3). Angivelse af

int6

mRNA restaureret normale kraniofaciale elementer til

int6

morphant (

data ikke vist

); og

int6

hi2470

mutant havde en næsten identisk kraniofaciale fænotype (figur 1 M, N) angiver en ægte krav for int6 i kraniofaciale udvikling.

(A) Western blot-analyse af int6 (*) i zebrafisk embryoner injiceret med en kontrol (con) MO eller

int6

MO. (B)

int6

morphant melanocytter er mindre mørkt pigmenterede. (C-F) int6 er nødvendig for pigment celle placering i halen, som

int6

morphants og

int6

hi2470

mutanter har mistet pigment celler i halefinnen (D, pil ). Ambient lyset lyser iridophore ‘star-light “mønster ses i

int6

hi2470

embryoner (F, pil). (G-H) Ved 5 dpf, embryoner injiceret med en con MO har klart synlige certobranical buer, mens

int6

morphants ikke har synlige certobranical buer, foruden andre abnormiteter, herunder uforbrugt blommesæk, hjerte og eye udvikling. (I). Alcian Blue farvning af 5 dpf embryoer viser tab af ceratobrancial buer 1 til 5. M, Meckel s; PQ, palatoquadrate; CH, ceratohyal; CB, ceratobrancial.

Tab af int6 ændrer MEK protein og Erk signalering

Biokemisk beviser i fission gær tyder på, at int6 er en del af en specialiseret eIF3 translationsinitiering kompleks, der kan målrette specifikke mRNA til oversættelse [21]. Givet involveringen af ​​int6 i celleproliferation [16], western blots ved anvendelse af et panel af antistoffer mod proteiner involveret i cellecyklus og tilhørende signalveje blev udført under anvendelse lysater fra kontrol- og int6 siRNA transficerede MDA-MB-231-celler. Af 16-proteiner undersøgt på denne måde blev der kun MEK1 niveauer ændres ved int6 siRNA transfektion (figur 2). Som tidligere rapporteret [20], fandt vi

int6

-siRNA cellelysater havde reduceret niveauer af int6 protein sammenlignet med den ikke-transficerede og omvendt

int6

-siRNA sekvens. Vi fandt også en dramatisk reduktion af MEK1 protein niveauer, der korrelerede med tab af int6, mens BAX, tubulin og actin protein niveauer optrådte upåvirket i

int6

-siRNA transfekterede celler (figur 2A). Tabet af MEK1 var specifikt på proteinniveauet, som semi-kvantitativ-PCR viste normale niveauer af

MEK1

mRNA i

int6

-siRNA behandlede celler samt de forventede reducerede niveauer af den int6 besked i

int6

-siRNA transfekterede celler (figur 2B). Muligheden for, at

int6

kan påvirke MAPK signalering gennem styring af MEK protein niveauer fik os til at undersøge fosforylering staten Erk1 /2, nedstrøms mål af Mek kinaser, i

int6

morphant zebrafisk embryoner . Sammenlignet med kontrol MO embryoner,

int6

morphant embryo lysater havde reduceret phospho-ERK-niveauer (Figur 2C). Disse data tyder på en hidtil ukendt funktion for int6 i kontrollen af ​​MAPK signalering i udviklende embryo, eventuelt ved direkte styring af MEK1 proteinniveauer.

A. Osteosarcom U2-OS-celler utransficerede (U) eller transficeret med siRNA rettet mod

int6

mRNA (SI) eller omvendt rækkefølge (R), viser reducerede niveauer af int6 og MEK1 protein specifikt efter transfektion med

INT6-

siRNA, men ingen reduktion i BAX, tubulin eller actin protein niveauer. (B) Semi-kvantitativ-PCR shows

MEK1

mRNA er upåvirket i omvendt rækkefølge, og

int6

-siRNA behandlede celler, kombineret med de forventede reducerede niveauer af

int6

besked i

int6

-siRNA transfekterede celler. c, PCR-kontrol uden DNA. (C) Phospho-Erk niveauer reduceres i

int6

morphants, mens ponceau plet registrerer lige belastning af protein på gelen.

int6 og Mek veje konvergerer under udviklingen

Hvis int6 styrer Mek aktivitet i udviklingslandene embryo, vi teoretiseret, at bestemte udviklingslande væv kan have overlappende udtryk domæner int6 protein og phospho-Erk aktivitet. Faktisk immunhistokemi med antistoffer rettet mod int6 og phospho-Erk afslørede overlappende domæner udtryksformer i udviklingslandene kraniofacial region i 3 og 4 dpf embryoner (figur 3A-F). Stærk int6 vævsspecifik ekspression blev også påvist i udviklingslandene tarmen og linse, regioner, der havde lidt eller ingen phospho-Erk udtryk (figur S4). Givet den observerede phospho-Erk og int6 ekspression i kraniofaciale region, vi antaget, at nogle af de int6 fænotyper, såsom kæben dannelse defekt, kan phenocopied ved undertrykkelse af Erk signalering. Som fortolkning af MO fænotyper for nylig er blevet kompliceret af identifikationen af ​​MO-induceret p53-afhængige kraniofaciale defekter [22], brugte vi en alternativ fremgangsmåde – den meget selektive, klinisk aktiv MEK-inhibitor CI-1040 [23] – at reducere Mek signalering i zebrafisk. Vi lægemidlet tilsættes ved 4 HPF ved en koncentration på 0,25, 0,5 og 1,0 pM, og bekræftede tab af phospho-Erk ekspression ved Western blot-analyse (

data ikke vist

). Især tilsætningen af ​​CI-1040 forårsagede en dosisafhængig tab af de posteriore strukturer i embryoet, således at 1,0 pM CI-1040 forårsagede en alvorlig anterior-posterior (AP) akse defekt (figur 4A-C), i overensstemmelse med en rolle for FGF-signalering i udviklingen af ​​AP-aksen [24]. CI-1040 forårsagede også tab af ceratobranchial brusk elementer, mens de forreste elementer – Meckel s, palatoquadrate og hyoid brusk – var til stede, men misdannet (figur 3G-J), svarende til de virkninger, der ses i

int6

morphants og mutanter .

(A-F). Immuno-histokemi af int6 og phospho-Erk i udviklingslandene kraniofaciale væv, tæller farvet med hematoxylin, og phospho-histon H3 at vise cykling celler. (G, H) ventrale hele mount visninger af Alcian Blue farvet svælg brusk viser tab af ceratobrancial buer 1-5 og en reduktion af Meckel s (M), palatoquadrate (PQ) og ceratohyal (CH) brusken i 4 dpf embryoer behandlet med 0,5 uM CI-1040. (I, J) Dele af 4 DPF embryoner hæmatoxylin og eosin farves efter 0,5 uM CI-1040 behandling afslører tab af CB buer 1-5 (parentes). E, ethmoid plade; PC, Parachordal brusk.

For yderligere at belyse den biologiske relevans af int6 og Mek signalering, tog vi fordel af den lethed, hvormed signalveje kan ændres farmakologisk i specifikke genetiske sammenhænge i zebrafisk system. Vi ræsonnerede, at hvis int6 bidrager til aktivering af Mek signalering, embryoner derefter med reduceret int6 bør være overfølsomme over for lave doser af MEK-inhibitor CI-1040. I kontroldyr embryoer behandlet med 0,25 uM CI-1040, påvistes ingen ændringer i de anteriore-posteriore akse (figur 4B). Desuden

int6

morphants genereret af lave doser af MO (0,25 ng) havde ikke en ændret AP akse (figur 4D). I modsætning hertil i kombination med lave doser af CI-1040, den lave dosis

int6

morphant viste en alvorligt forøget AP akse fænotype (figur 4E). Tilsammen disse data give yderligere beviser for, at

int6

kan spille en rolle i modulerende MEK signalering

in vivo

.

(A-C). Kun embryoer behandlet med 1,0 pM CI-1040, og ikke 0,25 uM, viser et tab af posterior strukturer, i modsætning til (D)

int6

morphants (

int6

MO 0,25 ng). (E, F) I kombination med 0,25 uM CI-1040, 0,25 ug

int6

MO forårsager en dramatisk ændring af den forreste-bageste akse.

Diskussion

Aktiveret i de fleste kræftformer, den MAPK signalvejen er blandt de mest attraktive mål for nye kræftbehandlinger [23]. Ligesom MAPK signalveje, det meste af

Int

veje – Wnt, FGF, og Notch – er bevaret regulatorer af udvikling, der ofte aktiveres for at fremme onkogenese. Vi leverer dokumentation for, at, ligesom andre

Int

genprodukter,

int6

er nødvendig for hvirveldyr udvikling (figur 1), dels ved at give en ny lag af MAPK signaltransduktion regulering (figur 2) . Med den brede vifte af cellulære aktiviteter tilskrevet int6, forbliver den mekanistiske detaljer af denne kontrol skal forstås; vores tidlige undersøgelser tyder reduktion af MEK1 i

int6

-siRNA behandlet pattedyrceller ikke afhængig af proteasomet (MG CJN,

upublicerede data

), hvilket gør direkte MEK1 regulering af int6-afhængig oversættelse en mulighed.

for nylig, vigtigheden af ​​RAS, RAF og MEK i human sygdom er blevet forlænget ud over kræft ved opdagelsen af, at humane kim-line mutationer i disse gener forårsage LEOPARD-Noonan familie af syndromer [25] . Detaljerede immunhistokemiske undersøgelser af mus har identificeret stærkt regulerede, specifikke områder af diskrete og dynamiske ERK fosforylering hele udvikling, herunder svælg buer og lemmer knopper [26]. I de første int6 protein ekspressionsundersøgelser i helhed udvikler dyr, viser vi, at int6 regionalt har overlappende domæner af protein-ekspression med phospho-Erk, primært i kraniofaciale region (figur 3, figur S4). Udlån biologisk betydning for disse observationer, viser vi, at fænotypiske egenskaber deles mellem tabet af int6 og hæmning af Mek aktivitet (figur 3). Desuden delvist tab af int6 forårsager embryoner at være meget følsomme over for et mildt kompromitterende dosis af Mek inhibering, afslører en

in vivo

interaktion mellem int6 proteinekspression og udviklingsmæssige Mek-Erk signalering (figur 4). Allerede overekspression af Ras-Raf-Mek signalering forårsager morfologiske fejl, vi i øjeblikket genererer transgene linjer, der tillader tidsmæssig styring af Mek signalering, som vil være et værdifuldt værktøj til dybere genetisk dissektion af int6-Mek-Erk forhold

in vivo

. Det vil være afgørende i fremtidige undersøgelser for at fastslå, om int6 er i stand til at styre både MEK1 og MEK2; vores indledende MO undersøgelser viser, at MEK2 kan have en særlig rolle i melanocyt migration (CA EEP,

upublicerede data

), øge muligheden, at pigment celle migration defekter observeret i

int6

morphants afspejler også ændret MEK signalering.

FGF signalering er afgørende for skelet udvikling, eksemplificeret ved de mutationer, der forstyrrer FGF signalering i humane genetiske skelet abnormitet syndromer [27]. I udviklingslandene muse embryo, fleste phospho-ERK domæner overlapper FGF signalering domæner [26]. FGF signalmolekyler er kandidater til opstrøms aktivering af int6-modereret Mek-Erk signalering, der former den kraniofaciale skelet i hvirveldyr [28], [29], og kandidatlande nedstrøms mål for int6-Mek-Erk signalering omfatter chondrocytter differentiering transskription faktor Sox9 , som kræver Mek aktivitet for transkriptionel aktivitet [30]. Vi bemærker også, at

ERK2

, men ikke

ERK1

, udtrykkes specifikt i svælg buer i to dage gamle zebrafisk embryoner [31], muligvis antyder, at int6-Mek graduering i udviklingslandene kraniofaciale region kan specifikt signalere gennem mål for Erk2.

Vedrørende den int6 graduering af Mek-Erk signalering til udvikling af kræft er en ny vinkel til fremtidig undersøgelse. En mulighed er, at i MMTV inducerede brysttumorer, kan den trunkerede Int-6-protein fungere som et onkogen ved at ændre MEK-ERK-signalering. Vi foreslår, at de forskellige cellulære steder i int6, kombineret med den tidsmæssige udtryk og lokalisering af MEK1 /2 og Erk1 /2, kan resultere i finjustering af Mek-Erk signalveje i specifikke væv under udviklingen, og kan have stor betydning for rolle int6 i tumorigenese.

Metoder

zebrafisk opdrætsmetoder og morpholino undersøgelser

Zerbafish (

Danio rerio

) linjer AB, AB *, og AB * -TPL blevet rejst og iscenesat som beskrevet [32], [33]. MOS (tabel 1) blev designet af og indkøbt fra Gene Tools, LLC (USA), og 1 ng injiceret i en celle embryoer.

Fænotype analyse

Fænotype analyse var udført som beskrevet: cellecyklus undersøgelser [34]; Alcian Blue farvning [35]; sonde syntese og hele-mount in-situ hybridiseringer [36]. cDNA-prober for crista neuralis markører var venlig gave fra David Raible (University of Washington, USA). Polyadenyleret

int6

mRNA blev genereret under anvendelse Ambion mMessage mMachine (# 1340).

Cellekultur og RT-PCR-analyse

MDA-MB-231-celler blev dyrket og transficeret som beskrevet [19] under anvendelse af lipofectamin (Invitrogen) med SI-oligonukleotider (tabel 1; Eurogentec) ved en slutkoncentration på 100 nM i Optimem (Gibco). Otteogfyrre timer efter transfektion totalt RNA blev isoleret (RNeasy Mini Kit, Qiagen). Og ét-trins RT-PCR-reaktioner (Qiagen) gennemføres ved anvendelse af specifikke primere (Tabel 1)

immunblotting

hel-cellelysater og zebrafisk ekstrakter blev genereret [31], [19] og immunohistokemi blev udført som beskrevet [36]. Antistoffer anvendt som i tabel 2.

Støtte oplysninger

figur S1.

Cell cyklus analyse af int6 morphants. Whole-mount immunhistokemi med de sene G2 /M-fasen markering, phospho-histon H3 viser et lidt reducerede antal celler i sene G2 /M-fasen i int6 morphant sammenlignet med kontrollen. Tilsvarende DNA-indhold som målt ved flowcytometri afslører kun en lille reduktion af celler i G2 /M-fase i int6 morphant. Således finder vi, at tabet af int6 i normale celler fra hvirveldyr (samt i yderligere menneskelige kræftceller, MG CJN upublicerede data) vises ikke resultere i en ophobning af celler i G2 /M progression

doi.: 10,1371 /journal.pone.0000959.s001

(4,75 MB TIF)

Figur S2.

Lateral udsigt over in situ hybridisering af neurale crest markører i kontrol- og int6 morphants, afslører nogen ændring i celle nummer eller migration som angivet af tilsyneladende normale udtryk for dlx2 (trin 6-36 HPF, undersøges med to timers mellemrum), heller ikke af tidlige markører af NCC og melanocytter, såsom sox10, crestin, snegl og mitfa (24 HPF) i int6 morphants. Disse observationer blev udvidet ved undersøgelse af en transgen sox10-GFP linje (1) afslører uændret GFP-udtrykkende NC-afledte celler i int6 morphants inden for de første 48 HPF, men et tab af GFP udtrykke differentierede svælg buer 3-7 af 3 dpf ( data ikke vist)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0000959.s002

(40,41 MB TIF)

Figur S3.

Udvikling af svælg buer i udviklingslandene kontrol (A-C) og (D-F) int6 morphant dyr. Bemærk tabet af svælg buer (A, beslag) i int6 morphants (beslag). Snit blev farvet med methylenblåt. Anterior til venstre

doi:. 10,1371 /journal.pone.0000959.s003

(14,09 MB TIF)

Figur S4.

Immunhistokemi af int6 og phospho-Erk farvning i 4 dpf embryoer. (A, B) Mens int6 og phospho-Erk signalering overlapning på kraniofaciale region, de har også forskellige mønstre, for eksempel i øjet og (C, D) gut. Vi bemærker, at mens int6 og phospho-Erk har overlappende domæner udtryksformer i kraniofacial region, int6 farvning i kraniofaciale region var stærkere end phospho-Erk, og phospho-Erk farvning var begrænset til bestemte væv i kraniofaciale region. M, Meckel s; E: ethmoid plade; CH, ceratohyal; CB, ceratobrancial. Sagittal sektion, forreste til venstre

Doi:. 10.1371 /journal.pone.0000959.s004

(17.60 MB TIF)

Tak

Vi er taknemmelige for N. Hopkins , A. Amsterdam og S. Farrington for

int6

hi2470

linje; R. Marais og C. Marshall for CI-1040; D. Raible for DNA-konstruktioner; K. Gull for anti-tubulin-antistoffer; E. Prichard for yderligere CI-1040 observationer; D. Faratian hjælp til immunhistokemi; B. Morgan for hjælp med manuskriptet forberedelse; L. Poulton til kritisk læsning af manuskriptet; og N. Hastie og D. Harrison til nyttige diskussioner.