PLoS ONE: Fiskeolie Undertrykker cellevækst og metastatisk potentiale ved Regulering PTEN og NF-KB Signaling i kolorektal cancer

Abstrakte

Homeostase i eukaryote væv er stramt reguleret af en indviklet balance i prosurvival og antisurvival signaler. Tumorsuppressoren PTEN (phosphatase og tensin homolog slettet på kromosom 10), en dual-specificitet phosphatase, spiller en funktionel rolle i cellecyklus og apoptose. NF-KB og dens downstream regulatorer (såsom VEGF) spiller en central rolle i forebyggelsen af ​​apoptose, fremme af inflammation og tumorvækst. Derfor vi mente at estimere ekspressionen af ​​PTEN, Poly-ADP-ribose-polymerase (PARP), at NF-κBp50, NF-κBp65 og VEGF evaluere virkningen af ​​tilskud af fiskeolie på apoptotiske og inflammatorisk signalering i coloncarcinom. Wistar hanrotter i gruppe I modtog renset kost, mens gruppe II og III modtaget modificeret kost suppleret med FO:CO (01:01) FO:CO (2.5:1) hhv. Disse blev yderligere opdelt i kontroller modtager ethylendiamin-tetra eddikesyre-syre og behandlede grupper modtog dimethylhydrazin-dihydrochlorid (DMH) /uge i 4 uger. Dyrene aflivet 48 timer efter sidste injektion udgjorde indledning fase, og at ofret efter 16 uger udgjorde efter initiering fase. Vi har analyseret ekspression af PTEN, NF-κBp50, NF-κBp65 ved flowcytometer og nuklear lokalisering af NF-KB ved immunofluorescens. PARP og VEGF blev vurderet ved immunhistokemi. I indledningen fase, har dyr, der fik DMH vist øget% af apoptotiske celler, PTEN, PARP, NF-κBp50, NF-κBp65 og VEGF dog i post-initiering fase ingen signifikant ændring i apoptose med nedsat PTEN og øget PARP, NF-κBp50 , NF-κBp65 og VEGF blev observeret i sammenligning med kontroldyr. På behandling med begge andele af fiskeolie i begge faser, forstærkning i% af apoptotiske celler, nedsat PTEN, PARP, NF-κBp50, NF-κBp65 og VEGF blev dokumenteret med hensyn til DMH behandlede dyr med virkning bliver mere udøves med højere ration i post-initiering fase. Derfor fiskeolie aktiverer apoptose, mindsker DNA skader og inhiberer inflammatorisk signalering i en dosis og tidsafhængig måde, således at inhibere progression af tyktarmskræft

Henvisning:. Kansal S, Bhatnagar A, Agnihotri N (2014) Fish Olie Undertrykker cellevækst og metastatisk potentiale ved Regulering PTEN og NF-KB Signaling i kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (1): e84627. doi: 10,1371 /journal.pone.0084627

Redaktør: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, USA

Modtaget: September 30, 2013; Accepteret: November 25, 2013; Udgivet: 8. januar 2014

Copyright: © 2014 Kansal et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra det indiske råd for medicinsk forskning (Immuno /18/11/27/2008-ECD-i). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epidemiologiske rapporter har vist, at forekomsten af ​​kræft er stigende på verdensplan [1]. Kræft er den sygdom, hvor der er en deregulering af celleproliferation og celledød. I kræftceller, endogene signaltransduktionsveje får forstyrret at omdirigere de cellulære beslutninger fra differentiering og apoptose til spredning og senere invasion [2]. Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signalvejen spiller en afgørende rolle i at fremme celleoverlevelse ved at hæmme apoptose. PI3K konverterer plasmamembranen lipid phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP

2) til phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphat (PIP

3), som derefter rekrutterer proteiner, der indeholder en pleckstrin homologi (PH) -domæne til cellemembraner [3] såsom phosphoinositol afhængig kinase-1 (PDK1) og Akt. Aktiveret Akt er den fremherskende og afgørende mediator for regulering af apoptose og spredning ved at målrette forskellige downstream substrater: IKB kinase, Bcl-2, cytochrom c og andre [4], [5]. Aktivitet af PI3K /Akt pathway er negativt reguleret af phosphatase og tensin homolog slettet på kromosom 10 (PTEN). PTEN dephosphorylerer 3’OH-gruppen og konverterer PIP

3 ind PIP

2, hvilket fører til aktivering af apoptose og dermed fungerer som en tumorsuppressor [6]. Rapporterne er blevet vist, at ekspressionen af ​​

PTEN

er transkriptionelt undertrykt gennem aktivering af NF-KB. NF-KB består af transaktivering subunit RelA /p65 og DNA-bindende subunits p50 og p52, som behandles fra forstadiet har p105 og p100 henholdsvis [7]. NF-KB er afsondret i cytoplasmaet af inhibitoren IKB at forhindre transskriptionel aktivering i ustimulerede betingelser. De inflammatoriske cytokiner forårsage phosphorylering af IKB, hvilket igen frigiver NF-KB, som efterfølgende translokerer til kernen og påvirke ekspressionen af ​​target gener med vigtige roller i inhibering af apoptose, fremme af tumorvækst, og aktivering af inflammatoriske reaktioner, som yderligere fremmer metastase ved at øge ekspressionen af ​​vasucular endotelvækstfaktor (VEGF) [8]. Den kovalente modifikation af proteiner ved poly (ADP-ribosyl) ation er en umiddelbar og dramatisk biokemiske respons på DNA beskadigelse. Det er et ubikvitært protein modifikation fundet i mammale celler som modulerer mange cellulære responser, herunder DNA-reparation. Poly-ADP-ribose-polymerase (PARP) katalyserer polymerisationen af ​​ADP-riboseenheder fra donor NAD

+ molekyler på målproteiner, hvilket resulterer i binding af lineære eller forgrenede polymerer [9]. PARP udviser pleiotrope cellulære funktioner lige fra vedligeholdelse af genomisk stabilitet og kromatin remodeling til regulering af celledød, hvorved de PARP homologe som en lovende mål i kræftbehandling [10].

Epidemiologiske rapporter har vist, at kolorektal cancer ( CRC) er den tredje mest almindelige cancer hos mænd (efter prostatakræft og lungekræft) og kvinder (efter brystkræft og lungekræft) [1]. Eksperimentelle undersøgelser har vist, at en række faktorer er forbundet med udviklingen af ​​CRC [11]. De tidligere eksperimenter udført i vores laboratorium har vist, at administration af fiskeolie (n-3 PUFA) /majsolie (n-6 PUFA) i 2,5 /1 forhold har en bedre effektivitet i forhold til 1/1 for kemoforebyggelse af eksperimentelt induceret kolorektal cancer [12]. En anden undersøgelse har vist, at kemoforebyggende virkning af forskellige forhold mellem fiskeolie og majsolie kan medieres gennem Ras-signalvejen [13]. En af en anden undersøgelse fra vores laboratorium har vist, at fiskeolie (FO) og majsolie (CO) i 2.5:1 forholdet ændres mitokondriemembranen parametre, ROS, og Ca

2+ på en sådan måde for at øge apoptose i begge faser, mens FO:CO i 1:01 forhold forbedret apoptose kun i post-initiering fase [14]. Det er blevet vist tidligere, at EPA og DHA øget niveau af PTEN som igen inhiberede transkription af anti-apoptotiske gener, dermed demonstrerede de gavnlige virkninger af fiskeolie på bryst tumorcellevækst [15]. Derfor blev den foreliggende undersøgelse at forstå betydningen af ​​forskellige forhold mellem fiskeolie og majsolie på apoptotiske veje og metastatisk potentiale medieret af PTEN og NF-KB i eksperimentelt induceret coloncancer.

Materialer og metoder

Kemi

N, N ‘

-Dimethylhydrazine dihydrochlorid (DMH), paraformaledhyde (PFA), propidiumiodid (PI), Hoechst 33342 (H342) og bovint serumalbumin (BSA ) blev opnået fra Sigma Chemical Company, St. Louis, USA. Det monoklonale antistof mod PTEN blev indkøbt fra genescript, Piscataway, NJ, USA. De monoklonale antistoffer mod PARP, VEGF, NF-KB p50 og NF-KB p65 blev indkøbt fra Santacruz, CA, USA og BD Biosciences, MD, USA hhv. Fluorescein (FITC) -konjugeret gede anti-mus IgG

1 blev købt fra Bangalore Genei, Bangalore, Indien. Maxepa fiskeolie [indeholdende 180 mg eicosapentaensyre (EPA) og 120 mg docosahexaensyre (DHA) /ml] blev opnået fra Merck Chemicals Limited, Goa, Indien og Majsolie indeholdende 58,8% linolsyre, 26,4% oliesyre, 1,3% linolensyre og 12,8% mættet fedtsyre blev indkøbt fra Sigma Chemical Company, St. Louis, USA. Mineralet blanding (Agrimin) blev opnået fra Virbac Dyresundhed India Pvt. Ltd, Mumbai, Indien. Alle andre kemikalier, der anvendes i undersøgelsen var af analytisk kvalitet.

Dyr og Kost

Wistar hanrotter, der vejede 100-200 g blev opnået fra og har til huse i det centrale Animal House, Panjab University, Chandigarh . De eksperimentelle protokoller blev godkendt af “Institutional Animal Ethics Committee, Panjab University, Chandigarh” (Ref. Nr. 1-12 /IAEC 2009/03/09) og udføres i henhold til retningslinjerne fra “Indian National Science Academy” til brug og pleje af forsøgsdyr. Dyrene blev huset i polypropylen bure i dyret huset og blev akklimatiseret inden den anvendes i det eksperimentelle undersøgelse. Vand blev givet

ad libitum

. Efter en uges akklimatisering blev dyrene tilfældigt opdelt i de forskellige grupper og blev fodret eksperimentelle diæt i fire uger. Sammensætningen af ​​eksperimentelle kost er givet i tabel 1. kostvaner blev udarbejdet på grundlag af det amerikanske Institute of Nutrition standard henvisning kost AIN-76A [16]. Sammensætningen af ​​alle eksperimentelle diæter blev indstillet således, at dyr i alle grupper ville forbruge den samme mængde kalorier [12].

Eksperimentel udformning

Det eksperimentelle design er vist i fig . 1. Wistar-hanrotter (N = 96) blev ligeligt fordelt i følgende forsøgsgrupper:

De isolerede colonocyter blev inkuberet med Hoechst 342 (H342) farvestof og PI. Mikrofotografier blev erhvervet med fluorescerende mikroskop (Nikon Eclipse 80

i

) A- kontrolgruppe, B- DMH behandlet, C) FO + CO (01:01) + DMH, D) FO + CO (2.5:1 ) + DMH. Mørkeblå farve repræsenterer de normale levende celler, svag blå eller lyserød repræsenterer apoptotiske celler (forstørrelse 400 ×). E) Grafisk fremstilling af% af levende og apoptotiske celler i forskellige grupper. Resultaterne er udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse. for n = 4 (

** p 0,01 wrt kontrol,

### p 0,001 wrt DMH).

kontrolgruppe)

– Disse dyr modtog oprenset diæt og en ugentlig intraperitoneal injektion af 1 mM ethylendiamin tetra-eddikesyre (EDTA), pH 6,5, i en periode på 4 uger

DMH behandlet

-. dyrene i denne gruppe fik oprenset kost sammen med en ugentlig intraperitoneal injektion af DMH (20 mg /kg legemsvægt) i 4 uger.

FO + CO (1:01) + EDTA

dyrene fik en modificeret kost suppleret med 1:01 forhold af FO og CO. en ugentlig intraperitoneal injektion af EDTA blev også givet for en periode på 4 uger.

FO + CO (01:01) + DMH

en modificeret kost suppleret med 1:01 forhold af FO og CO blev givet til dyrene i denne gruppe, og en ugentlig intraperitoneal injektion af DMH for en periode på 4 uger.

FO + CO (2,5 :1) + EDTA

dyrene i denne gruppe blev givet modificeret kost suppleret med FO + CO i forholdet 2.5:1 og modtog en ugentlig intraperitoneal injektion af EDTA i en periode på 4 uger.

FO + CO (2.5:1) + DMH

en modificeret kost suppleret med FO + CO i forholdet 2.5:1 blev givet til dyrene i denne gruppe og en ugentlig intraperitoneal injektion af DMH i en periode på 4 uger.

Hver gruppe blev yderligere opdelt til undersøgelser af initiering og post indledningen fase og dyrene blev ligeligt fordelt mellem de to faser. De dyr, som blev ofret 48 timer efter den sidste EDTA /DMH injektioner udgjorde indledningen fase [17], og dyrene holdes i 12 uger efter behandlingen regime udgjorde den post-forberedelsesfasen studie. Alle dyr blev aflivet ved cervikal dislokation.

Isolering af de colonocyter

colonocyter blev isoleret ved fremgangsmåden ifølge Sanders [18]. Hele tyktarmen blev skåret på langs for at eksponere lumen og anbringes i varm Ca

2+ og Mg

2+ free-Hanks pufrede saltopløsning (HBSS), 30 mmol /l EDTA, 5 mmol /l dithiothreitol (DTT) , 0,1% BSA (bovint serumalbumin). Efter en 15 min rystning inkubation ved 37 ° C blev den mucosale side skrabes forsigtigt for at fjerne de intakte krypter. De isolerede celler blev derefter centrifugeret ved 2200 rpm og vasket to gange i varm HBSS indeholdende 1,3 mM CaCI

2, 1 mM magnesiumsulfat

4 og 0,1% BSA. Cellerne blev talt ved hjælp af et hæmocytometer og deres levedygtighed blev kontrolleret af trypan udelukkelse metode blå [19].

Estimering af levende og apoptotiske celler

Den procentdel af levende og apoptotiske celler blev vurderet ved immunfluorescens . Isolerede colonocyter (1-2 x 10

6) blev resuspenderet i 1 ml PBS og inkuberet med 10 pi Hoechst 342 (H342) farvestof (1 mM) ved 37 ° C i 1 time. Cellerne blev vasket to gange og resuspenderet i PBS. Derefter blev cellerne inkuberet med 10 pi PI (1 mg /ml) ved 37 ° C i 10 min. Cellerne blev igen vasket og resuspenderet i PBS. Mikrofotografier blev erhvervet ved hjælp af fluorescerende mikroskop (Nikon Eclipse 80

i

) og analyseret ved hjælp af Northern Eclipse imaging Elements-D (NIS-D) software. Mikrofotografier af celler med H342 og PI blev fusioneret. I flettede mikrofotografier, celler med lyserøde farve celler og celler med mørk blå farve på periferien repræsenterer apoptotiske celler med kondenseret /fragmenteret DNA henviser fainted blå over blev anset for at være de normale celler.

Analyse af PTEN, NF- KB-p50 og NF-KB-p65 ved flowcytometer

De intracellulære proteiner blev estimeret ved flowcytometer. De colonocyter blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved stuetemperatur. Efter vask med PBS to gange, blev colonocyter permeabiliseret med 100% iskold methanol (tilsat dråbevis) og efterladt i 15 minutter ved -20 ° C. Cellerne blev vasket igen i kold PBS to gange. Ca. 1 x 10

6-celler blev tilsat til en FACS rør, resuspenderet i saponin buffer (PBS indeholdende 0,1% saponin og 2% BSA) og inkuberet i 30 minutter ved 4 ° C. De forskellige portioner af colonocyter blev derefter inkuberet med fortyndet PTEN, NF-KB p50 og NF-KB p65 (1:100) monoklonale antistoffer i 30 minutter ved stuetemperatur og derefter vasket en gang med saponin buffer. De colonocyter blev derefter inkuberet med fortyndet FITC-konjugeret sekundært antistof i 45 minutter ved stuetemperatur. Cellerne blev vasket en gang med saponin buffer og derefter med PBS. Cellerne blev resuspenderet i PBS. Købet fra hver prøve blev udført på FACS Canto (BD Biosciences, US) og de indsamlede data blev analyseret ved hjælp af BD FACS Diva software. De efterfølgende kontroller for PTEN, NF-KB p50 og NF-KB p65 blev også køre samtidig. Resultaterne af PTEN, NF-KB p50 og NF-KB p65 var repræsenteret som gennemsnittet af Net MFI (MFI på celler behandlet med Ab – MFI på celler kun)

Lokalisering af NF-KB p50 og NF. -κB p65 ved immunfluorescens

De isolerede faste colonocyter blev vasket med iskold PBS to gange. Cellerne blev lufttørret på objektglas (VWR Scientific, Thane, Maharashtra, Indien) og fik lov at adhærere i 10 minutter ved stuetemperatur. Cellerne blev permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 og ikke-specifik binding blev blokeret ved anvendelse af 2% (vægt /volumen) BSA i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur, før inkubering med fortyndet monoklonalt antistof mod NF-KB p50 (1 :50) og NF-KB p65 (1:50) i 1 time ved stuetemperatur. Prøver blev vasket med PBS, inkuberet med fortyndet FITC-konjugeret anti-muse-IgG

1 i 2 timer ved stuetemperatur og igen vasket med PBS. Snittene blev modfarvet med PI i 10 minutter ved stuetemperatur og derefter vasket med PBS. Snittene blev monteret og forseglet med den klare søm maling. Billederne blev erhvervet ved hjælp af et fluorescerende mikroskop (Nikon Eclipse 80

i

) og analyseret med Northern Eclipse imaging Elements-D (NIS-D) software. Mikrofotografier af celler med NF-KB-P50 /p65 og PI blev fusioneret. Efter at samle de mikrofotografier, grøn farve indikerer ekspressionen af ​​NF-KB p50 /p65 i cytoplasmaet af cellen, røde farve repræsenterer nuklear farvning med PI og gul farve indikerer lokaliseringen af ​​NF-KB p50 /p65 i cellekernen .

immunhistokemisk estimering af VEGF og PARP

De vævssnit (2-3 um tyk) blev monteret på poly-L-lysin coatede objektglas. Objektglassene blev opvarmet ved 65 ° C før afparaffinering i xylen. Objektglassene blev rehydreret med serielle alkoholopløsninger (100%, 90%, 70%, 50%, 30%). Endogen peroxidaseaktivitet blev standset ved inkubation af objektglassene med 3% H

2O

2 (i methanol) i 20 min ved 4 ° C. Snittene blev blokeret under anvendelse af 2% BSA i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur. Antigen genfinding blev udført med hentning puffer (pH 6,0) ved hjælp af mikrobølge (microwaved 5 min for VEGF og 5 min × 2 for PARP). Objektglassene fik lov at afkøle i 20 minutter. Efter antigen-genvinding blev sektionerne inkuberet med VEGF (1:100) og PARP (1:50) antistoffer natten over ved 4 ° C i et fugtigt kammer. Objektglassene blev vasket i PBS og efterfulgt af inkubation af 2 time med HRP-konjugeret anti-muse-antistof (1:100) for VEGF og HRP-konjugeret anti-kanin-antistof (1:100) for PARP ved 37 ° C i et fugtigt kammer. Objektglassene blev visualiseret ved hjælp af DAB og H

2O

2. Snit blev derefter modfarvet med hæmatoxylin i 2 minutter, efterfulgt af skylning i deioniseret H

2O. Slides blev dehydreret og monteret med DPX til analyse. Billeder blev erhvervet og analyseret ved hjælp af Nikon Eclipse 80

i

mikroskop (Japan) og Northern Eclipse imaging Elements-D (NIS-D) software.

Statistisk analyse

resultaterne blev udtrykt som gennemsnit ± SD Forskellene mellem grupperne blev vurderet af ANOVA efter at have sikret normalitet af Q-Q plot. Den anvendes til statistisk analyse software var SPSS 18,0 softwarepakke til vinduer. Den statistiske signifikans blev bestemt ved envejs ANOVA med Bonferroni multipel sammenligning post hoc test, og forskelle blev betragtet som signifikante for p. 0,05

Resultater

Effekt af tilskud af fiskeolie på apoptose /nekrose i eksperimentelt induceret coloncancer

i den foreliggende undersøgelse blev% af apoptotiske celler beregnes ved hjælp immunofluorescens og resultaterne er afbildet i fig. 1 og 2. I forberedelsesfasen, har dyr, der fik DMH vist en betydelig stigning i% af apoptotiske celler sammenlignet med kontroldyrene (Figur 1). Men på behandling med FO + CO (1:01) + DMH og FO + CO (2.5:1) + DMH, et signifikant fald i% af de levende celler og en betydelig forøgelse i% af apoptotiske celler blev observeret i sammenligning med DMH behandlede dyr. Det er blevet observeret, at i post-forberedelsesfasen, ved behandling med DMH, var der ingen signifikant ændring i% af apoptotiske celler sammenlignet med kontroldyrene (figur 2). Ved modtagelse både forholdene, fiskeolie og majsolie, er det blevet vist, at et betydeligt fald i% af de levende celler og en signifikant forøgelse i% af apoptotiske celler sammenlignet med DMH-behandlede dyr.

Den isolerede colonocyter blev inkuberet med Hoechst 342 (H342) farvestof og PI. Mikrofotografier blev erhvervet med fluorescerende mikroskop (Nikon Eclipse 80

i

) A- kontrolgruppe, B- DMH behandlet, C) FO + CO (01:01) + DMH, D) FO + CO (2.5:1 ) + DMH. Mørkeblå farve repræsenterer de normale levende celler, svag blå eller lyserød repræsenterer apoptotiske celler (forstørrelse 400 ×). E) Grafisk fremstilling af% af levende og apoptotiske celler i forskellige grupper. Resultaterne er udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse. for n = 4 (

### p 0,001 wrt DMH).

Ændring i ekspressionen af ​​PTEN på behandling med forskellige forhold mellem fiskeolie

Efter evaluering ændringer i% af apoptotiske celler på at modtage disse PUFA’er, vi derefter troede at undersøge ekspressionen af ​​regulator af apoptose. Tumorsuppressoren PTEN (phosphatase og tensin homolog) er den vigtigste regulator apoptotisk signaleringsvej. Derfor, i aktuelle undersøgelse blev ekspressionen af ​​PTEN anslået og resultaterne af PTEN er givet i tabel 1. I forberedelsesfasen har flowcytometrisk data afbildet at ekspression af PTEN var forhøjet betydeligt i DMH-behandlede dyr sammenlignet med kontroldyr mens på behandling af dyr med forskellige forhold mellem FO + CO, blev PTEN steget betydeligt i forhold til kontroldyr, men var stigningen mindre i forhold til DMH-behandlede dyr. De data, post-forberedelsesfasen har vist, at PTEN ekspression blev faldet betydeligt på behandling med DMH med hensyn til at kontrollere dyrene. Men på behandling med både de andele af fiskeolie og majsolie blev PTEN ekspression øget betydeligt. Stigningen var mere markant med FO + CO (2.5:1) + DMH i post-forberedelsesfasen.

Effekt af tilskud af fiskeolie og majsolie på PARP aktivitet

PARP er en rigelige DNA-bindende enzym, der detekterer DNA-strengbrud. PARP-enzymet spiller en vigtig rolle i forskellige cellulære funktioner, hvorved PARP som et lovende mål i cancerterapi [10]. Derfor, i den aktuelle undersøgelse, aktivitet af PARP blev analyseret for at undersøge effekten af ​​forskellige forhold mellem fiskeolie og majsolie på DNA-reparation enzym. Resultaterne af immunhistokemisk farvning af PARP er vist i fig. 3. tyktarmsslimhinden af ​​kontroldyr har afbildet meget moderat eller svag ekspression af PARP. Ved behandling med DMH blev PARP ekspression augmented i begge faserne sammenlignet med kontroldyr. Cellerne blev kraftigt positive for PARP i post-forberedelsesfasen sammenlignet med forberedelsesfasen. Dog på at modtage de forskellige forhold mellem fiskeolie og majsolie, blev udtryk for PARP faldet i forhold til DMH behandlede dyr med den virkning, der udtales med FO + CO (2.5:1) + DMH i post-forberedelsesfasen.

immunhistokemisk farvning af PARP i formalin fast paraffin indlejrede dele af colon væv. A-D viser de repræsentative mikrofotografier af forberedelsesfasen og E-H betegner den post-forberedelsesfasen ( “pil” afbilder ekspressionen af ​​PARP). (A og E) Styring, (B og F) DMH behandlet, (C og G) FO + CO (01:01) + DMH, (D og H) FO + CO (2.5:1) + DMH (forstørrelse 400X) .

Nedregulering af NF-KB-underenheder på tilskud af fiskeolie

aktiveringen af ​​NF-KB-vejen er en afgørende begivenhed i inflammationsinduceret tumorvækst og progression [20]. NF-KB er en allestedsnærværende transkriptionel faktor, der spiller en central rolle i celle overlevelse og celledød [21]. NF-KB er til stede i cytosolen i bundet form med IKB. Phosphorylering af serinrester af IKB proteiner ved IKB-kinaser (IKKS) målretter IKB for proteasomalaktivitet nedbrydning. De frie NF-KB underenheder (P50 og p65) transporteres til kernen som en dimer og målrette de promotorer, der fører til aktivering af gener, der er involveret i celleproliferation, invasion og celledød. NF-KB er negativt reguleret af PTEN og yderligere mål mange anti-apoptotiske gener, såsom Bcl-2 og Bcl-XL [15]. Derfor, efter en vurdering af den udtryk for PTEN, vi så tænkte at analysere udtrykket samt lokalisering af begge underenheder af NF-KB i eksperimentelt induceret tyktarmskræft.

Expression og Lokalisering af NF-KB-p65

ekspressionen af ​​NF-KB p65 blevet målt ved flowcytometer og lokalisering blev undersøgt under anvendelse fluorescensmikroskop. De flow-cytometrisk resultater af forberedelsesfasen afbildet, at ekspressionen af ​​NF-KB-p65 er øget betydeligt på behandling med DMH sammenlignet med kontroldyr. På behandling med FO + CO (01:01) + DMH blev NF-KB-p65 yderligere augmented betydeligt dog ved modtagelsen FO + CO (2.5:1) + DMH, ekspressionen af ​​NF-KB-p65 blev faldet betydeligt i forhold til DMH behandlede dyr (tabel 2). Den post-forberedelsesfasen data har vist, at på at give DMH blev NF-KB p65-ekspression øget væsentligt sammenlignet med kontroldyr. Ved behandling med både forholdene mellem FO + CO + DMH blev ekspressionen faldet betydeligt i forhold til DMH-behandlede gruppe. Faldet var mere markant med FO + CO (2.5:1) + DMH i forhold til FO + CO (01:01) + DMH.

Som de aktiverede NF-KB subunits translokerer fra cytoplasmaet til nucleus derfor i den foreliggende undersøgelse, kernelokalisering af NF-KB blev også evalueret. Resultaterne af lokalisering af NF-KB p65 er opsummeret i fig. 4. immunofluorescens data har vist, at behandling med DMH blev% af celler med NF-KB p65 i kernen og cytoplasmaet steget betydeligt i begge faser i sammenligning med kontroldyr (fig 4B . 4F). Men på behandling med forskellige andele af fiskeolie og majsolie, lokalisering af NF-KB p65 fra cytoplasmaet til cellekernen blev reduceret med effekten, idet mere markeret med FO + CO (2.5:1) + DMH i den post-forberedelsesfasen .

De isolerede faste colonocyter blev permeabiliseret og inkuberet med monoklonalt antistof mod NF-KB p65 og tilsvarende FITC-konjugeret sekundært antistof Snittene blev modfarvet med PI at visualisere kernelokalisering. Rød fluorescens repræsenterer kernefarvning af PI med ingen ekspression af NF-KB (vist med “stiplet pil”) og grøn fluorescens indikerer ekspressionen af ​​NF-KB p65. Gul farve angiver lokaliseringen af ​​NF-KB-p65 fra cytoplasma til kernen (repræsenteret ved “pil”). A-D viser forberedelsesfasen og E-H betegner den post-forberedelsesfasen. (A og E) Styring, (B og F) DMH behandlet, (C og G) FO + CO (01:01) + DMH, (D og H) FO + CO (2.5:1) + DMH (forstørrelse 400X) .

Expression og Lokalisering af NF-KB-P50

Flow-cytometrisk analyse har vist, at behandling med kræftfremkaldende, blev ekspressionen af ​​NF-KB-P50 steget signifikant (p 0,001) i begge faserne sammenlignet med kontroldyr (tabel 3). Men på behandling med FO + CO (1:01) + DMH og FO + CO (2.5:1) + DMH, ekspressionen af ​​NF-KB p50 blev reduceret signifikant (p 0,001) i sammenligning med DMH-behandlede dyr i begge initiering samt post-forberedelsesfasen.

i den foreliggende undersøgelse, lokalisering af NF-KB p50 fra cytoplasmaet til cellekernen blev gjort ved dobbelt mærkning. Immunofluorescens data har vist, at behandling med DMH, beregnes% af celler med NF-KB p50

+ i kernen og cytoplasmaet blev forøget betydeligt i begge faserne sammenlignet med kontroldyr (fig 5B . 5F). Men på behandling med forskellige andele af fiskeolie og majsolie, blev lokaliseringen af ​​NF-KB p50 fra cytoplasmaet til cellekernen faldt med virkning er mere udtalt med FO + CO (2.5:1) + DMH i den post-initiering fase.

De isolerede faste colonocyter blev permeabiliseret og inkuberet med monoklonalt antistof mod NF-KB p65 og tilsvarende FITC-konjugeret sekundært antistof Snittene blev modfarvet med PI at visualisere kernelokalisering. Rød fluorescens repræsenterer kernefarvning af PI med ingen ekspression af NF-KB (vist med “stiplet pil”) og grøn fluorescens indikerer ekspressionen af ​​NF-KB p65. Gul farve angiver lokaliseringen af ​​NF-KB-p65 fra cytoplasma til kernen (repræsenteret ved “pil”). A-D viser forberedelsesfasen og E-H betegner den post-forberedelsesfasen. (A og E) Styring, (B og F) DMH behandlet, (C og G) FO + CO (01:01) + DMH, (D og H) FO + CO (2.5:1) + DMH (forstørrelse 400X) .

Effekt af fiskeolie på VEGF i både indledningen og post-indledning fase af tyktarmskræft

Angiogenese er en vigtig del af normal fosterudvikling, der kræver komplekse interaktioner mellem endothelceller og celler i det omkringliggende væv. Signalering af VEGF og deres receptorer VEGFRs spiller nøgleroller i disse interaktioner [22]. VEGF binder til disse receptorer og stimulerer endotelcelleproliferation, migration og overlevelse. Derfor vil der i den foreliggende undersøgelse blev virkningen af ​​tilskud af fiskeolie og majsolie på ekspressionen af ​​VEGF anslået. Resultaterne af immunhistokemisk farvning af VEGF til den aktuelle undersøgelse er afbildet i fig. 6. tyktarmsslimhinden kontroldyrene har afbildet en svag ekspression af VEGF i endotelcellerne. Ved behandling med DMH blev ekspressionen af ​​VEGF forhøjede i endotelcellerne i colon i begge faserne sammenlignet med kontroldyr. Stigningen i ekspressionen af ​​VEGF var mere udtalt i den post-forberedelsesfasen sammenlignet med forberedelsesfasen. Ved modtagelse af FO + CO (1:01) + DMH, var der ingen signifikant forskel i ekspressionen af ​​VEGF i forberedelsesfasen sammenlignet med DMH-behandlede dyr imidlertid behandling med FO + CO (1:01) + DMH i den post-forberedelsesfasen blev ekspressionen af ​​VEGF faldet. Ved modtagelsen FO + CO (2.5:1) + DMH blev ekspressionen af ​​VEGF faldt i både faserne sammenlignet med DMH-behandlede dyr.

Ekspressionen af ​​VEGF blev analyseret under anvendelse af immunhistokemi i formalinfikserede paraffinindlejrede sektioner af colon væv. A-D viser de repræsentative mikrofotografier af forberedelsesfasen og E-H repræsenterer den post-forberedelsesfasen (→ afbilder ekspressionen af ​​VEGF). (A og E) Styring, (B og F) DMH behandlet, (C og G) FO + CO (01:01) + DMH, (D og H) FO + CO (2.5:1) + DMH (forstørrelse 400X) .

diskussion

det er blevet påvist ved de tidligere rapporter om, at DHA og EPA, to aktive komponenter af fiskeolie, forhindre transskription af NF-KB afhængige gener og øger udtrykket af PTEN i pancreas, bryst og tyktarmskræft celler. De tidligere undersøgelser i vores laboratorium har vist, at FO + CO (2.5:1) har bedre kemoforebyggende effekt sammenlignet med FO + CO (1:01) i eksperimentelt induceret coloncancer [12]. Derfor blev den aktuelle undersøgelse udført for at forstå mekanismen af ​​kemoforebyggende virkning af disse dietary PUFA’er på de apoptotiske veje. Resultaterne af vores undersøgelse har vist, at tilsætning af fiskeolie og majsolie i kosten udøver differentieret kemoforebyggende virkning ved at forøge apoptose, der kan medieres via ændring i ekspressionen af ​​PTEN og NF-KB-signalering.

A større regulator af apoptose er PTEN pathway. PTEN modvirker PI3K aktivitet ved at konvertere PIP3 tilbage til PIP2, og dermed reducerer den cellulære pulje af PIP3 [23], [24]. Tabet af funktion af tumorsuppressorgenet PTEN, er den mest almindelige genetiske afvigelse i cancer [25].