PLoS ONE: Overekspression af fuldlængde ETV1 Udskrifter i klinisk prostatakræft grund Gene Translocation

Abstrakt

ETV1

er overudtrykt i en delmængde af kliniske prostatacancer som en fusion udskrift med mange forskellige partnere. Men

ETV1

kan også overudtrykkes som en fuld-længde udskrift. Fuld længde ETV1 protein fungerer forskelligt fra afkortet ETV1 produceret af fusion gener. I denne undersøgelse beskriver vi den genetiske baggrund af fuld længde

ETV1

overekspression og de biologiske egenskaber af forskellige fuld længde ETV1 isoformer i prostatacancer. Break-hinanden FISH viste i fem ud af seks patientprøver med overekspression af fuld længde

ETV1

en genomisk omlægning af genet, hvilket indikerer hyppig translokation. Vi var i stand til at studere omlejringer mere detaljeret i to tumorer. I den første tumor 5′-RACE på cDNA viste kobling af hele

ETV1

udskrift til den første exon af en prostata-specifikt to exon ncRNA gen, der kortlægger på kromosom 14 (

EST14

) . Dette resulterede i ekspression af begge fuld længde

ETV1

udskrifter og

EST14-ETV1

fusion udskrifter. I kromosomspredninger af en xenograft afledt fra den anden prostatakræft observerede vi en kompleks

ETV1

translokation involverer et kromosom 7 fragment, som huser

ETV1

og fragmenter af kromosomer 4 og 10. Yderligere undersøgelser afslørede overekspression af flere forskellige fuld længde transkripter, hvilket giver anledning til fire proteinisoformer med forskellige N-terminale regioner. Selv den korteste isoform syntetiseret af fuld længde

ETV1

stimuleret

in vitro

forankringsuafhængig vækst PNT2C2 prostata celler. Dette står i kontrast den manglende aktivitet på endnu kortere N-afkortet ETV1 produceret af fusion udskrifter. Vores resultater der i klinisk prostatacancer overekspression af fuld længde

ETV1

er på grund af genomiske omlejringer involverer forskellige kromosomer og identifikation af en forkortet biologisk aktiv ETV1 isoform er særdeles relevante for at forstå den mekanisme af ETV1 funktion i prostatakræft .

Henvisning: Gasi D, van der Korput HA, Douben HC, de Klein A, de Ridder CM, van Weerden WM, et al. (2011) Overekspression af fuld længde

ETV1

Udskrifter i Klinisk prostatakræft grund Gene translokation. PLoS ONE 6 (1): e16332. doi: 10,1371 /journal.pone.0016332

Redaktør: Andrew Wilber, Southern Illinois University School of Medicine, USA

Modtaget: September 5, 2010; Accepteret: December 10, 2010; Udgivet: 26 jan 2011

Copyright: © 2011 Gasi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev understøttet af en Marie Curie-tilskud (Cancure) fra den Europæiske Union. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

genfusioner er vigtige i udviklingen af ​​mange blodkræftsygdomme og sarcomer, men er sjældne i de fleste andre tumortyper [1]. Men den hyppige fusion mellem

TMPRSS2

ETS genet

ERG

viste, at gen-fusion er en yderst relevant begivenhed i prostatakræft [2], [3]. Overekspression af

TMPRSS2-ERG

fusion gen er blevet rapporteret i 40-70% af prostatakræft tilfælde [2] – [5]. Fusioner af

TMPRSS2

og tre andre gener, der koder ETS transkriptionsfaktorer,

ETV1

,

ETV4

og

ETV5

, som er placeret på forskellige kromosomer, opstår ved lave frekvenser i prostatacancer [2], [6], [7]. Men for

ETV1

mindst 10 forskellige fusionspartnere er blevet beskrevet, [8] – [10]. De fleste af disse har det til fælles, at ligesom

TMPRSS2

, de er prostataspecifikt og androgen-reguleret udtrykkes. Egenskaberne af fusionspartnere er centrale elementer i at forklare androgen-regulerede overekspression af et ETS onkogen i prostatakræft. en unik egenskab ved

ETV1

er dog, at det ikke kun kan overudtrykt i prostatacancer som en fusion udskrift, men også som en fuld-længde vildtype udskrift.

Den store familie af ETS transkriptionsfaktorer består af 27 medlemmer [11] – [13]. Alle medlemmer har til fælles en stærkt homologe DNA-bindende domæne, ETS domæne. De resterende områder af de fleste ETS proteiner fremviser begrænset strukturel homologi. ETV1, ETV4 og ETV5 er medlemmer af en lille underfamilie af strukturelt beslægtede ETS proteiner. Disse proteiner indeholder i den N-terminale region en konserveret kort surt transaktiveringsdomænet (TAD), som er fraværende i ERG. ETS-proteiner regulerer mange målgener der modulerer biologiske processer som cellevækst, angiogenese, migration, proliferation og differentiering. Men hvilke af de mange molekylære og biologiske funktioner af ETS proteiner er de vigtigste i prostatakræft er ikke kendt.

Efter

ERG, ETV1

er den hyppigst overudtrykt ETS gen i prostatacancer ( -10% af tumorerne) [10]. Den ETV1 protein oversat fra de fleste fusion udskrifter er afkortet, mangler de 131 N-terminale aminosyrer (dETV1). Ca.. halvdelen af ​​tumorer med

ETV1

overekspression udtrykke en fusion afskrift, de andre viser et højt niveau af fuld længde

ETV1

udtryk.

in vitro

biologiske og molekylære egenskaber af dETV1 synes forskellige fra de i fuld længde 477 aminosyrer protein [10]. Denne observation tyder på, at tumorer med overekspression af fuld længde ETV1 er forskellige fra tumorer, der udtrykker dETV1.

vides kun lidt om den mekanisme af fuld længde

ETV1

overekspression og dens funktion i klinisk prostatacancer . Vores nuværende resultater viser, at overekspression af fuld længde

ETV1

er korreleret med omlægning af den

ETV1

kromosomal region. Desuden har vi identificeret en roman, N-afkortet

ETV1

isoform med den samme aktivitet som i fuld længde

ETV1

.

Resultater og Diskussion

Tidligere , rapporterede vi

ETV1

overekspression i otte ud af 84 prostatakræft prøver. I fire tilfælde blev dette skyldes et gen fusion, i andre fire en fuld-længde

ETV1

udskrift blev overudtrykt [10]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi overekspression af

ETV1

ved kvantitativ revers transkriptase reaktion (QPCR) i en hidtil ukendt gruppe af 66 prostatakræft. I seks RNA

ETV1

overekspression blev opdaget. Prøver G51, G59, G233, G270 og G268 blev afledt af primære tumorer og G210 var afledt af et tilbagevendende tumor. De seks prøver blev yderligere undersøgt ved QPCR med primerpar i 5′-enden af ​​

ETV1

mRNA (exon 1F og exon 4R) og ved 3′-enden af ​​mRNA’et (exon 11F og exon 12R) (Figur 1A). En høj exon 11-12 til exon 1-4 forholdet er indikativ for et fusionsgen; en 1:01 forholdet angivne overekspression af fuld længde

ETV1

mRNA. På baggrund af disse kriterier, tumorer G51, G59, G233 og G270 udtrykte fuld længde

ETV1

mens G210 og G268 udtrykte en fusion udskrift (se også styre PC374, der udtrykker

TMPRSS2-ETV1

).

HNRPA2B1-ETV1

blev fundet som den fusion udskrift i prøve G210 (data ikke vist); fusion afskrift i G268 er ikke blevet identificeret endnu. Disse to prøver blev ikke undersøgt yderligere i denne undersøgelse.

(A) QPCR på RNA fra kliniske prøver, der viser

ETV1

overekspression. To primerpar blev anvendt til at bestemme

ETV1

udtryk:

ETV1

exon 1 fremad og exon 4 bakgear, og exon 11 frem og exon 12 omvendt hhv. Primersekvenser er angivet i supplerende tabel S1. Amplificerede produkter blev kvantificeret i forhold til ekspressionen af ​​porphobilinogendeaminase (

PBGD

) housekeeping-gen. Data, blev normaliseret til fuld længde

ETV1

overudtrykt i xenograft PC135. En høj exon 11/12 til exon 1/4 ratio viser en

ETV1

fusion begivenhed, en 1 til 1-forhold indikerer overekspression af en fuld længde

ETV1

transkript. PC374 er en kontrol xenograft, der udtrykker en

TMPRSS2-ETV1

fusion gen. Et repræsentativt eksperiment af de seks prøver, der viser

ETV1

overekspression er afbildet. (B) Interfase FISH på frisk-frosne prostata kræft vævssnit. AKB anvendte angivet nedenfor kromosom 7 regionen undersøgt. BAC RP11-124L22 (rød) spændvidder

ETV1

og RP11-1149J13 (grøn) overlapper

DGKB

(venstre panel). Positioner af gener fra toppen af ​​kromosom 7, er angivet i MBP. En delt signal, der repræsenterer en

ETV1

translokation er angivet med en pil. (C) Translokation af

ETV1

til kromosom 14 i tumor G270. Vævssnit blev hybridiseret med BAC RP11-460G19 (grøn), der overlapper

MIPOL1

og flanker

ETS14

med

ETV1

BAC RP11-124L22 (rød) (se B for detaljer). I venstre panel position

MIPOL1

BAC på kromosom 14 er angivet. I højre panel en sammenlægning signal (gul) viser co-lokalisering af

ETV1

og

MIPOL1

/

EST14

i G270, som angivet med pilen.

i de næste eksperimenter vi fokuseret på belysning af mekanismen for overekspression af fuld længde

ETV1

. For nylig er det blevet vist, at i to prostatakræft-cellelinier overudtrykker fuldlængde

ETV1

, LNCaP og MDA PCa2b,

ETV1

translokeres [8]. Vi har nu behandlet spørgsmålet om, hvorvidt i kliniske prøver translokation af det komplette

ETV1

gen kan forekomme. For at detektere genomiske rearrangementer væv lysbilleder af alle fire prostatakræft prøver med fuld-længde

ETV1

overekspression blev analyseret ved break-hinanden interfase FISH med to mærkede BAC sonder, en BAC anerkendt

ETV1

og anden den flankerende gen

DGKB

(figur 1B). Serien blev suppleret med to prøver huser fuld længde

ETV1

overekspression fra vores tidligere undersøgelse, G89 og G308 [10], som frosne væv af tilstrækkelig morfologiske kvalitet var til rådighed. Figur 1B viser resultaterne af FISH eksperimenter. Interessant, fandt vi split signaler i alle prøver med undtagelse af G59, hvilket indikerer hyppige

ETV1

omrokeringer i prostatakræft, der overudtrykker fuld længde

ETV1

. Fravær af en split-signal i G59 antyder fravær af translokation, selv om vi ikke kan udelukke et breakpoint uden den undersøgte region. Dens observeret høj frekvens indikerer genomisk omlejring som en vigtig mekanisme af fuldlængde

ETV1

overekspression i klinisk prostatacancer. Det er klart, det kromosomale region, som

ETV1

translokeres kan bidrage til opklaring af mekanismen i

ETV1

overekspression. Vi var i stand til at identificere flere detaljer om de omrokeringer i prøver G270 og G89.

Det er blevet vist i LNCaP celler,

ETV1

translokeres til 14q13.3-q21.1. Hele gen er integreret i sidste intron af

MIPOL1

. I MDA PCa2b,

ETV1

translokeres til den samme region, selv om den præcise position er ukendt [8]. Desuden har vi tidligere beskrevet indsættelse af afkortet

ETV1

i intron af en to exon gen, der koder en ncRNA, betegnet

EST14

, hvilket giver anledning til en

EST14-ETV1

fusion udskrift, der indeholder

ETV1

exon 5-12 sekvenser (prøve G342 i ref 10,. Figur 2A). Vigtigere,

EST14

kort direkte op til

MIPOL1

på 14q. Ligesom de fleste

ETV1

fusionspartnere,

EST14

er en androgen-regulerede prostata-specifikt gen. For at undersøge om det samme kromosomale region var involveret i fuld længde

ETV1

translokation i vores roman kohorte blev interfase FISH udført med

ETV1

BAC (figur 1B) i kombination med en

MIPOL1

BAC (figur 1C). En sammenlægning gul signal blev påvist i prøven G270 (figur 1C), men i ingen af ​​de andre tumorer. Disse data indikerer, at selv om der forekommer en præference for kromosom 14q13.3-21.1, vil andre genomiske regioner også bidrage til omlejring og overekspression af fuldlængde

ETV1

.

(A) Skematisk repræsentation af

ETV1

–

EST14

fusion udskrifter i prostata tumorer G270 og G342 (prøve G342 er fra ref. 10). Pile viser positionerne for primere anvendt i RT-PCR forsøg. Primersekvenser er vist i supplerende tabel S1. (B) Sekvens af smeltepunktet af

EST14

og

ETV1

i prøve G270. Placeringen af ​​fusion punkt i tumor G270 blev kortlagt af langtrækkende PCR på genomisk DNA med en fremadrettet primer i

EST14

intron og revers primer opstrøms af

ETV1

exon 1. På fusion punkt to T-rester blev tabt. Den breakpoint i

EST14

i G270 og G342 er angivet med pile.

Yderligere oplysninger om

ETV1

omlægning i G270 kom fra 5′-RACE tumor cDNA (data ikke vist). Bemærkelsesværdigt, vi ikke kun registrere som forventet i fuld længde

ETV1

afskrift men også en fusion udskrift (figur 2A). Et sådant resultat blev ikke fundet for nogen af ​​de andre tumorer overekspression fuld længde

ETV1

. Sekventering viste, at fusion transkriptet i G270 var sammensat af

ETV1

exon 1-12 foranstillet første exon af

EST14

(figur 2A). Scanning af

EST14

intron og

ETV1

flankerende region ved langtrækkende PCR og sekventering kortlagt de breakpoints i G270 ~1.9 Kbp opstrøms for

ETV1

exon 1 og -5 Kbp neden for

EST14

exon 1. breakpoint i

EST14

er kun 180 bp bortset fra breakpoint i G342 (figur 2B og ref. 10).

Yderligere information om

ETV1

omlægning blev også indsamlet til prøve G89. Tidligere havde en xenograft opformeret på mandlige nøgne mus blevet genereret fra denne tumor (PC135). Ligesom tumor G89, PC135 overudtrykt fuld længde

ETV1

[3]. Tilgængeligheden af ​​xenotransplantatet tillod fremstillingen af ​​metafase kromosomspredninger. I flerfarvet FISH blev fundet et komplekst kromosomal omlejring mønster (data ikke vist). Individuelle kromosom maling blev brugt til at validere flerfarvet FISH data. Maling af kromosom 7, indikerede tilstedeværelsen af ​​multiple kromosom 7-fragmenter (figur 3). Hybridisering med en

ETV1

BAC identificeret tilstedeværelsen af ​​tre gen-kopier: to i tilsyneladende normale kromosomer 7 og en i en kompleks markør kromosom. Opfølgende eksperimenter viste, at markøren kromosomet indeholdt fragmenter af kromosomer 4, 7 og 10, som først angivet med flerfarvet FISH (figur 3).

ETV1

BAC hybridiseret ved krydset af kromosomet 7 og kromosom 4 fragment, kraftigt tyder på, at 4, 7 translokation var medvirkende til overekspression af

ETV1

. De præcise positioner af breakpoints i 4 og 7 mangler at blive fastlagt. Vores data forudser, at flere kromosomale regioner er involveret i overekspression af fuld længde

ETV1

. Mindst én af disse regioner er på kromosom 14 og en anden en på kromosom 4. kromosom 14 region er også involveret i

ETV1

genfusion. Deep sekventering teknologi kunne være medvirkende til identifikation af andre

ETV1

rearrangements.

Maling af kromosomer 4, 7 og 10 er grønt, og

ETV1

BAC (figur 1b) er rød. Sorte pile angiver den omplantes

ETV1

. I det nederste panel den pågældende markør kromosomet er indrammet med rødt.

Detaljeret karakterisering af den fulde længde

ETV1

udskrifter i de forskellige tumorer ved 5′-RACE og sekventering viste, at ikke kun

ETV1

exon 1- exon 12 afskrifter var til stede, men også forskellige andre fuld længde

ETV1

udskrifter, som følge af alternativ promotor brug. Disse udskrifter blev betegnet som

ETV1

,

ETV1-1a

,

ETV1-1b

ETV1-1c.

4A og supplerende figur S1 show positionerne af de forskellige første exoner i genet og vise de forskellige ATG codoner. Af både

ETV1-1a

ETV1-1b

to splejsningsvarianter blev fundet (data ikke vist). QPCR eksperimenter under anvendelse af transkript-specifikke primere på RNA fra alle seks kliniske prostatacancer prøver, der overudtrykkes

ETV1

viste, at niveauet af ekspression af de forskellige transkripter var variabel i de forskellige tumorer (se figur S2).

ETV1

næppe udtrykkes i kontrol benign prostatahyperplasi prøve G277. Figur 4B viser skematisk den forudsagte sammensætningen af ​​de forskellige ETV1 proteinisoformer, vil blive fremstillet. Bemærk at ETV1-1c er langt den korteste, mangler de N-terminale 60 aminosyrer, herunder størstedelen af ​​den konserverede sure TAD. I dETV1, der udtrykkes af de fleste fusionsgener, de N-termimal 131 aminosyrer er fraværende. ETV1, ETV1-1b1 og -1b2 var af samme størrelse som vist i Western blots af lysater fra transfekterede HEK293T celler (figur 4B).

(A) Skematisk repræsentation af organiseringen af ​​

ETV1

gen. Alternative første exoner er 1a, 1, 1b og 1c. Positionerne af de fire forskellige ATG codoner er vist. Flere oplysninger findes i supplerende Figur S1. (B) Skematisk fremstilling af sammensætningen af ​​forskellige ETV1 proteiner og deres ekspression i transficerede HEK293T celler. Forskellige farver af N-terminale regioner indikerer en anden aminosyresammensætning. dETV1 er det trunkerede ETV1 protein produceret af fusionsgener. Dette protein er i stand til at inducere forankringsuafhængig vækst. I det højre panel vises en Western blot af ETV1 isoformer fremstillet ved forbigående transficerede HEK293T celler. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. (C) Soft-agar assay viser forankringsuafhængig vækst af PNT2C2 celler inficeret med lentivirus udtrykker de forskellige ETV1 isoformer eller kontrol GFP. Søjlerne repræsenterer det gennemsnitlige antal kolonier pr mikroskop inden for tre uafhængige forsøg (± SD). Repræsentative billeder af de farvede kolonier er vist nedenfor baren tallet.

Tidligere har vi vist, at ETV1 og dETV1 afveg i stimulering af

in vitro

forankringsuafhængig vækst [10] . PNT2C2 celler inficeret med alle hidtil ukendte ETV1 konstruktioner inducerede forankringsuafhængig vækst på lignende måde som ETV1 (figur 4C). Bemærkelsesværdigt, ETV1-1c, skønt udtrykt på et lavere niveau og meget mindre, er så aktive som de længere ETV1 isoformer. Således blev den fulde N-terminale TAD ikke nødvendig men aminosyrerne 61-131 synes afgørende for biologisk aktivitet af ETV1 (figur 4B, C).

Sammenfattende de fremlagte afslører to vigtige nye aspekter ved rolle ETV1 i prostatacancer. Først er det vist, at en undergruppe af ETV1 positive patienter i kliniske prostatakræft viser fuldlængde

ETV1

overekspression grund translokationer af hele genet til forskellige kromosomer. Denne roman observation supplerer velbeskrevne mekanisme af overekspression af afkortet ETV1 forårsaget af gen-fusioner, hvor udtrykket regulering bestemmes af projektlederen og forstærkere af fusionspartnere. For det andet i modsætning til dETV1 produceret af genfusioner, en kort isoform af fuld-længde ETV1, ETV1-1c, mangler det meste af det N-terminale TAD, er så aktiv som længere ETV1 isoformer, der indeholder den fuldstændige N-terminale sure TAD. Dette fund peger på forankringsuafhængig vækst til en lille region, der er fraværende i trunkeret ETV1 udtrykt af fusionsgener.

Det er yderst relevant at udvide antallet af kliniske prøver for at kunne sammenligne tumor progression i de to undergrupper af prostatakræft viser overekspression af afkortet vs. fuld længde ETV1, og at bestemme de molekylære mekanismer, der er involveret i deres forskellige biologiske adfærd.

Materialer og metoder

Etik Statement

brug af prøverne blev godkendt af Erasmus MC Medical Ethics Committee henhold til medicinsk forskning med mennesket emner lov i protokol MEC-2004-261, med titlen “brugen af ​​humant normalt og kræft resterende væv fra en vævsbank til karakterisering af DNA, RNA og protein “.

Mus blev huset i henhold til retningslinjerne fra Erasmus Medical Centre og procedurer blev udført i overensstemmelse med standarderne for anvendelse af forsøgsdyr. Dyreforsøg udført i dette manuskript er blevet godkendt af dyret eksperimenterende udvalg af Erasmus Medical Center (DEC-consult Erasmus MC projekt 102-10-01).

Vævsprøver, RNA og DNA isolation

Snap-frosne prostatakræft blev opnået ved radikal prostatektomi eller transuretral resektion. Hematoxilin /eosin (HE) farvede vævssnit blev histologisk evalueret af en patolog (G. van Leenders). Alle prøver indeholdt mindst 50% tumorceller.

RNA fra kliniske prøver blev isoleret ved hjælp af RNA-Bee (Campro Scientific, Berlin, Tyskland). DNA blev isoleret under anvendelse af DNeasy DNA Extraction kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). RNA fra cellelinier blev isoleret under anvendelse af RNeasy RNA Extraction kit (Qiagen).

Breakpoint kortlægning

Placeringen af ​​smeltepunktet i tumor 270 blev kortlagt ved langtrækkende PCR på genomisk DNA ved anvendelse en forward primer i

EST14

intron og revers primer opstrøms for

ETV1

exon 1. PCR-produkter blev separeret på en 1% agarosegel og sekventeret i et ABI 3100 genetisk analysator (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA).

Q-PCR

mRNA-ekspression blev analyseret ved QPCR. cDNA blev fremstillet med MMLV-RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og oligo (dT) 12-primer. QPCR blev udført i Power SYBR Green PCR Master Mix på en ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Forstærkede produkter blev kvantificeret i forhold til porphobilinogendeaminase (

PBGD

) ved standardkurven metoden. For primere se tabel S1.

RNA-ligase-medieret hurtig amplifikation af cDNA-ender

5′-RLM-RACE blev udført ved anvendelse af Generacer Kit af Invitrogen. cDNA blev amplificeret under anvendelse af Generacer 5′-primer og en revers gen-specifik primer (ETV1 exon 6). PCR-produkter blev analyseret på en 1,5% agarosegel, og båndene blev udskåret, renset, og sekventeret.

Fluorescens

situ

hybridisering

i

​​FISH blev udført på 5 um frosne vævssnit efter standard protokoller, med mindre modifikationer [14]. BAC-kloner RP11-124L22 (

ETV1

), RP11-460G19 (

MIPOL1

), RP11-1149J13 (

DGKB

) blev købt fra BacPac Resources (bacpac.chori. org). BAC’er blev enten digoxigenin-11-dUTP eller biotin-16-dUTP (Roche, Basel, Schweiz) mærket og visualiseret med anti-digoxigenin FITC (Roche) eller streptavidin-Alexa 594 (Invitrogen). Vævssnit blev modfarvet med DAPI. Billeder blev opsamlet på en epifluorescensmikroskop (Leica DM, Wetzlar, Tyskland) udstyret med en charge-coupled device afkølet kamera (Photometrics, Tuscon, AZ, USA).

Til forberedelse af metafase spreads, xenograft PC135 blev opformeret på mandlige nøgne mus. Enkelte celler blev opsamlet ved hakning og filtrering. Metafase forberedelse og hybridisering blev i det væsentlige som beskrevet [14]. Kromosom maling 4, 7 og 10 var fra Euro-Diagnostica (Malmö, Sverige). Metafaser blev analyseret med en Axioplan 2 Imaging mikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland) og billeder blev taget med Isis software (MetaSystems, Altiussheim, Tyskland).

Ekspressionsplasmider

cDNA’erne af de forskellige ETV1 isoformer blev PCR-amplificeret og klonet i pGEM-TEasy (Promega). Indsætter blev sekvens verificeret og klonet ind i pcDNA3-ekspressionsvektoren (Invitrogen) eller Lenti-viral vektor pWPXLd (Didier Trono, University of Geneva).

Western blot-analyse

For Western blot-analyse, HEK293T celler blev transficeret med forskellige pcDNA3-ETV1 ekspressionskonstruktioner hjælp af calciumphosphatpræcipitationsfremgangsmåden. Celler blev høstet 48 timer efter transfektion. Western blot-analyse blev udført under anvendelse af standardprocedurer med antistof rettet mod ETV1 C-terminus (Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA). p-actin blev anvendt som ladningskontrol (Sigma, St. Louis, MO, USA). Proteiner blev visualiseret ved kemiluminescens (Pierce, Rockford, IL, USA).

Lentivirale infektioner

HEK293T celler blev cotransficeret med pWPXLd-ETV1 ekspressionsvektorer, eller pWPXLd-GFP (kontrol), og pPAX2 og pMD2.G (Trono) under anvendelse af calciumphosphatpræcipitationsfremgangsmåden. Virus blev høstet fra supernatanten og anvendes til infektion af PNT2C2 celler. Pools af inficerede celler blev opformeret.

blød agar-assay

Et lag af 0,6% lavtsmeltende agarose i standard dyrkningsmedium blev fremstillet i seks-brønds plader. På toppen, et lag af 0,3% agarose indeholdende 1 x 10

4 PNT2C2 celler inficeret med forskellige ETV1 udtrykkende virus eller kontrol PNT2C2-GFP-celler blev udpladet. På dag 14 blev cellerne farvet med krystalviolet og kolonier blev talt.

Støtte oplysninger

figur S1.

Del af genomisk sekvens af

ETV1

. De forskellige exons er markeret med gult. Oversættelse startkodoner er understreget. Bemærk, at transkriptet begyndende ved exon 1a kan eventuelt indbefatte exon 1A1 men oversættelsen start er den samme som af transkriptet begyndende ved exon 1. Enden af ​​exon 1B1 er angivet med rødt.

ETV1 Salg transkripter starter ved exon 1c mangler exon 1, 2 og 3, som resulterer i en trunkeret TAD i det translaterede protein

doi:. 10,1371 /journal.pone.0016332.s001

(DOC)

Figur S2.

Angivelse af de forskellige

ETV1

udskrifter blev bestemt ved QPCR i 7900HT Hurtig Real-Time PCR-system fra Applied Biosystems bruge magt SYBR-grønne mester mix (Applied Biosystems). Ekspressionsniveauer er i forhold til husholdning gen

PBGD

.

ETV1

og

PBGD

primere er anført i supplerende tabel S1. Prøve G277 er en BPH. Det har meget lav eller ingen ekspression af alle de forskellige

ETV1

transkripter. Prøver G51, G59, G89, G233, G270 og G308 alle overudtrykker

ETV1

De forskellige udskrifter udtrykkes i variable niveauer

doi:.. 10,1371 /journal.pone.0016332.s002

(TIF )

tabel S1.

Primer sekvenser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0016332.s003

(TIF)