PLoS ONE: En Kimcellelinje Variant på kromosom 4q31.1 Associates med modtagelighed for at udvikle tyktarmskræft Metastase

Abstrakt

Vi testede for kimcellelinje varianter viser association til tyktarmskræft metastase ved hjælp af en genom-dækkende forening undersøgelse, som sammenlignede Ashkenazi jødiske individer med stadie IV metastatisk tyktarmskræft versus dem med stadium I eller II ikke-metastatisk kolon cancere. I et to-trins studiedesign, viste vi signifikant association til udvikling af metastatisk sygdom for rs60745952, at i Ashkenazi opdagelse og validering kohorter henholdsvis viste en odds ratio (OR) = 2,3 (P = 2.73E-06) og OR = 1,89 (P = 8.05E-04) (over validering tærskel på 0,0044). Signifikant association til metastatisk tyktarmskræft blev yderligere bekræftet af en meta-analyse af rs60745952 i disse datasæt plus en ekstra Ashkenazi validering kohorte (OR = 1,92; 95% CI: 1,28-2,87), og ved en permutation test, der viste en signifikant længere haplotype omkringliggende rs60745952 i fase IV-prøverne. rs60745952, der ligger i en intergeniske region på kromosom 4q31.1, og som ikke tidligere er forbundet med kræft, er således en kimlinie genetisk markør for modtagelighed for at udvikle tyktarmskræft metastaser blandt Ashkenazi jøder

Henvisning:. Markowitz SD, Nock NL, Schmit SL, Stadler ZK, Joseph V, Zhang L, et al. (2016) En Kimcellelinje Variant på kromosom 4q31.1 Associates med modtagelighed for at udvikle tyktarmskræft metastaser. PLoS ONE 11 (1): e0146435. doi: 10,1371 /journal.pone.0146435

Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: Februar 4, 2015; Accepteret: April 3, 2015; Udgivet: 11 Jan 2016

Copyright: © 2016 Markowitz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er tilgængelige fra NCBI (tiltrædelse nummer: PRJNA306392).

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health giver R01 CA144040 (SDM), P50 CA150964 (SDM), P30 CA043703, U19 CA148107 (SBG ), P30 CA014089 (SBG), K07 CA129162 (NLN), T32 ES013678 (SLS), R01 CA160356 (PS og SDM), og R01CA136726 (LL); og ved Leonard og Joan Horvitz Foundation (SDM), Richard Horvitz og Erica Hartman-Horvitz Foundation (SDM), Anton B. Burg Foundation på USC Norris, Sharon Levine Corzine Research Fund, og Robert og Kate Niehaus Klinisk Genetik initiativ på MSKCC. Dette arbejde blev støttet delvist af National Cancer Institute, National Institutes of Health under RFA # CA-09-002. Indholdet af dette manuskript ikke nødvendigvis afspejler de synspunkter eller politik National Cancer Institute eller et af de samarbejdende centre i corect konsortium, heller ikke omtale af firmanavne, kommercielle produkter, eller organisationer indebærer godkendelse af den amerikanske regering eller corect konsortium

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er den tredje mest almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA, med 136,830 nye tilfælde diagnosticeres og 50,310 dødsfald årligt [1]. Worldwide, kolorektal cancer er den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft hos mænd, og for det andet hos kvinder, med 746.000 tilfælde og 614,000 sager, henholdsvis [2].

I næsten alle tilfælde, kolorektal cancer død er forårsaget af udviklingen af cancer metastaser til fjerne organer, for det meste almindeligvis leveren [3]. I tidligere undersøgelser, har vi vist, at alle de somatiske mutationer findes i tyktarmskræft levermetastaser allerede var til stede i de matchede forgængeren tyktarmskræft primære tumorer-det er, nye genmutationer er ikke forpligtet til at indlede tyktarmskræft metastaser [4].

i denne undersøgelse undersøgte vi en alternativ genetisk model for udvikling af tyktarmskræft metastaser, en som tester, om genetiske variationer i den humane kimcellelinje kan give en individuel modtagelighed for den metastatiske spredning af tyktarmskræft. For at teste denne model, vi foretog en Genome Wide Association Study (GWAS) involverer evaluering af kimcellelinje enkelt nukleotid polymorfier (SNP) i Ashkenazi jødiske herkomst patienter med Stage IV metastatisk tyktarmskræft sammenlignet med dem med stadium I eller fase II tyktarmskræft, der gjorde ikke metastaserer. Vi valgte Ashkenazi jødiske befolkning til denne undersøgelse, fordi grundlægger alleler, som er yderst påvises ved GWAS, er allerede godt præcedens for flere andre sygdomme i denne population [5,6]. Ved hjælp af data fra vores opdagelse kohorte, vi udviklet en foreløbig effekt analyse, der gjorde det muligt at pre-angive et begrænset antal SNPs hvis eksamen i en validering kohorte vil give replikation med rimelig magt på signifikansniveau 5%. De øverste SNP’er identificeret i opdagelsen datasættet blev derefter evalueret i en anden population af kolorektal patienter af Ashkenazi jødiske herkomst (validering datasæt # 1) cancer. Baseret på resultaterne af forsknings- og validering datasæt, blev den øverste SNP af interesse yderligere evalueret i en tredje kolorektal cancer patientpopulation i Ashkenazi jødiske herkomst (validering datasæt # 2), og en kombineret analyse (metaanalyse) af denne top SNP blev afsluttet ved hjælp af resultaterne fra de tre ashkenazi jødiske datasæt. Som en yderligere supplerende test blev længden af ​​haplotype omgiver denne SNP sig at være betydeligt længere blandt de metastatiske versus ikke-metastatiske tyktarmskræft.

Resultater

Detaljerede beskrivelser af opdagelsen og validering kohorter findes i nedenstående metoder. I gennemsnit patienterne i opdagelsen studiepopulation var 71 år, som var magen til den gennemsnitlige alder af 72 og 65 i validerings- datasæt # 1 og # 2, henholdsvis (tabel 1). Opdagelsen befolkning bestod 52% mænd og 48% kvinder og kønsfordeling i validering datasæt var ens. Fordelingerne af trin IV og trin I og II-sager var også ens på tværs af de tre datasæt (tabel 1).

Som vist i tabel 2 og figur 1, bemærkede den mest signifikant sammenhæng, når man sammenligner stadie IV at iscenesætte i /II tyktarmskræft patienter i opdagelsen GWAS var for rs2024846 på kromosom 6 (OR = 2,62; 95% CI: 1,76-3,92; p = 1.2×10

-6). Det næste mest signifikant sammenhæng observeret var med to SNPs (rs72737810, rs60745952) på kromosom 4q31.1 (OR = 2,83; 95% CI: 1,81-4,44; p = 2.73×10

-6), som er adskilt af 5 kb og er i stærk koblingsuligevægt (se figur 2). Disse to SNP’er er placeret i en intergeniske region fjernt fra den nærmeste genet,

NR3C2

ved 380kb (figur 2). Selvom den statistiske signifikans for forening for disse top SNPs ikke overstiger standard genom-dækkende signifikansniveauer, en visuel undersøgelse af QQ plot af de observerede p-værdier versus den forventede fordeling tyder på, at de øverste SNPs var værd at evaluere yderligere (S1 File) , motivere os til at gå videre med en replikering undersøgelse designet til at undersøge 20 top SNPs (tabel 2), der blev forvalgt af strøm til replikation, som beskrevet i nedenstående metoder.

den lodrette akse angiver (-log

10 transformeret) observerede P-værdi og den horisontale akse angiver det kromosomale position for hver SNP. Arrow betegner stilling rs60745952 og rs72737810, der ikke er individuelt mærkbar på denne skala for præsentation.

Den vandrette akse viser SNPs langs den kromosomale regionen og den venstre lodrette akse viser (-log

10 transformeret) observerede P-værdi. SNPs nær den mest betydningsfulde SNP (rs60745952) er farvekodede for at skildre deres LD med denne SNP (afledt som parvise R2 værdier fra HapMap CEU data). rs60745952, som er vist i den lilla cirkel, er i stærk LD med rs72737820, hvilket illustreres af den røde cirkel. Anslået rekombinationshastighederne fra HapMap er plottet på den højre lodrette akse i cyan at afspejle den lokale LD struktur.

Tabel 2 viser de resultater, der i validering datasæt # 1 for de 20 SNPs foreløbigt udvalgt til test for association med stadie IV versus fase i eller II tyktarmskræft. Replication blev observeret for de to SNPs på kromosom 4q31.1, rs72737810 og rs60745952. I validering datasæt # 1, viste disse to SNPs forbindelse med udvikling af metastatisk sygdom på p = 9.12×10

-4 (OR = 1,89; 95% CI: 1,27-2,82) og p = 8.05×10

-4 (OR = 1,89; 95% CI: 1,27-2,80) (tabel 2). Styrken af ​​foreningen for disse to korrelerede SNPs begge overskredet P 0,0044, som var vores forhånd fastsat tærskel betydning for replikation (som beskrevet i metoder). På grund af den stærke LD mellem disse SNPs, vi vilkårligt udvalgte rs60745952 at vurdere i den anden validering datasæt. I de mindre, mindre højt powered validering datasæt # 2, sammenhængen mellem rs60745952 og udvikling af metastatisk sygdom var ikke statistisk signifikant, men effekten estimat var i samme retning med en øget risiko for den mindre allel (OR = 1,31; 95% CI:. 0,81-2,12) (figur 3, panel A)

som opdagelsen datasæt og begge validering datasæt alle viste en øget risiko for metastatisk sygdom i tyktarmen eller colon og rektal kræftpatienter, der bærer mindre allel af rs60745952 blev en meta-analyse udføres for at opnå det bedste estimat for den samlede effekt størrelse. Som vist i figur 3 (panel B), resuméet virkning estimat for den kombinerede analyse (meta-analyse) under en fast model virkninger var statistisk signifikant (OR = 1,93; 95% CI: 1,50-2,49; p = 5,20 x 10

-7). Da vi observerede nogle beviser for heterogenitet i testen af ​​homogenitet (Q-statistik = 5,01; df = 2; p = 0,08, Fig 3, panel A), vi også vurderet den tilfældige effekter model og fandt, at resumé effekt skøn var ens (OR = 1,92; 95% CI: 1,28, 2,87; p = 0,001); dog som forventet, konfidensintervallet var strammere for den faste model effekter.

Vi yderligere begrundede, at hvis sammenslutning af rs6074592 til risikoen for at udvikle metastatisk sygdom var drevet af bindingsuligevægt med en grundlægger metastase modtagelighed allel, og hvis denne grundlægger allel var opstået senere end Ashkenazi befolkningen som helhed, ville denne allel blive segregeret på en haplotype blok af øgede størrelse stede i metastase versus ikke-metastase associerede genomer. For at teste denne mulighed undersøgte vi LD struktur i regionen nær rs60745952 SNP hos personer med stadie IV versus trin I eller II coloncancer. Figur 4 viser afbildninger af D ‘mellem rs60745952 (blå linje) og alle andre SNPs i regionen. Den gruppering af SNPs med D ‘= 1 til rs60745952 definerer en haplotype der er klart længere hos personer med stadie IV i forhold til fase I /II tyktarmskræft i både opdagelsen og validering # 1 datasæt (røde cirkler i figur 4 angiver SNPs i almindelig i både opdagelse og validering # 1 datasæt). Mere specifikt observerede vi, at antallet af SNP’er med D ‘= 1 i trin IV (58, permutation varians = 11,71) var signifikant større end observeret i fase I /II (41, permutation varians = 7,60) i opdagelsen datasæt ( p = 2,73 × 10-5) (tabel 3; S4 File). Resultater i valideringen # 1 datasæt var ens, kun lidt mindre signifikant (p = 5,00 × 10-5).

Lodret akse er LD som D ‘for rs60745952 SNP (blå linje) og andre SNPs op og nedstrøms for denne placering tilgængelig på genotypebestemmelse arrays. Røde prikker indikerer SNPs, der var på genotypebestemmelse arrays i både Discovery Dataset og validering datasæt # 1.

Derudover undersøgte vi mulighederne association mellem rs6074592 og trin IV versus Stage I /II tyktarmskræft i en kaukasisk population af patienter coloncancer fra Kentucky og fandt, at foreningen ikke var statistisk signifikant (OR = 0,89; 95% CI: 0,55-1,46; p = 0,65), hvilket tyder på associationen mellem rs6074592 og metastatisk tyktarmskræft er specifik for patienter med Ashkenazi jødiske afstamning.

Discussion

Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at rapportere genetiske sammenslutninger af human kimlinje varianter med risiko for at udvikle tyktarmskræft metastase, specifikt i denne undersøgelse observere, at blandt ashkenazi jødiske personer med tyktarmskræft, blev transporten af ​​den mindre allel for rs60745952 signifikant associeret med udviklingen stadie IV sygdom, med fjerne orgel metastaser, versus lokaliseret stadium i eller II sygdom, med en OR på næsten 2. mindre allel for rs60745952 bæres af 31% af den almindelige Ashkenazi befolkning, og med op til ca. 50% af Ashkenazi personer med stadie IV tyktarmskræft, og derfor er en stor bidragyder til udviklingen af ​​tyktarmskræft metastaser i denne population. Sandsynligheden for, at der er i denne population en grundlægger metastase modtagelighed variant i stærk koblingsuligevægt (LD) med rs60745952 uafhængigt foreslået ved at observere, at i Ashkenazi personer med stadie IV tyktarmskræft, rs60745952 ligger i en LD blok, der er betydeligt længere end der observeres i individer med ikke-metastatisk stadium i eller II sygdom. Vi tror endvidere sammenslutningen af ​​rs60745952 med metastatisk sygdom er sandsynligvis specifik for Ashkenazi jødiske befolkning, da denne forening ikke blev observeret, når evalueret i den almindelige kaukasiske patientpopulation tyktarmskræft fra Kentucky. I lyset af den meget forskellige evolutionære historie Ashkenazi jødiske befolkning, de observerede forskelle er ikke overraskende.

Tidligere undersøgelser fra vores gruppe [4] påviste, at alle de somatiske mutationer påvist i tyktarmskræft metastaser var allerede til stede i deres forhenværende primære kolon kræft tumorer. tyktarmskræft metastaser har således ikke kræver køb af nye “metastaser driver” mutationer. I denne undersøgelse præsenterer vi beviser for, at en genetisk element af metastase progression kan kodes i værtsgenomet. Mens spekulative, mulige værten kodet relevante faktorer den metastatiske proces vil omfatte elementer af immun-overvågning, elementer af vaskulær permeabilitet og /eller angiogenese og tænkes elementer i signalering kaskader, der kunne bestemme cellulære reaktioner på aktiverede onkogener eller inaktivering af tumorsuppressorgener. Svarende til resultaterne af mange GWAS studier, rs60745952 ligger i en intergeniske region, og vi har ikke direkte beviser for funktionelle forskelle forbundet med transport af dette SNP. Fremtidige undersøgelser af dette spørgsmål vil skulle udføres i biologiske prøver opnået specifikt fra Ashkenazi befolkning.

Resultaterne rapporteret her ville sandsynligvis ikke være kommet for dagens lys bortset fra vores ansætte en magt guidet design til replikering, der er aktiveret os til at bevare tilstrækkelig magt til at demonstrere betydningen af ​​foreningen selv i en beskeden størrelse replikering kohorte. Denne tilgang vil sandsynligvis være af værdi for andre forskere, der forsøger at genetisk berige for en forening signal ved at studere udvalgte, men mindre befolkninger, end dem, der typisk har været ansat GWASs. Test for forskelle i LD struktur i overensstemmelse med grundlægger sygdom varianter kan også være af værdi for GWASs i disse mindre, men yderst udvalgte befolkningsgrupper.

Materialer og metoder

Undersøgelse Deltagerne

oversigt.

Colon kræftpatienter fra fire forskellige datasæt blev anvendt i denne vurdering. Alle patienter blev konstateret under forskningsprotokoller godkendt af Institutional Review Boards for de tilsvarende institutioner (Carmel Medical Center (Haifa), University of Southern California, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center og University Hospitals Case Medical Center), som beskrevet nedenfor. Alle patienter forudsat informeret skriftligt samtykke. Alle godkendelsesprocedurer blev godkendt af de tilsvarende ovennævnte Institutional Review Boards.

Discovery datasæt.

Deltagerne blev trukket fra molekylær epidemiologi af kolorektal cancer studie (MECC), som er et populationsbaseret tilfælde -styring undersøgelse af hændelsen kolon og rektal kræfttilfælde, der tidligere er blevet beskrevet [7]. Kort fortalt har patienter fra det nordlige Israel blevet ansat i MECC siden 1998. Som en del af MECC undersøgelsen blev opnået grundlæggende demografiske og kliniske oplysninger samt blodprøver. Sager udvalgt til genotypning havde histologisk bekræftet, mikrosatellit stabil tyktarmskræft. Konkret undersøgelsespopulationen anvendes i opdagelsen datasæt for denne evaluering bestod af 89 personer med stadie IV tyktarmskræft med fjerne orgel metastaser, alle involverer leveren, og 234 personer med stadium I eller fase II tyktarmskræft, der blev orgel begrænset og uden metastatisk sprede. Disse personer blev yderligere bekræftet, da resterende metastase-fri under klinisk opfølgning på mindst 3 års varighed. Kontrol i MECC opdagelse datasæt undersøgelse bestod af individer uden forudgående historie tyktarmen eller endetarmskræft og blev individuelt tilpasset sager baseret på alder, køn, og primær klinik site. 139 kontroller blev genotypebestemt og anvendes til at kvantificere den mindre allel frekvens for top SNPs. Alle patienter havde selvrapporteret Ashkenazi jødiske afstamning.

Validering datasæt # 1.

Den første validering datasæt stammer fra en anden uafhængig stikprøve af de MECC undersøgelsens deltagere, der blev valgt med mindre restriktive kriterier end i opdagelsen datasæt. Konkret validering datasæt # 1 omfattede yderligere personer med enten colon eller rektal cancer, trin I og II-sager, for hvem postoperativ opfølgning ikke var til rådighed, og enkeltpersoner, hvis kræft ikke var blevet testet for mikrosatellit ustabilitet. Desuden denne prøve omfattede personer med selvrapporteret sefardiske samt Ashkenazi jødiske afstamning. Valideringen datasæt i denne evaluering omfattede 89 stadie IV kolorektal kræfttilfælde og 373 fase I og fase II kolorektal kræfttilfælde. Kontroller i valideringen datasæt # 1 studie bestod af yderligere patienter uden forudgående historie tyktarmen eller endetarmskræft og blev individuelt tilpasset til tilfælde baseret på alder, køn, jødiske etnicitet og primær klinik site.

Validering Datasæt # 2.

Patienter i den anden validering datasæt blev behandlet på Memorial Sloan-Kettering cancer center (MSKCC) og havde histologisk bekræftet kolorektal cancer. Patienterne blev konstateret under to MSKCC kliniske protokoller mellem 2000 og 2010. Denne undersøgelse befolkning var også mindre restriktiv end opdagelsen datasæt i at validering datasæt # 2 omfattede personer med enten tyktarmen eller endetarmskræft og enkeltpersoner, hvis kræft ikke var blevet testet for mikrosatellit ustabilitet. Denne validering datasæt bestod af 86 personer med stadie IV tyktarmskræft med fjerne orgel metastaser, alle involverer leveren, og 256 personer med stadium I eller fase II colon eller rektal kræft, der var organ begrænset og uden metastatisk spredning. Personer med disse tidlige stadie kræft blev yderligere bekræftet, da resterende metastaser gratis i klinisk opfølgning på mindst 3 års varighed. Alle patienter havde selvrapporteret Ashkenazi jødiske afstamning.

Kentucky Kaukasisk datasæt.

Detaljerne i Kentucky studiepopulation er blevet beskrevet andetsteds [8]. Kort fortalt datasættet anvendt i denne evaluering bestod af 77 patienter med Stage IV tyktarmskræft og 398 patienter med stadium I /II tyktarmskræft. Alle patienter i denne prøve var kaukasisk.

DNA isolation, genotypning, og kvalitetskontrol

Discovery datasæt.

DNA fra hele blodlymfocytter blev ekstraheret ved hjælp af QIAamp DNA Blood Mini (Qiagen, Hilden, Tyskland) og blev opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse til genotypebestemmelse. Alle DNA-prøver undergik hele genomet forstærkning ved hjælp af ILLUSTRERET Genomiphi V2 DNA Amplification Kit (GE Healthcare, Waukesha, Wisconsin, katalog nr 25.660.032). Prøverne blev opbevaret ved -20 ° C. Salg

Prøver blev genotypebestemt på Illumina Omni 2,5-8 platform. Data blev rengøres med kvalitetskontrol anbefalet af emerge Genomics arbejdsgruppen [9]. QC procedurer omfatter evaluering af prøve og markør takst, køn misforholdet (Plink [10] “-Check-sex”), dubletter, Hardy-Weinberg ligevægt, prøve slægtskab (Plink [10] “-genome”), og populationsstratificering. I alt 1,491,783 SNPs blev inkluderet i analysen, efter at udelukke SNPs, der havde mindre allelfrekvenserne 0,01, manglende data i mere end 2% af prøverne, eller Illumina GenTrain scorer mindre end 0,6. I alt fem fase IV patienter, og syv trin I og II patienter, blev fjernet fra analyserne for at have takster mindre end 98%, for ikke køn check eller for at være en utilsigtet to eksemplarer (se S1 fil for yderligere detaljer). For at kontrollere for befolkningen lagdeling, blev de første to hovedkomponenter (pc’er) stammer fra multidimensional nedbrydning analyse ved hjælp af ‘cmdscale’ funktion i R.

Validering datasæt # 1.

Kolorektal Transdisciplinary ( corect) Undersøgelse foretaget af genotypning til validering datasæt # 1. Genotypebestemmelse blev udført ved hjælp af en brugerdefineret Affymetrix genom-dækkende platform (den Axiom® corect sæt) med cirka 1,3 millioner SNPs og indels; blev dog kun data fra SNPs identificeret som Top SNPs i opdagelsen datasæt udvindes ved corect for denne analyse (se Statistiske Analyser). Data blev rengøres med kvalitetskontrol procedurer svarende til opdagelsen datasættet (se S2 fil for detaljer) [9].

Validering datasæt # 2.

DNA blev isoleret fra enten hele blodlymfocytter eller fra formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) normal colonvæv hjælp Qiagen QIAamp DNA-ekstraktion kit eller QIAamp DNA Blood Mini kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og blev opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse til genotypebestemmelse. Alle DNA-prøver undergik hele genomet amplifikation under anvendelse af Repli-g DNA Amplification Kit (Qiagen, CA). For en delmængde af prøver, både FFPE og blod afledte DNA var tilgængelige og blev brugt til at teste konkordans af genotyper for kvalitetssikring. Genotypning for rs60745952 blev udført ved hjælp Sequenom IPLEX analyser og analyseret ved hjælp MassARRAY [11]. Genotyper blev kaldt hjælp Typer 4.0.2 software.

Kentucky Kaukasisk datasæt.

DNA blev isoleret fra alle fag og ABI TaqMan kemi blev ansat til at genotype rs60745952. Dette krævede custom design af prober og primere af ABI. PCR [40 Cykler] blev udført på en ABI GeneAmp PCR System 9700 Dual hoved instrument og endepunkt læser blev udført ved hjælp af ABI 7900 Sequence Detection System.

Statistiske Analyser

Logistisk regression blev udført for at evaluere den potentielle sammenhæng mellem hver SNP og trin IV versus fase i og II tyktarmskræft under en log-additiv genetisk model. Selvom indledende analyser brugte Plink [10], den endelige analyse for rs60745952 i de tre studier datasæt brugte SAS v9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC) for passende inddragelse af kovariater forudsat kun uafhængighed individer, ikke af alleler [12 ] som gennemført i Plink [10]. Alle regressions analyser blev justeret for alder og køn og, i tilfælde af opdagelsen og validering datasæt # 1, som var GWAS, de første 2 hovedkomponenter. Endvidere i disse to datasæt vi undersøgt, om rs60745952 blev udført på en længere haplotype i trin IV patienter end i trin I /II patienter. Efter at have identificeret den relevante kromosomale område i sættet opdagelse data ved hjælp af LD mønster genereres i Haploview [13] (S3 File), vi beregnet D ‘mellem hver SNP i blokken og rs60745952 og talte antallet af SNP’er for hvilke D’ = 1. Vi udførte derefter permutation test for at teste, om antallet af SNP’er med D ‘= 1 var signifikant større i den fase IV i forhold til scenen i /II patienter (S4 File).

design for replikation Studies

Statistisk modellering foreslået, at en replikation kohorte af tyktarmskræft tilfælde af lignende størrelse til opdagelsen kohorten ville give omkring 80% magt til at teste op til 9 af vores mest betydningsfulde kandidat SNPs (øverst SNPs) ved en Bonferroni korrigeret signifikansniveau på 0,04 /9 (= 0,0044), plus 8 yderligere SNPs på en Bonferroni korrigeret signifikansniveau på 0,01 /8; således den samlede type 1 fejl blev reguleret til at være 0,05 (et lignende design blev anvendt til at teste fase III versus fase I /II kolon kræftpatienter, men kun sammenligningen med trin IV patienter er rapporteret her). Strøm til replikation blev beregnet for hver enkelt SNP baseret på 50% lavere konfidensgrænse for den tilsvarende odds ratio [14] og prævalensen af ​​SNP (se S5 File). Tre af de øverste 9 SNPs var ledsaget af en ledsager SNP, som viste fuldstændig bindingsuligevægt i vores opdagelse kohorte (D ‘= 1,0), og disse 3 companion SNPs blev tilsat til vores sæt top SNP’er, der skal testes for replikation, uden statistisk justering, for i alt 20 SNPs forhånd fastsat til analyse i valideringen kohorte. Forud for valideringen undersøgelsen blev denne analyse design og identiteten af ​​de 20 præ-specificerede SNPs deponeret hos NCI programmedarbejder tilsyn med undersøgelsen at optage dokumentation af undersøgelsens design. Yderligere SNPs, der var til stede på validering datasæt # 1 genotype-array blev ikke anset for i denne undersøgelse evaluering.

Kombineret Data Analysis (meta-analyse)

De foreningens resultater for rs60745952 SNP i tre studier datasæt med Ashkenazi jødiske herkomst (Discovery datasæt, Validering datasæt # 1, Validering datasæt # 2) blev kombineret ved hjælp af en meta-analyse med den inverse stikprøvestørrelse-vægtet tilgang implementeret i METAL [15]. Vi evaluerede homogenitet mellem foreningen resultater ved hjælp af Q-test og beregnet estimatet resumé effekt ved hjælp af en tilfældig effekt model [15]. Vi beregnede estimat resumé effekt ved hjælp af både faste og tilfældige effekt modeller, da p-værdien for testen af ​​homogenitet var marginalt signifikant (tabel 3; p 0,10), hvilket tyder på en vis heterogenitet kan være til stede og variansen mellem undersøgelser skal være indarbejdet i analyserne for at opnå konfidensgrænser.

Støtte Information

S1 fil. Genotypning QA /QC detaljer for Discovery datasæt

doi:. 10,1371 /journal.pone.0146435.s001

(PDF)

S2 fil. Genotypebestemmelse QA /QC detaljer for Validering datasæt # 1

doi:. 10,1371 /journal.pone.0146435.s002

(PDF)

S3 fil. LD Plots

doi:. 10,1371 /journal.pone.0146435.s003

(PDF)

S4 fil. LD Evaluering gennem Permutation i Discovery og Validering # 1 Datasæt

doi:. 10,1371 /journal.pone.0146435.s004

(PDF)

S5 fil. Valg af SNPs for Validering

doi:. 10,1371 /journal.pone.0146435.s005

(PDF)

Tak

Indholdet af dette manuskript afspejler ikke nødvendigvis de synspunkter eller politik National Cancer Institute eller et af de samarbejdende centre i corect konsortium, ej heller omtale af firmanavne, kommercielle produkter eller organisationer indebærer godkendelse af den amerikanske regering eller corect konsortium.