PLoS ONE: Målretning og cytotoksicitet SAPC-DOPS Nanovesicles i pancreas Cancer

Abstrakt

Kun et lille antal lovende lægemidler rettet mod kræft i bugspytkirtlen, som er den fjerde hyppigste årsag til kræftdødsfald med en 5-års overlevelse på mindre end 5%. Vores mål er at udvikle en ny bioterapeutiske middel, hvor en lysosomale protein (saposin C, SAPC) og en phospholipid (dioleoylphosphatidylserin, DOPS) er samlet i nanovesicles (SAPC-DOPS) til behandling af kræft i bugspytkirtlen. Et særkende ved SAPC-DOPS nanovesicles er deres høje affinitet for phosphatidylserin (PS) rige mikrodomæner, der er unormalt eksponeret på membranoverfladen af ​​humane pancreatiske tumorceller. For at evaluere rollen af ​​ekstern celle PS,

in vitro Salg assays blev anvendt til at korrelere PS eksponering og den cytotoksiske virkning af SAPC-DOPS i human tumor og ikke-tumorigen pancreasceller. Dernæst blev pancreas tumorxenoplantater (ortotopisk og subkutane modeller) bruges til tumor målretning og terapeutiske effekt studier med systemisk SAPC-DOPS behandling. Vi observerede, at nanovesicles selektivt dræbte humane bugspytkirtelkræftceller

in vitro

ved at inducere apoptotisk død, mens ikke-transformerede celler forblev upåvirket. Denne

in vitro

cytotoksisk virkning korreleret til eksponeringsniveauet overflade PS på tumorcellerne. Ved hjælp af xenotransplantater, dyr behandlet med SAPC-DOPS viste klare overlevelse fordele og deres tumorer skrumpede eller forsvandt. Desuden bruger en dobbelt-sporing metode i levende mus, viste vi, at nanovesicles specifikt var rettet til orthotopisk-implanterede, bioluminescerende pancreas tumorer. Disse data antyder, at den sure phospholipid PS er en biomarkør for kræft i bugspytkirtlen, der effektivt kan målrettes til terapi under anvendelse af cancer-selektive SAPC-DOPS nanovesicles. Denne undersøgelse giver overbevisende dokumentation til støtte for udviklingen af ​​en ny terapeutisk tilgang til kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Chu Z, Abu-Baker S, Palascak MB, Ahmad SA, Franco RS, Qi X (2013) Målretning og cytotoksicitet af SAPC-DOPS Nanovesicles i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 8 (10): e75507. doi: 10,1371 /journal.pone.0075507

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: May 1, 2013; Accepteret: 14. august 2013; Udgivet: 4 okt 2013

Copyright: © 2013 Chu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af NIH /NCI Tilskud Number 1R01CA158372-01 (til Qi), 1R43CA117283-01 (til Qi og Xu), og New Drug stat Key Project Grant Number 009ZX09102-205 (til Qi). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret følgende interesser: Xiaoyang Qi i opført som opfinder på patent på teknologi (SAPC-DOPS), der er emnet for denne forskning. I overensstemmelse med gældende Cincinnati Børnehospital Medical Center politikker, udvikling og kommercialisering af denne teknologi er blevet licenseret til Bexion Pharmaceuticals, LLC, hvor Dr. Qi har en mindreårig ( 5%) ejerandel. Dr. Qi er en opfinder af videnskabelig forskning, der er i den prækliniske fase for Bexion Pharmaceuticals. På dette tidspunkt, er Bexion Pharmaceuticals tilbyder ikke omsættelige behandlinger eller narkotika. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræftdødsfald, med en 5-års overlevelse på mindre end 5% [1], [2], [3]. Det er normalt asymptomatisk i de tidlige stadier, mens ofte invaderer regionale lymfeknuder og lever, og mindre ofte lunger og indre organer. Aktuelle multimodale strategier, herunder kirurgi, kemoterapi og strålebehandling, har undladt at forbedre langsigtede overlevelse. Den nuværende standard for behandling, nukleosidanalogen gemcitabin [4], forlænger overlevelsen ved kun flere måneder. Trods udtømmende bestræbelser på at kortlægge de genetiske ændringer, der er forbundet med bugspytkirtlen kræft vækst, er der rapporteret få lovende lægemiddelkandidater, og der er et presserende behov for nye, effektive behandlinger. Eksperimentelle terapeutiske strategier omfatter små og store molekyler hæmmere af onkogene veje, antiangiogene midler, vaccination /immunterapi, genterapi, og mange andre, men ingen klart overlegne terapier er dukket op.

I de sidste to årtier, cellulære membraner er blevet mål for anti-cancer medicin. Flere linjer af beviser har antydet en sammenhæng mellem cellulære membran abnormiteter og ceramid-medieret induktion af apoptose i tumorer [5], [6], [7], [8], [9]. Baseret på disse observationer, har midler, som interfererer med cellulære membraner er udviklet til at modulere membran organisation, fluiditet, metabolisme og signaltransduktion [10], [11], [12]. Der vides imidlertid af de underliggende signalveje påvirket af membran-målrettet antineoplastiske lægemidler.

Vi har arbejdet på at udvikle en ny bioterapeutiske lægemiddel, der selektivt kan målrette cellemembranen af ​​pancreas tumorer og effektivt ødelægge maligne pancreasceller uden at skade normale væv og celler. Dette middel er sammensat af to oprensede naturlige cellulære komponenter – en lille naturligt protein (saposin C, SAPC) og en naturlig lipid (dioleoylphosphatidylserin, DOPS) – som vi samles til cancer-selektive nanovesicles (SAPC-DOPS). SAPC er en lille ikke-enzymatisk glycoprotein stede i alle normale væv, der fungerer som en biologisk aktivator af lysosomale enzymer [13]. Den funktionelle organisation SAPC indeholder en membran fusogent domæne og en region for aktivering af lysosomale enzymer [14], [15].

N

-bundet glykosylering er ikke afgørende for SAPC aktivitet [16], [17]. SAPC øger nedbrydning af glucosylceramid, sphingomyelin, og galactosylceramid til ceramid via syre β-glucosidase, sur sphingomyelinase, og syre β-galacotsylceramidase henholdsvis [13], [18], [19]. Hos patienter med lysosomale opbevaring sygdomme, SAPC akkumuleres sammen med glycosphingolipider i makrofager [20], og det viser sig, at overdreven SAPC og lipider kan være giftige for disse celler.

En generel egenskab ved saposiner er deres lipid membran bindende aktivitet [ ,,,0],21], da de spiller en vigtig rolle i lipid transport [22], lipid microdomain samling [23], og reorganisering af biologiske membraner [24], [25], [26]. SAPC fortrinsvis interagerer med umættede, negativt ladede phospholipider (såsom DOPS), ved sur pH [15], [21]. Denne interaktion er nødvendig for SAPC aktivering af lysosomale enzymer.

Vi antager, at fordi phosphatidylserin (PS) er relativt rigelige på overfladen af ​​kræftceller og væv [27], [28], ville det give en tumor- specifikke mål for SAPC. I sammenligning med ikke-transformerede celler, neoplastiske celler er hypermetabolisk og dermed producere signifikante mængder af syre og carbondioxid (CO

2) som biprodukter fra anaerob glykolyse og aerob respiration, hhv. Hydrogenioner akkumulerer i tumorvæv og som et resultat, den gennemsnitlige ekstracellulære pH i faste tumorer er lavere (pH ~ 6) end i normalt væv (pH ~ 7) [29], [30]. Kræftceller også vise andre unikke egenskaber, såsom generaliserede membran ændringer [31], [32], [33] og “utæthed” af lysosomale enzymer [31]. Interessant nok er der flere lysosomale hydrolaser forhøjet i tumorvæv [34], [35]. Derfor er en unik sur mikromiljø med ekstracellulær lækage af lysosomale enzymer gør tumorvæv en optimal mål for SAPC [9].

I en tidligere undersøgelse fandt vi, at SAPC-DOPS induceret apoptose i multiple cancer celletyper, herunder neuroblastom, ondartet perifer nerve sheath tumor, og brystcancerceller, samtidig skåne normale celler og væv [36]. Mekanismen for SAPC-DOPS induktion af apoptose blev bestemt til at være, delvis gennem forhøjelse af intracellulære ceramider, efterfulgt af caspaseaktivering. Vi undersøgte også antitumor effekt og systemisk biodistribution af SAPC-DOPS nanovesicles i prækliniske kræftmodeller [9], [36], [37]. Vi fandt, at SAPC-DOPS signifikant nanovesicles målrettet og hæmmede væksten af ​​prækliniske xenografter af neuroblastom, ondartet perifer nerve sheath tumor, og hudkræft og viste ingen toksiske virkninger i nontumor væv [9], [36], [37].

i den aktuelle undersøgelse, vi vurderet den anti-cancer nytte af SAPC-DOPS, og dens

in vitro

in vivo

kræft-målretning og antineoplastisk aktivitet mod human bugspytkirtelkræftceller og pancreas tumorxenoplantater.

Materialer og metoder

cellekulturer

Humane pancreas cellelinier (MiaPaCa-2, Panc-1, BxPC-3, Capan- 1, AsPC-1, HPAF-II, Hs766T) fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA) blev dyrket med Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 enheder penicillin /ml, og 10 mg streptomycin /ml. Human pancreas ductal epitel (HDPE) blev venligst leveret af A. Lowy (Moores UCSD Cancer Center, La Jolla, CA) og dyrket som beskrevet i litteraturen [38]. Humant pancreas cfPac1-Luc3 cellelinje blev venligst stillet til rådighed af O. Wildner (Ruhr-University Bochum, Bochum, Tyskland) [39]. Alle celler blev dyrket ved 37 ° C i 5% CO

2. Ingen krydskontaminering blev fundet i disse celler.

Udarbejdelse af proteiner og Nanovesicles

SAPC blev produceret som beskrevet tidligere [17] med modifikationer. Kort fortalt blev rekombinante saposiner udtrykt ved brug af pET-systemet i

E. Coli

celler. Udtrykte proteiner blev oprenset på en nikkel-søjle og fuldstændigt afsaltet med C4 omvendt fase højtydende væskekromatografi (HPLC). Efter lyofilisering blev saposin pulver, der anvendes, og dets koncentration blev bestemt ved dets vægt. Alle phospholipider blev købt fra Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Badsonikering blev anvendt til dannelse af SAPC-DOPS nanovesicles som tidligere beskrevet med mindre modifikationer [40]. Efter fjernelse af opløsningsmiddel under nitrogengas, blev phospholipider blandet med rene saposin proteiner i 20 pi syre (pH 5) og hurtigt fortyndet i 50X volumen af ​​fysiologisk vandig opløsning. Proteinet-lipidblanding blev derefter forsigtigt lydbehandlet og de to komponenter let samles til nanovesicles. De sonikerede nanovesicles kan anvendes efter lagring ved 4 ° C i mindst en uge. For langtidsopbevaring blev stabile frysetørrede SAPC-DOPS prøver parat med en vand-organisk cosolvent system. Efter fjernelse af opløsningsmidlet, tørret DOPS blev opløst i 80% tert-butylalkohol. SAPC og sucrose (10 mg /ml) opløsning blev fremstillet i vand. DOPS og SAPC /saccharose (vol: vol = 1:0.6) blanding blev lyofiliseret til et pulver kage i en frysetørrer (VirTis Unitop, The VIRTIS Co., Gardiner, NY). Til dyr injektion blev kagen rehydreret i phosphatpufret saltvand (PBS) til dannelse af SAPC-DOPS nanovesicles. Disse nanovesicles viste den samme tumor-målretning og cytotoksicitet

in vitro

in vivo

.

SAPC-DOPS nanovesicles blev karakteriseret og overvåges af en N4 plus partikelstørrelsen analysator som tidligere beskrevet [9], [36]. Stabile SAPC-DOPS nanovesicles har en gennemsnitlig diameter på ca. 200 nm med en gennemsnitlig zetapotentiale på -42. SAPC binder lipidmolekylerne og spontant inkorporerer i lipiddobbeltlaget af liposomerne upon lydbehandling. Efter lydbehandling og ultracentrifugering til pelletering SAPC-DOPS koblede liposomer, blev der ikke SAPC detekteret i supernatantfraktionen, implicerer en meget høj belastning /koblingseffektivitet [9]. Dry SAPC blev opløst i PBS-opløsning til SAPC behandling uden DOPS. DOPS uden SAPC blev fremstillet under anvendelse af samme procedure forberedelse til SAPC-DOPS nanovesicles.

Live-Imaging

Fluorescerende mærkning af SAPC-DOPS nanovesicles.

I nogle dele af eksperimentet blev SAPC-DOPS nanovesicles fluorescensmærket med en stabil og høj intensitet farvestof, CellVue® Maroon (CVM, Molecular Targeting Technology Inc., Exton, PA – Excitation max = 647 nm; Emission max = 677 nm [9], [36 ]). CVM har vist anvendelighed til billeddannelse subkutane tumorer, samt skjult, orthotopisk implanteret, og metastatiske tumorer. Den skæbne af farvestoffet kunne følges i de levende mus ved hjælp af en hel-dyr imaging enhed [IVIS-200X (Cy5.5-filter), Xenogen]. For alle billeddannelse blev musene forsigtigt bedøvet med isofluran og anbragt på en varm platform i den billeddannende enhed.

En alikvot af CVM i ethanol blev blandet med phospholipid opløsningsmiddel til badsonikering fremstilling ved den ovenfor beskrevne procedure. CVM mærket SAPC-DOPS nanovesicles blev separeret fra frit CVM fluorofor anvendelse af en Sephadex ™ G25 kolonne (PD-10, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Bioluminescens af pancreas tumorceller.

For at spore tumorceller, blev luciferase udtrykker cfPac1-Luc3 humane pancreas tumorceller brugt. Efter injektion af luciferin blev den samme levende imaging enhed (IVIS-200X, Xenogen), der anvendes til visualisering og lokalisering af bioluminescens.

In vitro

Studies

Effekt af SAPC-DOPS nanovesicles på tumorceller.

Tre udbredte pancreasadenocarcinom cellelinjer (MiaPaCa-2, PANC-1, og BxPC-3) og ikke-transformerede celler (HDPE) blev podet (10

4 /100 pl /brønd) i 96-brønds fladbundede vævskulturplader (Falcon, Becton Dickson Labware, Franklin Lakes, NJ) og dyrkes i deres respektive vækstmedium i 24 timer, hvorefter SAPC-DOPS (0,14 mg) eller PBS køretøj blev tilsat til dyrkningsmediet. For at vurdere cellernes levedygtighed, en standard 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) -dye assay (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blev udført som tidligere beskrevet [9], [36] tre dage efter påbegyndelse af behandling. Mikroskopisk evaluering af tumorceller og Æske med HDPE celler blev udført.

For at vurdere ved apoptose, MiaPaCa-2 bugspytkirtelkræftceller blev behandlet med SAPC-DOPS, PBS, eller DNAase (positiv kontrol), og efterfølgende evalueret med terminale deoxynukleotidyltransferase-medieret dUTP nick-endemærkning (TUNEL) assay under anvendelse af in situ Celledød Detection Kit, POD (Roche Applied Science, Tyskland) som beskrevet i producentens protokol.

for at bekræfte, at det var den samles SAPC-DOPS nanovesicles der forårsagede celledød MiaPaCa-2 bugspytkirtelkræftceller og HDPE blev behandlet med enten SAPC-DOPS, SAPC alene eller DOPS alene. Cellernes levedygtighed blev vurderet med en MTT-farvestof analysen.

For at bestemme om SAPC-DOPS-induceret apoptose blev medieret af caspase aktivering, proteiner fra nanovesicles-behandlet MiaPaCa-2-celler blev analyseret ved Western blotting. Cellerne blev behandlet i 48 timer med SAPC-DOPS, DOPS, PBS, eller staurosporin (positiv kontrol) og derefter lyseret til proteinanalyse ved immunoblotting under anvendelse NuPAGE Novex Bis-Tris-geler (4-12%), og elektroforese procedure pr fabrikanten (Invitrogen, Carlsbad, CA). Protein blev overført under anvendelse af en halvtør blotting enhed (FB-SDB-2020 Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) til Hybond-ECL nitrocellulosemembran (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Anti-human caspase-9 og anti-actin-antistoffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) blev anvendt til påvisning af aktive caspaser og actin (kontrol) henholdsvis.

Disse forsøg blev udført i fire eksemplarer og data var analyseret ved variansanalyse (ANOVA). T-test analyse eller to-ANOVA Tukey testen blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans for eksperimenter med to eller mere end to grupper, henholdsvis. Analyser blev udført med SPSS 12.0.

Sammenhæng mellem dræbende effekt af SAPC-DOPS og PS eksponering på bugspytkirtlen celleoverfladen.

En flowcytometrisk analyse med FITC-mærket Annexin V blev udført på 8 cellelinjer (Hs766T, AsPC-1, cfPac1-Luc3, Capan-1, BxPC-3, MiaPaCa-2, HPAF-II, og PANC-1) for at bestemme niveauet af PS eksponering på celleoverfladen. Cellelinierne blev derefter adskilt i to grupper: “High-PS” gruppe indeholdt de, der havde en gennemsnitlig fluorescens (MF) i løbet af 50 (arbitrære enheder) og “Low-PS” gruppe indeholdt dem med en MF under 50. cellerne blev behandlet med SAPC-DOPS nanovesicles og procentdelen af ​​celledød blev bestemt ved MTT-assayet. MTT blev udført i fire eksemplarer og data blev analyseret ved ANOVA. De viste data er det aritmetiske gennemsnit ± SEM.

In vivo

Studies

Etik opgørelse af anvendelsen af ​​dyr.

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Cincinnati (IACUC protokol nummer: 11-05-05-02) og Cincinnati Børnehospital Medical center (IACUC protokol nummer: 1E03031). Dyrene blev bedøvet med isofluran eller pentobarbital til tilbageholdenhed før injektioner af tumorceller for at minimere smerte og lidelse. Anæstesidybden blev overvåget ved at kontrollere smerte respons (tåen eller hale knivspids), muskel og kæbe slaphed, og tilstedeværelsen af ​​regelmæssige respirations. Dyr blev aflivet, når tumorerne nåede 20% af kropsmasse (dvs. størrelse af hovedet), åbne sår eller bortdøet. Tumor-bærende dyr blev aflivet med kuldioxid, når normale fysiologiske funktioner såsom at spise og drikke, vandladning og afføring blev forringet. De tidlige kriterier fjernelse på grund af komplikationer ved kirurgi inkluderet udledning fra stedet af kirurgi, tab af appetit, vægttab, og manglende pleje. kriterier Tidlig fjernelse som følge af tumorvækst inkluderet hemiplegi, at intet svar stimuli, såsom støj eller touch for en periode på mere end 12 timer efter smertestillende administration, vægttab på mere end 20% med ugentlig vejning, dehydrering, manglende groom, eller sløvhed i mere end 24 timer. Disse kriterier blev behandlet af samråd med den behandlende dyrlæge.

In vivo

modeller blev anvendt til at undersøge specifikke, anti-tumor aktivitet og overfølsomhed forbedret cytotoksicitet af SAPC-DOPS nanovesicles målrette pancreas tumorceller. For alle

in vivo

undersøgelser, kvindelige nøgen /nøgen atymiske mus (Taconic Farms, Germantown, NY, i alt 98), der vejer ca. 20-25 gram, blev anvendt. Tumorceller blev enten injiceret subkutant eller orthotopisk (fig S1, Materials S1). Alle IV injektioner blev udført i halevenen. For at bekræfte tilstedeværelsen af ​​humane pankreatiske tumorer, hematoxylin og eosin (H eksempler er vist i figur S2.

Dose vurdering for inhibering af pancreas tumorvækst ved SAPC-DOPS.

Mus (total 24) blev inokuleret subkutant i højre flanke med en suspension af PANC- 1 tumorceller (10

7cells /mus). Fireogtyve dage efter inokulering, blev tumorstørrelsen målt ved anvendelse målekrumpassere og formlen V = (π /6) LW

2 (V = volumen, L = længde, W = bredde) [36]. Den følgende dag (dag 1), grupper af tumorbærende mus (n = 6 /gruppe) blev hver injiceret intravenøst ​​med SAPC-DOPS (1, 4 eller 8 mg /kg ved et volumen 0,2 ml dosis) eller vehikelkontrol ( 0,2 ml PBS). Tumorstørrelse målinger blev udført dagligt og injektioner blev videreført hver anden dag, indtil de største tumorer nået 2000 mm

3 størrelse (18 dage). Musene blev derefter aflivet og et virkeligt tumorvægt blev målt. Statistiske analyser i denne del af undersøgelsen blev udført med GraphPad Prism® v4 software. Forskelle i sluttumorvægte blev bekræftet ved hjælp af ANOVA med Dunnett Multiple Sammenligning Indlæg Test.

Evaluering af evnen af ​​SAPC-DOPS at målrette overflade PS på pancreas tumorceller.

For at bestemme om SapC- DOPS nanovesicles specifikt retter sig mod pancreas tumorceller

in vivo

, MiaPaCa-2-celler (5 × 10

6 celler) blev injiceret subkutant i flankerne af mus. Efter 5 uger, når tumorerne var palpable, en af ​​følgende var IV injiceret i hver mus: fluorescensmærkede SAPC-DOPS nanovesicles (6 mg /kg), ikke-kompleksdannet SAPC og fluorescensmærkede DOPS, fluorescensmærkede DOPS alene, eller PBS kontrol (5 mus /gruppe, i alt 20). Vurdering af

in vivo

distribution af fluorescens blev udført med levende dyr billedenhed. Billeder blev taget på flere tidsintervaller fra 5 minutter til 100 timer efter injektion.

For at bestemme blokerende virkning af PS binding blev luciferase udtrykker cfPac1-Luc3 pancreas tumorceller anvendes. Cellerne blev forbehandlet med PS bindende proteiner lactadherin-C2 [41] og β2-glycoprotein [42] (0,1 mg /ml), eller efterlades i medium uden behandling som kontrol i en time og derefter injiceret subkutant på toppen af leder af nøgne mus (total 8). Bioluminescens billeddannelse blev udført for at visualisere tumorcellerne. En time efter implantation, fluorescensmærkede SAPC-DOPS nanovesicles var IV injiceret, og fluorescens-signalet blev dokumenteret ved hjælp af den direkte billedvisning systemet.

For at undersøge SAPC-DOPS clearance fra normalt mus væv, fluorescensmærkede SAPC-DOPS blev IV injiceret i 5 mus. Musene blev derefter aflivet, og lever, milt, lunge, hjerte og nyre blev fjernet og afbildes ved 1, 12 og 24 timer efter injektion for at vurdere ved tilstedeværelsen af ​​fluorescensmærket SAPC-DOPS.

Virkning af SAPC-DOPS nanovesicles på bugspytkirtlen tumorvækst.

MiaPaCa-2 pancreas tumorceller (5 x 10

6 celler), som vi dokumenteret i de

in vitro

undersøgelser var modtagelige for SAPC -DOPS behandling ( 80% celledød), blev injiceret subkutant i den øvre ryg af mus. Tumorstørrelse blev målt med passere hver 3 dage og volumen blev beregnet. Når gennemsnittet tumorvolumen voksede til ~500 mm

3, musene IV injiceret med enten SAPC-DOPS (6 mg /kg) eller PBS alene (5 mus /gruppe, total 10). Injektioner blev gentaget på dag 3, 6, 12, 15, 18, 21 og 24, og tumormålinger blev fortsat indtil dag 30. T-test analyse eller to-ANOVA Tukey testen blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans for eksperimenter med to eller større end to grupper, henholdsvis. Analyser blev udført med SPSS 12.0.

Sporing af tumor bioluminescens og SAPC-DOPS fluorescens i mus med ortotopisk bugspytkirtlen tumorer.

For at demonstrere, hvordan SAPC-DOPS selektivt henvender ortotopisk pancreas tumorer, menneskelig cfPac1- Luc3 celler blev injiceret i pancreas fra den nøgne mus. Efter en orthotopisk pancreas tumor blev detekteret ved anvendelse levende billedbehandling på dag 6, fluorescensmærkede SAPC-DOPS nanovesicles, fluorescens-mærket SAPC, fluorescensmærkede DOPS eller PBS (kontrol) var IV injicerede (6 mus /gruppe, i alt 24).

Overlevelse af SAPC-DOPS-behandlede mus med orthotopisk implanteret pancreas tumorer.

grupper af mus (n = 6 hver, i alt 12) med orthotopisk injicerede pancreas tumorceller (luciferase-udtrykkende cfPac1-Luc3 linje) bekræftet ved bioluminescens på live billeddannelse blev IV injiceret med multiple doser (dag 6, 9, 12, 15, 19, 23, 27, 30, 34, 41) af SAPC-DOPS (6 mg /kg i 30 pi PBS) eller vehikel kontrol (PBS 30 pi). De fluorescensmærkede SAPC-DOPS nanovesicles blev derefter detekteret under anvendelse af levende billeddannende system. De overlevende dyr blev overvåget indtil alle mus i kontrolgruppen udløbet. Overlevelse kurver blev oprettet ved hjælp af Kaplan og Meier-metoden med GraphPad Prism-software. De bioluminiscerende tumorer blev overvåget med live imaging enhed i 23 uger.

Langsigtet sporing af tumor bioluminescens og SAPC-DOPS fluorescens i mus med ortotopisk bugspytkirtlen tumorer.

Luciferase-udtrykkende cfPac1- Luc3 pancreatiske tumorceller blev orthotopisk injiceret i mus pancreas. Efter 110 dage blev fordelingen af ​​bioluminescerende tumorer følges under levende dyr billedenhed. Efter bioluminescens spredes, blev fluorescensmærkede SAPC-DOPS nanovesicles injiceret (6 mg /kg) og musene blev afbildet igen.

Målretning af skjult orthotopisk-implanterede og metastatiske tumorer ved fluorescensmærkede SAPC-DOPS nanovesicles.

orthotopisk pankreatiske tumorer blev genereret ved at implantere en luciferase-udtrykkende pancreatisk tumor line (cfPac1-Luc-3) hos mus. Efter 6 uger blev musene afbildet at identificere alle tumorsteder. Når bioluminescens havde spredes, fluorescensmærkede SAPC-DOPS var IV injiceres.

Resultater

In vitro

Studies

Effekt af SAPC-DOPS nanovesicles på tumorceller.

i tidligere undersøgelser fandt vi, at det optimale molære forhold mellem SAPC og DOPS var 1:03 til 01:10 for maksimal cytotoksisk virkning mod human neuroblastom og hud cancerceller [36], [37 ]. Vi fastslået, at dette molære vifte af SAPC: DOPS forholdet havde også signifikant drab virkning på menneskers pancreas (MiaPaCa-2) cancerceller (figur 1A). Når de tre pancreasadenocarcinom cellelinjer og Æske med HDPE-celler blev behandlet med SAPC-DOPS fleste af tumorcellerne døde, mens de Æske med HDPE celler forblev levedygtige (figur 1B). Mikroskopisk undersøgelse af SAPC-DOPS-behandlede celler viste, at tumorcellerne havde morfologiske træk i overensstemmelse med apoptotisk død, medens de utransformerede Æske med HDPE-celler forekom normale (figur 2). TUNEL-analyse afslørede, at SAPC-DOPS rent faktisk fremkalde apoptose (fig 1C). I modsætning SAPC-DOPS og den positive kontrol DNAase, den negative PBS-kontrol havde ingen apoptotisk virkning. Begge komponenter af SAPC-DOPS var afgørende for optimal tumorceller drab. Hvis blot proteinet (SAPC) eller phospholipid (DOPS) komponenter individuelt blev tilsat til cellerne, var der ingen induktion af apoptose og procentdelen af ​​apoptotiske celler var sammenlignelig med PBS-kontrol (figur 1B og 1D). Western blot-analyse afslørede, at spaltning af proenzymet pre-caspase-9 til den aktive form forekom kun i SAPC-DOPS-behandlede celler og STAUROSPORIN-behandlede celler (figur 1E).

(A) rolle SAPC og DOPS molforhold for cytotoksicitet på menneskers pancreas (MiaPaCa-2) cancerceller. (B) celledød (%) i humane bugspytkirtelkræftceller (MiaPaCa-2, Panc-1, og BxPC-3) og normale kontroller (Æske med HDPE) efter udsættelse for SAPC-DOPS. (Data i 1B-1D er angivet som aritmetisk middelværdi ± SEM.) (C) Apoptose (%) i MiaPaCa-2 bugspytkirtelkræftceller efter behandling med enten SAPC-DOPS, PBS (negativ kontrol), eller DNAase (positiv kontrol). (D) celledød (%) i humane bugspytkirtelkræftceller og HDPE efter udsættelse for SAPC-DOPS, SAPC alene eller DOPS alene. (E) Western blot-analyse viser, at behandling af MiaPaCa-2 bugspytkirtelkræftceller med både SAPC-DOPS og staurosporin positiv kontrol (P) resulterede i spaltning af præ-caspase-9 til aktiv caspase-9, mens behandling med DOPS, PBS , og negativ kontrol (N) forårsagede ikke enzymaktivering.

tumorceller (Panc-1, Capan-1 og MiaPaCa-2 i (B), (C) og (D) henholdsvis) havde morfologiske træk i overensstemmelse med apoptotisk død efter behandling med SAPC-DOPS, mens de ikke-transformerede Æske med HDPE-celler (A) syntes normal.

Sammenhæng mellem dræbende effekt af SAPC-DOPS og PS eksponering på pancreas celleoverfladen.

fluorescens histogram i figur 3A viser, at den eksterne PS niveau på PANC-1 celler var højere end for AsPC-1 celler. Den relative PS-ekspression på celleoverfladen af ​​humane pancreatiske tumorcellelinier demonstreres i figur 3B. Blandt disse cellelinier, MiaPaCa-2, HPAF-II, og PANC-1 havde MF over 50 og derfor omfattede “High-PS” gruppe. Som vist i figur 3C, cellerne i High-PS-gruppen viste signifikant større cytotoksicitet som reaktion på SAPC-DOPS end cellerne i Low-PS-gruppen (p 0,05).

(A) Fluorescence histogram PS-niveauer på PANC-1 og AsPC-1 celleoverflader målt ved Annexin V-FITC. (B) Den differentielle PS-ekspression på human pancreas celleoverfladen af ​​9 cellelinier. (C) Kombineret procentdel af celle overlevelse i de to grupper af cellelinier behandlet med SAPC-DOPS som bestemt ved MTT assay (p = 0,0032)

In vivo

Studies.: Subkutan pancreas tumor Model

Dose vurdering for hæmning af pancreas tumor vækst ved SAPC-DOPS.

tumor størrelser efter administration af SAPC-DOPS i doser på 4 mg /kg og 8 mg /kg hver anden dag var betydeligt mindre end den af ​​kontrolgruppen og 1 mg /kg behandlingsgruppe (p = 0,003 * og 0,00015 **) efter 18 dages behandling (figur 4). Baseret på disse data, valgte vi en behandling dosis på 6 mg /kg for undersøgelser af effekten.

PANC-1 xenograft tumorer i nøgne mus blev behandlet hver anden dag med 1, 4 eller 8 mg /kg af SAPC -DOPS, eller med PBS-kontrol. Tumorstørrelser ved høje doser (4 mg /kg og 8 mg /kg) var signifikant mindre end kontrollen og 1 mg /kg (p = 0,003 * og 0,00015 ** henholdsvis).

Evaluering af evnen af ​​SAPC-DOPS at målrette overflade PS på pancreas tumorceller.

live-billeddannelse viste, at fluorescens-mærkede SAPC-DOPS nanovesicles blev hurtigt rettet til håndgribelig tumor inden for 5 minutter (data ikke vist) og fluorescens varede i over 4 dage (figur 5). Fluorescensen fra den samlede SAPC-DOPS nanovesicles målrettet til tumorstederne, hvorimod ingen tumor fluorescens blev bemærket efter co-injektion af ikke-kompleksbundet SAPC og fluorescensmærkede DOPS, eller efter injektion af fluorescensmærkede DOPS alene eller PBS-kontrol (figur 6A og 6B). Mens fluorescensmærket SAPC-DOPS blev bemærket at ophobes i leveren tidligt (2 timer efter injektion), var der intet spor af liver fluorescens på levende billeddannelse efter 24 timer (figur 6A). Tilsvarende ikke-kompleksbundet SAPC og fluorescens-mærkede DOPS, og de fluorescerende mærkede DOPS alene, blev identificeret i leveren 0.5 timer på levende billeddannelse, men hurtigt spredes (figur 6B).

nanovesicles blev hurtigt rettet til håndgribelig tumor inden for 5 minutter (data ikke vist). Fluorescensen varede i over 1 (A) og 4 (B) dage. SAPC = 3,2 mg /kg, DOPS = 1,8 mg /kg, CVM = 6 uM.

Heterotop MiaPaCa-2 tumorer (cirkel) blev genereret ved subkutan injektion i den øvre flanke af nøgne mus. (A) Mus 1 2 var tumorbærende mus, injiceret med fluorescensmærket SAPC-DOPS nanovesicles; Mouse 3 var ikke-tumor-bærende, PBS injiceret. Mus 1 og 2 begge demonstrere lokalisering af det fluorescerende mærke til tumorstedet. Fluorescens lokaliserer også til leveren med 2 timer, men er gået 24 timer. (B) tumorbærende mus 4, 5 og 6 blev injiceret med ikke-kompleksdannet SAPC og fluorescens-mærkede DOPS kun fluorescensmærkede DOPS, og PBS hhv. Der er ingen fluorescens lokaliseret til tumoren i nogen af ​​disse mus.