PLoS ONE: Hæmning af Calcium-aktiveret Chloride Channel ANO1 /TMEM16A Undertrykker tumorvækst og invasion i Human Lung Cancer

abstrakt

Lungekræft eller pulmonal carcinoma primært afledt af epitelceller, der er tynd og linje på alveolære overflader af lungen for gasudveksling. ANO1 /TMEM16A, oprindeligt identificeret fra luftvejs-epitelceller, er medlem af Ca

2 + -aktiverede Cl

– instrumenter (CaCCs), der fungerer til at regulere epitel- sekretion og cellevolumen til vedligeholdelse af ion og vævshomeostase. ANO1 /TMEM16A har for nylig vist sig at være stærkt udtrykt i flere epitel stammer karcinomer. Imidlertid rolle ANO1 i lungekræft fortsat ukendt. I denne undersøgelse viser vi, at inhibering af calcium-aktiverede chlorid kanal ANO1 /TMEM16A undertrykker tumorvækst og invasion i human lungecancer. ANO1 opreguleres i forskellige humane lunge cancercellelinjer. Knocking-down ANO1 af små hårnål RNA hæmmede proliferation, migration og invasion af GLC82 og NCI-H520 annullere celler evalueret af CCK-8, ville-healing, transwell og 3D blød agar assays. ANO1 protein overudtrykkes i 77,3% tilfælde af humane lunge adenocarcinom væv påvist ved immunhistokemi. Endvidere blev tumorvækst i nøgne mus implanteret med GLC82 celler signifikant undertrykt af ANO1 nedregulering. Tilsammen vores resultater dokumenterer, at ANO1 overekspression bidrager til tumorvækst og invasion af lungekræft; og undertrykke ANO1 overekspression kan have terapeutisk potentiale i lungekræft terapi

Henvisning:. Jia L, Liu W, Guan L, Lu M, Wang K (2015) Hæmning af Calcium-aktiveret Chloride Channel ANO1 /TMEM16A Undertrykker Tumor vækst og invasion i human Lung Cancer. PLoS ONE 10 (8): e0136584. doi: 10,1371 /journal.pone.0136584

Redaktør: Shang-Zhong Xu, University of Hull, England

Modtaget: April 28, 2015; Accepteret: August 5, 2015; Udgivet: 25 August, 2015

Copyright: © 2015 Jia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger til KWW fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina (2013CB531302 og 2014ZX09507003-006-004) og National Science Foundation of China. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft eller pulmonal carcinoma, der stammer fra epitelceller er generelt kategoriseres i småcellet lungecancer (SCLC) og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Som den mest almindelige form for lungekræft, NSCLC tegner sig for 84% af de anslåede sager med to store undertyper: adenokarcinom og pladecellekræft [1]. På nuværende patogenese og udvikling af lungekræft er ikke klart defineret. Stigende evidens for, at ionkanaler spiller en væsentlig rolle i cancer celleproliferation og invasion, og i kørsel cancer progression overhovedet forskellige stadier [2, 3].

lonkanaler er vandfyldte porer og transmembrane proteiner til stede i alle levende celler, som deltager i forskellige fysiologiske aktiviteter integreret til ophidselse, sammentrækning, sekretion, cellecyklus og metastatiske kaskader [4, 5]. Normal ekspression af ionkanaler er afgørende for opretholdelse af Ca

2 + og vævshomeostase under cellulær proliferation og differentiering gennem regulerer cellulære ionstrømme, regulering cellevolumen, og generering membranpotentiale [6, 7]. Chloride kanaler er vigtige for mange biologiske processer, herunder transepitel transport for ionstrømme, regulering celle volumen, differentiering og apoptose [8, 9]. Stabil og konstant cellevolumen og ion homeostase under celleproliferation og differentiering er strengt nødvendigt til cellefunktion og overlevelse [10, 11]. Chlorid flux gennem chloridkanaler som respons til celle hævelse er en af ​​de kritiske mekanismer, hvorved celler genoprette deres volumen efter osmotiske forstyrrelser og stress forårsaget af intensive metaboliske aktiviteter skyldes vand, nonelectrolyte og ionbytning på epiteloverfladerne [12-14]. Dysregulering af ionkanal-ekspression bliver epigenetisk unormal i metastatiske cancerceller [15-17]. For eksempel er opregulering af chlorid intracellulær kanal 1 (CLlC1) involveret i tyktarmskræft celle migration og invasion gennem mediere lovgivningsmæssige volumen reduktion (RVD) mekanisme [18]; og overekspression af chlorid kanal3 (ClC3) bidrager til flere humane carcinomer, såsom gliom, lunge-, bryst-, og cervikale tumorer [19]. Det er også blevet rapporteret, at stigningen i intracellulært calcium opstår under hypotonisk udfordring er relateret til RVD og involveret med kræft apoptose, hvilket indikerer samspillet mellem calcium homeostase og volumen homeostase [20, 21].

Ca

2 + -aktiverede Cl

– kanaler (CaCCs) er vigtige regulatorer af epitel sekretion og celle volumen regulering [22, 23]. TMEM16A, også kendt som DOG1, ORAOV2 eller TAOS-2 blev identificeret fra luftvejsepitelceller celler som en bona fide CACC der medierer endogen Ca

2 + -aktiverede kloridstrøm [24-26]. TMEM16A er også blevet omtalt som anoctamin en (ANO1) på grund af sin anion selektivitet og otte (OLT) transmembrane segmenter [25].

ANO1 /TMEM16A

genet er lokaliseret på 11q13, en af ​​de hyppigst amplificerede regioner i humane cancere [27, 28] og forbundet med en dårlig prognose [29]. Det er for nylig blevet vist, at ANO1 /TMEM16A forstærkes eller overudtrykt i flere humane kræftformer såsom gastrointestinale stromale tumorer (GIST), prostatakræft, hoved og hals pladecellekræft (HNSCC), brystkræft og kolorektal cancer celler [27, 30- 33]. ANO1 overekspression er også korreleret med dårlig prognose af HNSCC og brystkræftpatienter [30, 34], og farmakologisk inhibering af CACC ANO1 aktivitet ved CaCCinh-A01 og T16Ainh-A01 kan inhibere cancercelleproliferation [32, 35, 36]. Selvom årsagen til høj ekspression af ANO1 i tumorer er uklar, har flere undersøgelser vist, at ANO1 er involveret i onkogen signalering ved at aktivere EGFR og CaMK veje til at fremme cellecyklus og kræft progression [30, 37]. Det er blevet rapporteret, at ANO1-interagerende proteiner såsom signalering /stilladser actinbindende regulatoriske proteiner ezrin, radixin, moesin, og RhoA kan deltage i reguleringen af ​​ANO1 funktion [38, 39]. For nylig ANO1 og EGFR viser sig at danne et funktionelt kompleks, der regulerer HNSCC celleproliferation [40]. Imidlertid, om ANO1 /TMEM16A spiller en rolle i tumorgenese for lungekræft fortsat ukendt.

I denne undersøgelse fandt vi, at CACC ANO1 er stærkt opreguleret i humane lungecancer væv. ANO1 opregulering blev bekræftet i forskellige humane lunge cancer cellelinjer. Knockdown af ANO1 udtryk ved kort hårnål RNA hæmmede celleproliferation, migration og invasion i lungekræft celler GLC82 og NCI-H520. Inhibering af ANO1 undertrykte også tumorvækst i nøgne mus implanteret med stabil transficeret GLC82 celler. Vores resultater dokumenterer, at membranen ANO1 protein kan tjene som en potentiel biomarkør og mål for diagnose og behandling af lungekræft.

Metoder

Cell kultur

Normal lunge cellelinje 2BS , lungekræft-cellelinjer A549 og H1299 var gaver fra Dr. Hongti Jia ved Institut for Biokemi og Molekylær Biologi, Peking University Health Science center. A549 og H1299-celler blev oprindeligt opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). 2BS celler blev oprindeligt opnået fra National Institute of Biological Products (Beijing, Kina). Lung cancer cellelinjer GLC82 og Calu-3 for adenocarcinom og NCI-H520 for pladecellekræft blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). De 2brs celler blev dyrket i DMEM (Invitrogen, Carlsbad, USA), og de andre cellelinier blev propageret i RPMI 1640-medium (Invitrogen). Mediet blev suppleret med 10% føtalt kalveserum og 1% penicillin-streptomycin. Alle celler blev holdt i medium ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2.

shRNA transfektioner og generering af stabile cellelinier

ANO1 shRNAs og scrambled shRNA plasmider blev bygget af GeneChem Co., Ltd (Shanghai, Kina). Den shRNAs blev klonet ind i BamHI- og HindIII-stederne i pGCsi-U6 /Neo /GFP Vecor, og sløjfen sekvensen i TTCAAGAGA blev anvendt. Målet sekvens af tre ANO1 shRNAs var som følger: shRNA1, CGTGTACAAAGGCCAAGTA; shRNA2, GCATCTATTTGACTTGTCT; shRNA3, CGAAGAAGATGTACCACAT. Den krypterede sekvens var CGAGTGGTCTAGTTGAGAA. Til transfektion blev 8 ug DNA anvendt pr 60 mm plade med Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner, og transfektion blev mediet erstattet med dyrkningsmedium 4 timer efter transfektion. Alle efterfølgende forsøg blev udført ved 48-72 timer efter transfektion og gentaget tre gange. For at generere en stabil GLC82 cellelinje udtrykker ANO1 shRNA blev transfekterede celler udvalgt under 800 pg /ml G418.

immunhistokemisk farvning

Kirurgisk resektion humane cancer vævsprøver, der består af 44 tilfælde af lunge adenocarcinom og 40 tilfælde af planocellulært lunge karcinom blev opnået med tilbagevirkende kraft fra Peking University Third Hospital. De vævsprøver var fuldt de-identificeret før adgang af os og alle patienter blev informeret og givet samtykke til brugen af ​​deres udskåret væv til fremtidig forskning. Vævssnittene blev inkuberet i en 60 ° C tør kammer i en time før de-paraffinized i xylen tre gange og hydreret gennem en gradueret række af ethanol. Behandlet i 3% hydrogenperoxid i 10 minutter, blev vævene derefter kogt i 10 mM citrat antigen hentning opløsning (pH 6,0) i 20 minutter under anvendelse af en mikrobølgeovn. Immunhistokemisk (IHC) farvning blev udført ved at inkubere vævene med det primære antistof til ANO1 (1: 100; ab53212, Abcam) ved 4 ° C natten over. Efter inkubering af vævene med ged anti-kanin IgG-HRP i 30 minutter ved 37 ° C blev DAB kromogen, der anvendes til visualisering. Scores blev beregnet ved at gange intensiteten (helt tal mellem 0 og 3).

Western blot-analyse

Celler blev vasket tre gange i iskold phosphatpufferopløsning og lyseret i RIPA-buffer med 1 X Halt phosphatase og proteasehæmmere cocktails (Pierce, Rockford, IL). Prøver blev kvantificeret under anvendelse af et BCA proteinassaykit (Thermo Scientific, USA). Lige store mængder protein (50 ug) blev separeret ved anvendelse PAGE (8%) og overført til nitrocellulosemembraner. Efter blokeret med Tris-bufret saltvand (TBS) indeholdende 5% mælk blev Blottingmembranen inkuberet natten over ved 4 ° C med kanin-anti-ANO1 (1: 1000; Abcam) og kanin-anti -β-actin (1: 500; Santa Cruz, CA). Membranen blev inkuberet med et anti-kanin IgG-HRP sekundært antistof (1: 5000, Santa Cruz) i en time ved stuetemperatur og visualiseret ved hjælp af Immobilon Western HRP Substrate

CCK8 celleproliferationsassay

.

Celleproliferation blev målt med Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Japan). 500 celler per brønd blev inokuleret i 96-brønds plader. 10 pi af Cell Counting Kit-opløsning blev tilsat til hver brønd ved 24, 48, 72 og 96 timer efter seeded. Derefter plader med 96 brønde blev inkuberet i 2 timer ved 37 ° C før den optiske densitet (OD) blev målt ved 450 nm ved en mikropladelæser.

Kolonidannelse assay i kultur

I kolonidannelse i kultur, transficerede celler (behandlet med 800 ug /ml G418 i 2 dage efter 48 timers transfektion) blev udpladet ved 200 celler per brønd i plader med 6 brønde og inkuberet i RPMI-1640 medium indeholdende 10% føtalt bovint serum for 12-15 dage. De resterende kolonier blev farvet med 0,1% krystalviolet og talt, og billeder blev taget efter farvning.

blød agar-kolonidannelse assayet

Kolonidannelse assay i blød agar blev udført i en 6- brønds plade. Basislaget blev fremstillet ved at blande 1,2% agarose (Invitrogen) og svarer til mængden af ​​2 × medium med 20% FBS. Derefter celler fra hver gruppe blev høstet og suspenderet i medium indeholdende 0,4% agarose og forgyldt over basislaget i tre eksemplarer ved en densitet på 3000 celler pr. Efter 30 dage blev kloner observeret tilsyneladende og cellerne blev iced i fire timer, og derefter farvet med 0,02% krystalviolet. Billeder blev taget efter farvning.

sårheling assay

For at måle migrering aktivitet, celler blev inokuleret i seks-brønds plader, dyrket til 90% sammenflydning i RPMI-1640 medium indeholdende 10% føtalt bovint serum. Derefter blev cellerne udsultet ved at ændre mediet til serumfrit RPMI-1640 og dyrket i 24 timer. Celler blev skrabet med 100 pi plast pipettespidser og vasket med phosphatpufferopløsning. Billeder blev opsamlet hver 24 timer med et inverteret fasekontrastmikroskop (Olympus; forstørrelse: 10 ×). Den forholdet resterende sårområde blev beregnet i forhold til den oprindelige sårområde og normaliseret til krypterede gruppe eller DMSO gruppe shRNA.

Transwell assay

celleinvasion aktivitet blev vurderet i 8,0 um porestørrelse transwell 24-insert plade kamre (Corning, Acton, MA, USA) belagt med BioCoatMatrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, USA). Efter præ-udsultet i 24 timer ved dyrkning i serumfrit medium, 3X10

4 (NCI-H520) eller 5×10

4 (GLC82) celler per brønd blev udpladet i de øvre kamre med serumfrit medium og inkuberet i 48 (NCI-H520) eller 72 (GLC82) timer. De nedre kamre blev fyldt med 10% føtalt bovint serum-medium. Efter aftørring af cellerne ud fra den øvre side af det øvre kammer, blev den nedre side af det øvre kammer fikseret med methanol og farvet med 4,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI; Sigma). Billeder blev fotograferet under mikroskop. Det DAPI farvning område i det nedre kammer blev normaliseret til røræg shRNA gruppe eller DMSO-gruppe, hvilket indikerer den relative invasiv.

In vivo

xenograft tumorvækst

Købt fra Institut af Laboratory Animal Science of Peking University Health Science center, blev 5 uger gamle BALB /c nu /nu mus i karantæne i en uge forud for deres anvendelse i undersøgelsen. Dyr (8 dyr pr bur) blev huset i microisolat med fri adgang til standard gnaverfoder og vand under temperaturkontrollerede forhold (23 ± 2 ° C) på% fugtighed 70 [33]. Dyr blev holdt på en omvendt 12 h /12 h lys /mørke cyklus (lys tændt kl 7:00). De dyr eksperimentelle protokoller blev godkendt af Animal brug og Omsorgsudvalget af Peking University og var i overensstemmelse med de etiske retningslinjer. GLC82 stabile celler (1 x 10

7-celler per mus) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). GLC82 celler blev transficeret ved krypterede shRNA, ANO1 shRNA1 og ANO1 shRNA2 henholdsvis og udvalgt af G418 i to uger før brug. GLC82 celler blev inokuleret hypodermically i de rigtige forbenene på de nøgne mus, og i hver gruppe otte dyr blev anvendt. På 7. dag efter injektion blev tumorstørrelserne målt hver 2-4 dage i en periode på 2 uger og beregnes som (L x B

2) /2 (L og W repræsenterede den længste langsgående og tværgående diameter, henholdsvis ). Endepunktet af forsøgene var på den 19. dag efter injektion af GLC82 celler for at sikre, at tumormasse ikke signifikant forstyrrer kroppens normale funktioner af mus eller forårsage smerte. Mus blev aflivet ved intraperitoneal injektion af pentobarbital (120 mg /kg) kombineret med 0,25% lidocain før tumorer blev fjernet. Repræsentative billeder blev opnået før tumorer blev vejet ved hjælp af et elektronisk balance.

Statistisk analyse

GraphPad Prism 5 blev anvendt til at analysere data. Alle data er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. Studerendes

t

-test blev anvendt i dataanalyse af cellulære eksperimenter mellem to grupper. ANOVA blev anvendt til at analysere proteinniveauer af ANO1 i flere cellelinier, og at sammenligne forskellen i tumorvækst. Til analysen af ​​humane patologiske væv samlinger, blev Chi-square test. Værdien af ​​

P

. 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

Overekspression af ANO1 i humane lunge adenocarcinom væv

For at undersøge udtryk niveau af calcium-aktiverede klorid kanal ANO1 proteiner, brugte vi ANO1 antistof til immunhistokemisk farvning og opdaget ANO1 udtryk i lunge patologiske vævsprøver fra 84 patienter. Som vist i figur 1, blev ANO1 protein stærkt udtrykt i adenocarcinom i lungen, mens væv fra benign alveoler støder op til carcinom og pladecellecarcinom viste negativ farvning af ANO1. Analysen af ​​immunhistokemisk farvning afslørede, at ANO1 proteinekspression var positiv i 34 af 44 (77,3%) human lunge adenocarcinom vævsprøver (Tabel 1). I vævsprøver fra pladecelle-lungecarcinom, 6 af 40 (15%) blev farvet ANO1 positive. Disse resultater indikerer, at ANO1 protein overudtrykkes i tumorigenese af humane lungecancer og især lungeadenocarcinom.

(A) Benign alveoler støder op til carcinoma viser negativ ANO1 farvning. (B) Planocellulært lunge karcinom viser negativ ANO1 farvning. (C) human lunge adenocarcinom kræftvæv viser ANO1 farvning (brun farve) af neoplastisk epitel. Skalaen bar angiver 50 um.

opregulering af ANO1 udtryk i humane lunge cancer cellelinjer

Brug af immunhistokemi, vores indledende fund viste, at ANO1 blev overudtrykt i menneskelig lungekræft væv især i adenocarcinom. For at bekræfte den immunhistokemiske konstatering og afgøre, om ANO1 også opreguleres i forskellige patologiske former for lungekræft cellelinier, vi udvalgt og testet 6 forskellige cellelinier, der omfatter de 2BS celler til normale humane lunge-cellelinie, GLC82 og Calu-3 celler for adenocarcinom , NCI-H520 celler til pladecellecarcinom, og A549 og H1299 celler for ubekræftet type lungekræft (fig 2). Proteiner ekstraheret fra 2BS, NCI-H520, GLC82, Calu-3, A549 eller H1299-celler blev separeret ved gelelektroforese under denaturerende betingelser og probet med ANO1 specifikt antistof. Som vist i det nederste panel af figur 2, kvantitativ analyse af ANO1 proteinekspression niveau udviste en højde ca. 2,8 gange i NCI-H520, 6,9-fold i GLC82, 6,3-fold i Calu-3, 3,1-fold i A549 og 8,0 fold i H1299, sammenlignet med normale lunge 2BS celler. Stigningen i GLC82, Calu-3 og H1299-celler var statistisk signifikant, men ikke for NCI-H520 og A549-celler (P = 0,149 og P = 0,238, henholdsvis) selv om der var en tendens til stigning i ANO1 ekspression. Dette resultat er i overensstemmelse med den immunhistokemiske analyse af lungekræft væv fra patienter (tabel 1), hvilket yderligere bekræfter, at ANO1 ekspression er højere i lungeadenocarcinom GLC 82 celler end pladecarcinom HCI-H520 celler. De GLC82 og NCI-H520 celler, der havde forskellige ekspressionsniveauer af ANO1 proteiner blev udvalgt til yderligere undersøgelser

Topplade:. Repræsentative Western blot billeder af ANO1 udtryk i forskellige lunge-cellelinjer. Bundplade: statistisk analyse søjlediagram (n = 3) af ANO1 relative niveauer i NCI-H520, GLC82, Calu-3, A549 og H1299 cellelinjer (sammenlignet med normale 2BS celler). Ekspressionen af ​​ANO1 blev normaliseret til ekspressionsniveauet af β-actin. ANO1 signifikant overudtrykt i GLC82, Calu-3 og H1299 cellelinier. Statistisk signifikans ved ANOVA gives som *

s

0,05; **

s

0,01 og ***

s

0,001. Alle data er vist som gennemsnit ± sem

Hæmning af GLC82 og NCI-H520 celledeling ved lyddæmpende ANO1

For at vurdere den biologiske rolle ANO1 i lungekræft celleproliferation, vi brugte shRNAs at knockdown ekspressionen af ​​ANO1 i forskellige cellelinier. Effektiviteten af ​​tre shRNAs blev evalueret ved Western blot i GLC82 og NCI-H520 lunge kræftceller. Sammenlignet med transfektion af krypterede shRNA, ANO1 shRNA1 transfektion var mest effektive til at lukke munden endogen ekspression af ANO1 proteiner i både GLC82 og NCI-H520-celler (Fig 3A), og det blev således anvendt til resten af ​​eksperimenter.

(A) RNAi knockdown af ANO1 proteinekspression i ANO1 udtrykkende celler blev vist ved Western blot billeder. De membranproteiner ekstraheret fra GLC82 og NCI-H520 celler på 3. dagen efter transfektion af forskellige ANO1 shRNAs (shRNA1, shRNA2 og shRNA3) blev immunoblottedes med ANO1 antistof. ANO1 shRNA1 viste den mest effektive hæmning af ANO1 udtryk sammenlignet med de to andre shRNAs og krypterede shRNA. (B) GLC82 eller NCI-H520-celleproliferation blev bedømt ved CCK8 assay baseret på den ekstracellulære faldende af WST8 NADH produceret i mitokondrier. Under anvendelse af en mikropladelæser, blev antallet af celler kvantificeret ved måling af absorbans ved 450 nm. Transfektion af ANO1 shRNA1 resulterede i signifikant inhibering af GLC82 og NCI-H529 cellelevedygtighed i tidsafhængig måde i sammenligning med celler behandlet med røræg shRNA (n = 6). (C) Cell proliferation af carcinomaceller blev vurderet af kolonidannelse assayet i kultur i nærvær af ANO1 shRNA1. Kvantitativ analyse af ANO1 silencing gruppen viste mindre koloni genesis, sammenlignet med røræg shRNA gruppe (n = 3). Repræsentative billeder viste nedenfor søjlediagrammer. (D) RNAi af ANO1 inhiberer clonogenicity af GLC82 celler i blød agar (n = 3). NCI-H520 undladt at danne kolonier i blød agar. Statistisk signifikans ved Students

t

-test angives som *

s

0,05; **

s

0,01 og ***

s

0,001. Data er udtrykt som gennemsnit ± S.E.M.

For at bestemme levedygtighed og spredning, vi udført celledeling CCK8 under anvendelse GLC82 og NCI-H520 celler. Som vist i fig 3B, silencing ANO1 væsentligt bremset væksten af ​​lunge adenocarcinom GCL82 og lunge pladecarcinom NCI-H520 celler. Proliferation af GLC82 celler blev inhiberet på tidsafhængig måde fra 89,1% på dag 2, 81,6% ved dag 3 til 75,0% på dag 4. Proliferation af NCI-H520-celler blev også inhiberet fra 89,0% på dag 2, 75,3% på dag 3-71,7% på dag 4. for yderligere at bekræfte disse resultater, vi anvendte to assays af kolonidannelse i både dyrkningsskål og blød agar. Som vist i fig 3C, silencing ANO1 resulterede i et fald på 36,2% kolonidannelse i GLC82 celler og 30,7% kolonidannelse i NCI-H520 celler, sammenlignet med scrambled shRNA kontrol. For yderligere at bekræfte virkningen af ​​silencing ANO1 på proliferation, anvendte vi blød agar-kolonidannelse assayet, der overvåger forankringsuafhængig cellevækst. GLC82 celler kan danne kolonier i blød agar i tredive dage, men NCI-H520 celler undladt at danne kolonier. Som vist i fig 3D, proliferation af GLC82 celler behandlet med ANO1 shRNA var signifikant inhiberet sammenlignet med det scramblede shRNA gruppen. Disse resultater indikerer, at tavshed endogen ANO1 kan hæmme spredning af GLC82 og NCI-H520 lunge kræftceller.

Reduktion af GLC82 og NCI-H520 celle migration og invasion ved at lukke munden ANO1

For at undersøge migration af lungecancerceller, vi udnyttet sårhelende assay, der evaluerer sårlukning. To dage efter transfektion blev cellerne plantet i en seks-brønds plade indtil 90% sammenflydende før sultet i 24 timer. Cellelaget blev forsigtigt såret af sterile pipettespidser, inkuberet med serumfrit medium. Som vist i fig 4A og 4B, transfektion GLC82 lungecancerceller med ANO1 shRNA inhiberede såret påfyldning ca. 66,8% efter 24 timer, 67,5% ved 48 timer og 74,3% efter 72 timer, sammenlignet med røræg shRNA. I NCI-H520 lungecancer-celler (Fig 4C og 4D), den sårhelende i ANO1 knockdown gruppe var kun ca. 29,1% efter 24 timer og 27,6% efter 48 timer sammenlignet med de scramblede shRNA kontrolgruppen. På de 48 timer, den sårheling var næsten fuldstændig i scrambled shRNA kontrolgruppen. Disse resultater viser, at endogen ANO1 fremmer tumorcellemigration, og silencing ANO1 inhiberer migrationen af ​​lungecancerceller.

Migration af GLC82 og NCI-H520-celler transficeret med ANO1 shRNA1 eller krypteret shRNA blev vurderet ved sårheling assay . To dage efter transfektion blev cellerne plantet i en seks-brønds plade indtil 90% konfluente og derefter sultet i 24 timer. Cellelaget blev forsigtigt såret af sterile pipettespidser, og inkuberet med serumfrit medium. (A) Bright felt billeder af sår på tidspunkter 0 timer, 24 t, 48 t og 72 t (GLC82) blev vist under lav forstørrelse. (B) Kvantificering for ændringen i sår-heling af GLC82 celler blev vist på linje graf og normaliseret til scrambled shRNA gruppe. (C) Billeder af NCI-H520 sårheling eksperiment ved 0 h, 24 timer og 48 timer blev præsenteret. (D) Linjegraf af NCI-H520-celler viser cellemigration, der blev inhiberet af ANO1 shRNA1 knockdown (n = 3). Statistisk signifikans (Students

t

-test) angives som *

s

0,05; **

s

0,01 og ***

s

0,001. vises Alle data som middelværdi ± S.E.M.

Den mest truende træk ved malignitet i lungekræft er potentiale for invasion og metastaser. For yderligere at undersøge, om tavshed ANO1 påvirker også celle invasion, brugte vi transwell analysen. To dage efter transfektion med ANO1 shRNA1 eller krypteret shRNA, GLC82 og NCI-H520 celler blev sultet i 24 timer, før yderligere inkubering i det øverste kammer. Efter 48 timers inkubation i NCI-H520-celler svarende til 72 timers inkubation for GLC82 celler blev celler invaderer ind i det nedre kammer fikseret med methanol og farvet med DAPI. Som vist i figur 5, blev invasionen potentiale af tumorceller dramatisk undertrykt af ANO1 knockdown. Arealet af ANO1 tavshed GLC82 celler, der gik gennem det øvre kammer var kun 4,0% af den krypterede shRNA gruppen (fig 5A og 5B). Som vist i fig 5C og 5D, den relative transwell området ANO1 knockdown i NCI-H520-celler var 12,2%, sammenlignet med celler transficeret med krypterede shRNA. Disse resultater indikerer, at tavshed ANO1 hæmmer migration og invasion af lungekræft GLC82 og NCI-H520 celler.

GLC82 og NCI-H520 celler blev sultet i 24 timer før inkuberet i det øverste kammer med Matrigel Transwell filtre. Efter 48 timer (NCI-H520) eller 72 timer (GLC82) blev celler invaderer ind i det nedre kammer fikseret med methanol og farvet med DAPI. (A) Images repræsenterer mikroskopiske områder af de invaderende GLC82 celler. (B) Den invasivitet af celler, der udtrykker ANO1 shRNA 1 eller krypteret shRNA blev kvantificeret ved farvede område i invaderende GLC82 celler. Invasionen område er normaliseret til scrambled shRNA gruppe. (C) Repræsentative billeder af NCI-H520 celler invaderet gennem Matrigel Transwell filtre. (D) Bar chat af NCI-H520 celler, der viser faldet i celle invasion af ANO1 shRNA1 knockdown (n = 3). Statistisk signifikans ved Students

t

-test angives som *

s

0,05; **

s

0,01 og ***

s

0,001. Data er udtrykt som gennemsnit ± sem

Undertrykkelse af xenograft tumorvækst i nøgne mus ved ANO1 knockdown

For at undersøge effekten af ​​ANO1 knockdown på væksten af ​​xenograft tumor

in vivo

, tre grupper af GLC82 celler blev individuelt transficeret med ANO1 shRNA1, ANO1 shRNA2 og scrambled shRNAs, og deres knockdown effektivitet blev bekræftet ved western blot før injektion til dannelse af tumor xenograft i mus (fig 6A). Vi injiceret 10

7 GLC82 celler per mus i højre forben af ​​5 uger gamle nøgne mus i fire grupper for dannelsen af ​​en tumor xenograft. Størrelsen af ​​tumorer blev først målt 7 dage efter injektion (som dag 0). Som vist i fig 6B og 6C, ANO1 silencing resulterede i en signifikant reduktion af tumorvækst ved 68,8% i shRNA1 gruppe og 42,1% i shRNA2 gruppe, henholdsvis i forhold til det krypterede gruppe ved observation af dagen 12. På dag 12, tumorerne blev fjernet fra mus og vejet. En bemærkelsesværdig reduktion af tumorvægt i ANO1 shRNA grupper blev observeret (Fig 6D og 6E). Sammenlignet med kontrolgruppen scrambled shRNA, den gennemsnitlige tumorvægt af ANO1 shRNA1 og shRNA2 grupper var omkring 38,7% og 70,1%, henholdsvis (fig 6D og 6E). Yderligere immunhistokemisk farvning af ANO1 i xenograft tumor bekræftet, at reduktionen af ​​ANO1 protein ekspressionsniveauer stemte overens med den tumorvolumen i grupperne behandlet med ANO1 shRNAs med forskellig styrke og i kontrolgruppen (Fig 6F og 6G). Disse resultater indikerer, at ANO1 silencing ikke kun hæmmer migration og invasion af lungecancerceller men også signifikant undertrykker tumorvækst.

Normal GLC82 celler eller stabile GLC82 celler, der udtrykker ANO1 shRNA 1, ANO1 shRNA 2 og krypteret shRNA blev inokuleret hypodermically ind i de rigtige forbenene af 5 uger gamle nøgne hunmus (1×107 celler per mus). (A) vestlige analyse af knockdown effektivitet for vildtype GLC82 celler og GLC82 celler stabile udtrykker scrambled shRNA, ANO1 shRNA 1 og ANO1 shRNA 2. (B) Repræsentant billede af nøgne mus der bærer GLC82 implanteret tumorer i fire grupper: blank gruppe (n = 7), krypteret shRNA (n = 8), ANO1 shRNA1 gruppe (n = 8) og ANO1 shRNA2 gruppe (n = 8). (C) Tumorstørrelse blev målt hver 2-4 dage ved Vernier caliper under dets udvikling, siden den 7. dag efter injektion. Væksten af ​​tumorer, der udtrykker ANO1 shRNA1 og ANO1 shRNA2 var signifikant hæmmet i en tid afhængig måde, sammenlignet med den scrambled shRNA gruppen. (D) Repræsentant billede af tumorer plukket fra mus på 12. dag i generation. (E) Tumorer blev vejet og analyseret efter kirurgisk fjernelse. Sammenligning med scrambled shRNA tumorer, ANO1 shRNAs tumorer var lysere. Statistisk signifikans (ANOVA) vises som *

s

0,05; **

s

0,01 og ***

s

0,001. Data er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. (F) Repræsentative billeder af immunhistokemisk farvning af ANO1 udtryk i xenograft tumorvæv. (G) Analyse af ANO1 udtryk i xenograft tumorvæv blev gennemført ved at score fra 0 til 3 i overensstemmelse med den intensitet og område af farvning.

Diskussion

Målet med denne undersøgelse var at undersøge, om Ca

2 + -aktiverede Cl

– kanal (CACC) ANO1 eller TMEM16A, oprindeligt identificeret fra luftvejs-epitelceller, er involveret i udviklingen af ​​ikke-småcellet lungekræft, der er typisk for epitelial lunge cancer.

i denne undersøgelse har vi vist, at ANO1 er stærkt overudtrykt i flere lungekræft cellelinjer og adenocarcinom humane vævsprøver. Silencing ANO1 undertrykker celleproliferation, migration og invasion, og væksten af ​​implanterede tumorer.