PLoS ONE: Nimotuzumab Forbedrer radiosensitivitet af kræftceller in vitro ved at hæmme Stråling-induceret DNA Damage Repair

Abstrakt

Baggrund

Nimotuzumab er et humaniseret IgG1 monoklonalt antistof specifikt rettet EGFR. I denne undersøgelse, vi havde til formål at undersøge de molekylære mekanismer i nimotuzumab i sine effekter af at øge kræftcelle radiosensitivitet.

Principal Finde

Lungekræft A549 celler og brystkræft MCF-7 celler blev forbehandlet med eller uden nimotuzumab i 24 timer før stråling til at udføre den klonogene overlevelse assayet og at analysere celle apoptose ved flow ctyometry. γ-H2AX foci blev påvist ved konfokal mikroskopi for at vurdere virkningen af ​​nimotuzumab på strålingsinduceret DNA-reparation. EGFR-aktivering blev undersøgt, og niveauerne af DNA-skader reparation relaterede proteiner i A549 celler på forskellige tidspunkt og på varierende doser eksponering efter nimotuzumab og strålebehandling blev undersøgt ved Western blot. Forbehandling med nimotuzumab reducerede klonogen overlevelse efter stråling, inhiberede strålingsinduceret EGFR aktivering og øget strålingsinduceret apoptose i både A549-celler og MCF-7-celler. Den foci af γ-H2AX 24 timer efter stråling steget betydeligt i Nimotuzumab forbehandlede celler med forskellige doser. Phosphoryleringen af ​​AKT og DNA-PKcs blev bemærkelsesværdigt inhiberet i kombinationsgruppen ved hver dosis punkt samt tidspunkt.

Konklusioner

Vores resultater viste, at den mulige mekanisme nimotuzumab øge kræft radiosensitivitet er, at nimotuzumab hæmmede stråling-induceret aktivering af DNA-PKcs gennem blokere PI3K /AKT-vejen, som i sidste ende påvirket DNA DSBs reparationen

Henvisning:. Qu Yy, Hu Sl, Xu Xy, Wang Rz, yu Hy, Xu Jy et al. (2013) Nimotuzumab Forbedrer radiosensitivitet af kræft celler in vitro ved at hæmme Stråling-induceret DNA Damage Repair. PLoS ONE 8 (8): e70727. doi: 10,1371 /journal.pone.0070727

Redaktør: Xianglin Shi, University of Kentucky, USA

Modtaget: Januar 4, 2013; Accepteret: 18 juni 2013; Udgivet: 16 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Qu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Strålebehandling spiller en stor rolle i behandling af flere kræftformer med. helbredende eller lindrende hensigt. Ca. 50% af patienter, der lider med kræft brug strålebehandling hele deres behandlingsproces. Men sygdommen kontrol og overlevelsesraten for patienter, som modtager strålebehandling alene eller i kombination med kemoterapi forbliver dismally lav. Traditionelle cytotoksiske midler med strålingssensibiliserende funktion ofte samtidigt øge normalt væv toksicitet, hvilket begrænser deres kliniske anvendelse, når det kombineres med strålebehandling. For nylig har terapier rettet mod epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) udviste fremragende anticancer effekter med mildt bivirkninger og væsentlig større cancer radiosensitivitet i prækliniske og kliniske undersøgelser [1], [2]. EGFR målrettede terapier kombineret med strålebehandling har været betragtet som en meget potentiel strategi for behandling af nogle cancere i epiteloprindelse

EGFR målrettede terapier består hovedsageligt af to fremgangsmåder:. 1) monoklonale antistoffer (mAb) der er rettet mod ekstracellulære domæne af receptoren i det ligandbindende region, nemlig cetuximab, nimotuzumab og panituzumab; eller 2) små molekyler, der inhiberer EGFR intracellulære tyrosinkinaseaktivitet, såsom gefitinib og erlotinib [3]. De fleste af disse midler er blevet grundigt undersøgt

in vitro

in vivo

i deres egenskab af at øge tumor radiosensitivitet. Ved at blokere EGFR-aktivering og dens nedstrøms signalering, såsom PI3K-AKT og RAS-MAPK pathways, disse anti-EGFR midler forbedre den cytotoksiske virkning af ioniserende stråling ved at inducere cellecyklus og apoptose og inhibering af celleproliferation, metastase og tumor angiogenese [ ,,,0],4], [5].

Nimotuzumab er et humaniseret IgG1 monoklonalt antistof, der blokerer EGF, TGF-α og andre ligander fra at binde til EGFR, samt hindre receptoren fra påføre dimerisering motiv [6]. Nimotuzumab tillægger EGFR med moderat bindingsaffinitet (Kd: 4.5 x 10

-8 m) sammenlignet med cetuximab, som har en bindingsaffinitet på mere end 10 gange højere [6]. Undersøgelser

in vitro

har vist, at nimotuzumab binder bivalent (dvs. med både antistof-arme til to mål samtidigt) til EGFR med moderat eller høj densitet, som er den stabile mønster bindingspunktet [7], [8]. I normale væv med lav EGFR densitet, nimotuzumab har mindre affinitet og binder EGFR med mindre aviditet, hvilket skåner de normale væv, herunder hud og slimhinde, af svær cytotoksicitet. Dette forklarer, hvorfor nimotuzumab er kendetegnet ved lette behandlingsrelaterede toksiciteter i klinisk anvendelse, mens der vises tilsvarende eller overlegne anticancer effekter i forhold til andre anti-EGFR monoklonale antistoffer. Som et lovende terapeutisk monoklonalt antistof, er nimotuzumab kombineret med stråling blev undersøgt udførligt i sin virkning af behandling af cancere af epitel oprindelse.

Nimotuzumab har vist sig selektivt at øge antitumor virkninger af ioniserende stråling af NSCLC-cellelinier med høj EGFR ekspression [9]. Desuden er en in vivo-undersøgelse i mus xenotransplantater transplanteret med en gliom-cellelinje viste, at både nimotuzumab og cetuximab øget radiosensitivitet af de transplanterede subkutane tumorer [10]. I kliniske fase II /III-forsøg, har nimotuzumab kombineret med strålebehandling opnået fremragende resultat i behandling lokalt avancerede hoved og hals kræft [11], [12]. Det forlyder, at hæmmer cetuximab strålingsinduceret EGFR nuklear translokation, og denne proces er forbundet med suppression af DNA-PKcs aktivitet [13], [14]. Andre undersøgelser har vist, at tyrosinkinaseinhibitorer kan forbedre radiosensitivitet ved at undertrykke cellulær kapacitet strålingsinduceret skade på DNA reparation [15], [16]. Disse resultater indikerer, at terapeutisk behandling med monoklonalt antistof kombineret med strålebehandling kan påvirke strålingsinduceret DNA beskadigelse respons. Men de underliggende mekanismer, som Nimotuzumab funktioner i strålingssensibilisering stadig undvigende. I denne undersøgelse, ved hjælp af to dyrkede kræftceller, vi havde til formål at undersøge potentielle molekylære mekanisme af nimotuzumab i styrkelsen cellulære radiosensitivitet af kræft.

Materialer og metoder

Celler, cellekultur og reagenser

Den humane NSCLC-cellelinie A549 og brystkræft cellelinien MCF-7 (tilvejebragt af Heilongjiang institut for kræftforskning, Harbin, Kina) blev opretholdt i RPMI 1640 (GIBCO) medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS ) (NQBB, Australien) under en fugtig atmosfære af 5% CO2 ved 37 ° C. Nimotuzumab blev leveret af Biotech Pharmaceutical Co. Ltd (Beijing, Kina).

Klonogen overlevelse assay

Eksponentielt voksende celler i 25 cm

2 kolber blev trypsiniseret, høstet, og tælles. De blev fortyndet serielt til passende tætheder og udpladet i tre eksemplarer med bestemte numre (forskellige celleantal efter dosis bestrålet. F.eks 200 celler pr kolbe for 2Gy, 500 celler til 4Gy, 1000 celler for 6Gy, 4000 celler for 8Gy, 10000 celler for 10Gy og 100 celler til kontrol.) i 25 cm

2 kolber indeholdende 5 ml dyrkningsmedium i fravær eller tilstedeværelse af 700 nM nimotuzumab. Fireogtyve timer efter inkubation blev cellerne eksponeret for 2, 4, 6, 8 og 10 Gy 4MV røntgen genereret af en højenergi lineær accelerator (Elekta synergi, Stockholm, Sverige) i en dosis på 3 Gy min

-1. Cellerne blev derefter vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) og dyrkes i medikamentfrit medium i 10-14 dage til at danne kolonier. Derefter blev kolonierne fikseret med methanol:acetic syre (10:01, v /v), og derefter farvet med krystalviolet. Kolonier indeholdende ≥ 50 celler blev talt. Den overlevende fraktion blev beregnet som: (gennemsnitligt antal kolonier) /(antal inokulerede celler × udpladningseffektivitet). Udpladningseffektivitet blev defineret som: (gennemsnitligt antal kolonier) /(antallet af inokulerede celler til kontrol, som ikke blev udsat for stråling med eller uden nimotuzumab). Dataene blev tilpasset til den klassiske single-hit multi-target model: SF = 1- (1-e

-D /D0)

N henlede dosis- overlevelseskurve, hvorfra parametre (D0, Dq, N og SF2), der repræsenterer den indre cellulære radiosensitivitet blev afledt. Følsomheden enhancement ratio (SER) blev beregnet som: (D

0 af stråling behandlede celler /D

0 af nimotuzumab kombineret med stråling behandlede celler)

Cell apoptose analyse

Celler behandlet med eller uden 700 nM nimotuzumab i 24 timer blev udsat for forskellige doser af stråling (0, 2, eller 8 Gy), og blev høstet ved 48 timer efter stråling til celleapoptose analyse. Ca. 1 x 10

6 celler i hver gruppe blev farvet med annexin V-FITC og propidiumiodid (PI) for apoptose analyse i overensstemmelse med producentens anvisninger (Beyotime, Kina). Celler blev derefter analyseret ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS, Calibur, BD, USA).

γ-H2AX foci detektion ved konfokal mikroskopi

celler dyrket på dækglas i seks-brønds plader blev behandlet med eller uden 700 nM nimotuzumab i 24 timer. Efterfølgende blev cellerne udstråles i varierende doser (1, 2, 4 eller 8 Gy) efterfulgt af inkubation i 24 timer. Bagefter blev cellerne fikseret med iskold 70% ethanol i 30 minutter, vasket 3 gange med PBS og blokeret med 3% BSA og 0,1% Triton-X100 i PBS i 30 min. Efter fjernelse af blokerende buffer blev celler inkuberet med 2-4 ug /ml γ-H2AX antistof konjugeret med FITC (Millipore, Billerica, MA) i blokerende buffer i 2 timer i mørke. De store antistoffer blev skyllet væk af PBS. Endelig blev 24 timer resterende γ-H2AX undersøgt ved konfokal mikroskopi (ZEISS, LSM700, Tyskland). For hvert datapunkt mindst 300 kerner blev evalueret.

Påvisning af EGFR-phosphorylering og DNA beskadigelse reparation relaterede proteiner ved Western-blot

A549-celler og MCF-7 celler blev behandlet med eller uden 700 nM nimotuzumab i 24 timer og blev bestrålet med 4 Gy røntgen at detektere EGFR phosphorylering. Behandlede celler blev høstet ved 2 timer efter stråling. A549-celler behandlet som beskrevet ovenfor, blev høstet ved 0,5, 1, 2 eller 6 timer efter stråling til dynamisk analyse af DNA beskadigelse reparation relaterede proteiner. Samme mængder af A549-celler med samme behandlingsplan blev bestrålet med forskellig dosis (0, 1, 2, 4, 6Gy), inkuberet i 2 timer, derefter høstet. Efterfølgende blev cellepellets behandlet med lysepuffer (Beyotime, Kina), 1 mM PMSF (Beyotime, Kina) og 1-protease inhibitor cocktail tablet (Roche anvendt videnskab, Mannheim, Tyskland) pr 10 ml opløsning blev tilsat, og totale proteiner blev isoleret . Lige store mængder proteiner (30 ug) blev adskilt på 8% SDS-PAGE-geler og derefter overført til PVDF-membraner. Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk i TBS-T20 i 1 time ved stuetemperatur og efterfølgende inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Efter vask tre gange med TBST blev membranerne inkuberet med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer (Zhongshan, Kina) i 1 time. Blottene blev udviklet af kemiluminescensdetektion kit til HRP (BI, Isreal) og visualiseret med et chemiluminescens imaging system (FLuorchemFC2, Alpha Innotech, US)

De primære antistoffer blev fortyndet som følger:. Anti-EGFR og anti -pEGFR (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-DNA-PK (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-pDNA-PK (Abcam, Cambridge, UK), 1:500; anti-Ku70 (Epitomic, Burlingame, Californien), 1:4000; anti-ATM (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-Patm (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-AKT (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-Pakt (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-γ-H2AX (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; og anti-β-actin (Zhongshan, Beijing, Kina), 1:2000.

Statistisk analyse

Data blev analyseret ved hjælp af parret t-test-og beskrives som middel ± SD. En forskel blev betragtet som signifikant, hvis P. 0,05

Resultater

Nimotuzumab behandling forbedret cellulær radiosensitivitet i klonogene overlevelse assay

For at undersøge, om nimotuzumab forbedret anticancer effekt af ioniserende stråling, udførte vi den klonogene overlevelse assay med A549 og MCF-7-celler (figur 1; radiobiologiske parametre blev opsummeret i tabel 1). Vi fandt ikke, at klædningen effektiviteten af ​​både A549 og MCF-7 celler faldt betydeligt efter forbehandling med nimotuzumab (P: 0,256, og 0,063 henholdsvis vist som figur 1B). Dosis-overlevelseskurver indikerede, at forbehandling med nimotuzumab undertrykte klonogene overlevelse af både A549-celler og MCF-7 efter varierende doser af stråling (figur 1A). Dosis enhancement forholdet var 1,36 og 1,47, henholdsvis som antydede, at nimotuzumab var mere effektivt i strålingssensibiliserende MCF-7-celler end A549-celler in vitro.

(A) A549-celler og MCF-7-celler blev præinkuberet med og uden 700 nM nimotuzumab i 24 timer, og derefter udstrålede med doser af ioniserende stråling mellem 2 og 10 Gy. After10-14 dage blev kolonierne farvet og talt. Overlevende fraktioner blev beregnet på basis af kolonitællinger og udpladningseffektiviteten. Data blev vist som gennemsnit ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. Blev fittet med SF = 1- (1-e

-D /D0)

N. (B) Plating effektivitet A549-celler og MCF-7-celler. Udpladningseffektivitet = (gennemsnitlig antal kolonier) /(antallet af inokulerede celler, som blev forbehandlet med eller uden nimotuzumab). Der var ingen statistiske betydninger mellem nimotuzumab forbehandlet A549 /MCF-7 celler og kontrol, med P:. 0,256, og 0,063 henholdsvis

Nimotuzumab hæmmede EGFR aktivering efter stråling

for at bevise kapacitet nimotuzumab inhibering EGFR aktivering blev phosphorylering af EGFR på Tyr1173 detekteret ved western-blot (figur 2). Som det viste, stråling med 4Gy induceret aktiveret phosphorylering af EGFR i både A549 og MCF-7-celler. Med forbehandlingen af ​​nimotuzumab, niveauerne af phosphoryleret EGFR faldt betydeligt efter stråling.

A549-celler og MCF-7-celler blev forbehandlet med eller uden nimotuzumab i 24 timer før bestråling med 4 Gy. Celler blev høstet og lyseret ved 2 timer efter stråling. Lysaterne undergik elektroforese og blev inkuberet med antistoffer mod EGFR, pEGFR og β-actin. De kolonne diagrammer nedenfor er kvantificering af de bands baseret på densitometrisk analyse. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af relative massefylde forhold til kontrollen. * Angiver signifikant forskel (P 0,05).

Nimotuzumab øget celle apoptose induceret af stråling

celleapoptose satser blev rutinemæssigt analyseret for at evaluere anticancer virkninger af stråling. I denne undersøgelse apoptosen satser af A549 og MCF-7 behandlet med nimotuzumab var højere end kontrolceller efter forskellige doser af stråling (figur 3). Resultatet viste, at nimotuzumab forøgede cytotoksiske virkning af ioniserende stråling ved at inducere celle apoptose. Salg

Celler blev forbehandlet med og uden 700 nM nimotuzumab i 24 timer, og derefter bestrålet med 0, 2 eller 8 Gy. Fyrre otte timer efter stråling blev cellerne høstet og celle apoptose blev undersøgt ved flowcytometri. En repræsentant for tre uafhængige forsøg i de to celler er vist (A, C). Sammenligninger af apoptose satser af A549-celler og MCF-7 mellem niomtuzumab forbehandlet og kontrolgrupper er vist (B, D). Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af apoptose sats. * Angiver signifikant forskel (P 0,05).

Forbehandling af nimotuzumab steget γ-H2AX dannelse i respons på stråling

kvantificering af γ-H2AX dannelse er en vigtig indikator for stråling -induceret DNA dobbelt-strengbrud (DSB’er). For at vurdere effekten af ​​kombineret behandling med nimotuzumab og stråling i DNA-reparation, vi kvantificeret den resterende γ-H2AX foci 24 timer efter stråling med varierende doser af konfokal mikroskopi. Vi observerede, at forbehandling med nimotuzumab alene ikke øger γ-H2AX generation i både A549 og MCF-7 celler i forhold til kontrol, mens strålebehandling med forskellige doser i begge cellelinjer forbehandlet med nimotuzumab forlod mere γ-H2AX dannelse efter 24 timer end celler med stråling alene (figur 4).

A549 og MCF-7-celler blev forbehandlet med eller uden 700 nM nimotuzumab i 24 timer, og derefter blev bestrålet med 1, 2, 4 og 8 Gy. Fireogtyve timer efter stråling celler blev fikseret og inkuberet med γ-H2AX antistof konjugeret med FITC. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af resterende γ-H2AX foci per celle. For hvert datapunkt mindst 300 kerner blev evalueret. * Angiver signifikant forskel (P 0,05). Billederne nedenfor er repræsentative kerner med γ-H2AX foci under immunofluorescent mikroskopi, behandlet med 1Gy eller 1Gy kombineret med nimotuzumab.

Forbehandling af nimotuzumab reguleret DNA skader reparation som reaktion på stråling i A549 celler

Stråling-induceret DNA-beskadigelse reparation er kendetegnet ved ekspressionen af ​​multiple DNA-beskadigelse reparation beslægtede proteiner. Vi har derfor undersøgt nogle af det beslægtede protein udtryk og deres aktiverede former under kombineret behandling med nimotuzumab og stråling i A549-celler.

første har vi sammenlignet den kinetiske ændring af disse DNA beskadigelse reparation relaterede proteiner i nimotuzumab behandlede og ikke- behandlede celler efter udsættelse for stråling (se figur 5). I dette eksperiment, γ-H2AX i begge cellegrupper viste en tendens til tidsafhængig stigning. I nimotuzumab forbehandlet gruppe, niveauerne af γ-H2AX var signifikant højere end i kontrolgruppen på 1 time, 2 timer og 6 timer (figur 5B). DNA-PKcs, Ku70, ATM og AKT efter strålebehandling ændrede ikke på hvert tidspunkt i både kontrol- og Nimotuzumab forbehandlede grupper. den phosphorylerede form af DNA-PKcs i Thr2609 og den phosphorylerede form af AKT på Thr308, som aktiveres former af de to proteiner induceret af stråling, blev imidlertid udtrykt ved lavere niveauer i nimotuzumab forbehandlet gruppe end i kontrol på forskellige tidspunkter . Desværre begge niveauerne phospho-DNA-PKcs og Phospho-AKT manglede den regelmæssige stigende tendens i korrespondance med tiden (figur 5C, D). Den phosphorylerede form af ATM på Ser1981 viste lidt ændring i både gruppe, såvel som på forskellige tidspunkter (figur 5E).

(A) A549-celler forbehandlet med eller uden nimotuzumab i 24 timer blev bestrålet med 4 Gy . Celler blev høstet og lyseret ved angivne tidspunkter. Lysaterne ved angivne tidspunkter undergik elektroforese og blev inkuberet med antistoffer mod γ-H2AX, AKT, Pakt, DNA-PKcs, pDNA-PKcs, Ku70, ATM, Patm og β-actin. (B-E) Kvantificering af bånd baseret på densitometrisk analyse. Resultaterne er relativ massefylde forholdet til ubestrålet kontrol. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. * Angiver signifikant forskel (P 0,05).

andet at undersøge, om at øge dosis af stråling udløst mere ekspression af DNA beskadigelse beslægtede proteiner, og hvis nimotuzumab kunne inhibere aktiveringen af ​​DNA-PKcs og AKT, vi udstrålede nimotuzumab forbehandlet A549 celler og kontrol celler med varierende doser. γ-H2AX viste en dosisafhængig stigning i både kontrol- og nimotuzumab forbehandlet gruppe, og nimotuzumab forbehandling resulterede i en signifikant stigning af γ-H2AX (figur 6B). Niveauer af DNA-PKcs, Ku70, ATM, Patm og AKT ændrede ikke på trods af den intense dosis af stråling og forbehandling med nimotuzumab (figur 6A, E). pDNA-PKcs og Pakt var naturligvis lavere i nimotuzumab forbehandlet gruppe end i kontrolgruppen, men viste ingen væsentlig variation i hver dosis i nogen af ​​grupperne (figur 6C, D).

(A) A549 celler forbehandlet med eller uden nimotuzumab blev bestrålet med angivne doser. To timer efter stråling celler blev høstet og lyseret. Lysaterne undergik elektroforese og blev inkuberet med antistofferne beskrevet i figur 5. (B-E) Kvantificering af bånd baseret på densitometrisk analyse. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. * Angiver signifikant forskel (P 0,05).

Diskussion

Selvom monoterapi af anti-EGFR mAbs udviser en begrænset effekt i kliniske forsøg, deres kombination med strålebehandling og /eller kemoterapi har vist lovende resultater i behandling af fremskreden planocellulært carcinom i hoved og hals, ikke-småcellet lungekræft og tarmkræft [17] – [22]. Succesen af ​​denne multikombinerbare terapi er stærkt tilskrives sensibiliserende virkning af anti-EGFR mAb’er mod ioniserende stråling og /eller cytotoksiske midler. Nimotuzumab, et humaniseret anti-EGFR mAbs, har vist sin unikke evne til at generere strålingssensibiliserende effekter, mens der forårsager milde toksiciteter af normale væv i kliniske forsøg [8], [12]. Selvom anticancer effekter af nimotuzumab er blevet bekræftet in vitro og in vivo [23], at de potentielle molekylære mekanismer i nimotuzumab radiosensitize kræftceller stadig nødt til at blive udforsket.

I den foreliggende undersøgelse, vi bekræftet, at radiosensitivitet af kræft cellelinjer kunne forbedres ved forbehandling med nimotuzumab. Da nimotuzumab alene ikke påvirkede kolonier dannelse, det spillede en sensibiliserende, men ikke additive rolle, når det kombineres med stråling. Som mål for nimotuzumab, aktivering af EGFR induceret af stråling var naturligvis inhiberet som det var forventet. demonstrerede vi desuden, at nimotuzumab øget stråling-induceret apoptose af de to cellelinier. Crombet-Ramos

et al

[23] rapporterede, at A431 celler inkuberet med imotuzumab i 48 h ikke udviste tydelige apoptotiske tegn og konkluderede, at agenten handlede primært som cytostatiske stedet for cytotoksiske. I vores undersøgelse, vi fandt imidlertid, at nimotuzumab øget apoptose på både A549-celler og MCF-7-celler fundamentalt, hvilket antydede, at nimotuzumab som et terapeutisk middel kunne inducere celle apoptose mindste in vitro. Som stråling kombineret med nimotuzumab resulterede i en synergistisk virkning på cellulær apoptose større end summen af ​​apoptose induceret af nimotuzumab og ved stråling alene (dvs. en 1 + 1 2 effekt), er det påvist, at nimotuzumab har kapacitet til strålingssensibiliserende disse cancerceller . Desuden i vores undersøgelse, selvom nimotuzumab øget apoptose af cancerceller, det ikke underminere kolonier formation. Vi spekulerede at de klonogene celler af cancere var mere resistente og vanskeligt at blive påvirket af nimotuzumab, og det var de proliferative celler, som blev induceret til apoptose ved nimotuzumab.

Baseret på ovenstående resultater, vi derefter fokuseret på potentielle molekylære mekanismer i Nimotuzumab s strålingssensibiliserende virkning. Det er velkendt, at kræft radiosensitivitet hovedsagelig er bestemt af kapaciteten af ​​cancerceller til effektivt at reparere stråling-induceret DNA skader. Derfor vi hypotese, at nimotuzumab kunne radiosensitize kræftceller ved at påvirke DSBs reparation mekanisme. γ-H2AX dannelse er en følsom markør for DSB-læsioner og anvendes rutinemæssigt til at vurdere cellulær radiosensitivitet. Mere γ-H2AX foci betyder flere DSBs ikke repareres. Den kvantificerede detektion af γ-H2AX ved immunfluorescens og immunoblot viste, at flere DNA DSBs blev ikke repareres efter stråling i Nimotuzumab forbehandlede celler, som i sidste ende førte til celleapoptosen, og viste en lineær korrelation med strålingsdoser eller post-stråling tid.

Dernæst undersøgte vi, hvordan nimotuzumab hæmmede strålingsinduceret DSBs reparation. DNA-PKcs er en kritisk protein involveret i ikke-homolog endesammenbinding reparation af DNA DSB’er. Aktiveringen af ​​DNA-PKcs direkte modulerer reparation af stråling-induceret DSBs. I den foreliggende undersøgelse havde ekspressionsniveauet for DNA-PKcs efter stråling ikke ændre, om forbehandlet med nimotuzumab eller ej. Men den phosphorylerede form af DNA-PKcs i Thr2609, som er relateret til DSB-reparation og cellulær radiosensitivitet, stærkt forhøjet efter stråling, hvilket indikerer en radioresistent attribut af A549-celler og faldt betydeligt i nimotuzumab forbehandling gruppen. Derudover undersøgte vi en af ​​de regulatoriske subunits af DNA-PK kompleks Ku70. Desværre fik Ku70 ikke ændre i nogen af ​​grupperne. Kollektivt, vores resultater viste, at nimotuzumab hæmmede funktion af DNA-PKcs i DSB reparation ved at undertrykke sin aktivering.

Toulany

et al

[24] rapporterede, at EGFR-PI3K-AKT vej blev involveret i reguleringen af ​​DNA-PKcs. De foreslog, at enten EGFR-tyrosinkinaseinhibitoren eller AKT-inhibitor ophævet strålingsinduceret DNA-PKcs phosphorylering ved Thr2609 i K-RAS muteret tumorceller. Da Nimotuzumab blokke EGFR nedstrøms signalering, er det muligt at nimotuzumab modulerer phosphorylering af DNA-PKcs gennem undertrykke aktivering af AKT. Vi fandt, at den phosphorylerede form af AKT på Thr308, som er den aktiverede form er forbundet med celleoverlevelse, stærkt forøget i udstrålede A549-celler, men ligner phospho-DNA-PKcs (Thr2609), var fuldstændig inhiberet efter forbehandling med nimotuzumab. Konkluderede vi, at nimotuzumab medierede dens virkninger på DNA reparation veje via undertrykkelse af PI3K-AKT vej. Tilbage til celleapoptosen analyse, bekræftes det, at inhibering af AKT aktivering med nimotuzumab er relateret til fremme af celle apoptose. Den potentielle mekanisme er via hæmme aktiveringen af ​​DNA-PKcs, reparation af stråling-induceret DNA DSBs blev forhindret, som i sidste ende induceret celle apoptose.

ATM, en vigtig protein, der deltager i stråling-induceret DNA-skader reparation, var undersøgt for at identificere, om dens udtryk eller aktivitet kunne blive påvirket af forbehandling med nimotuzumab. ATM og dens aktiverede form, den phosphorylerede form af ATM på Ser1981, ændrede sig ikke, om forbehandlet med nimotuzumab eller ej. Begge DNA-PKcs og ATM phosphorylere γ-H2AX efter ioniserende stråling [24], [25]. I vores undersøgelse, idet aktiveringen af ​​DNA-PKcs efter strålebehandling blev inhiberet af nimotuzumab gennem blokering PI3K-AKT pathway kan phosphorylering af H2AX skyldes aktiviteten af ​​ATM.

Sammenfattende vi viste, at anti-EGFR mAb nimotuzumab radiosensibiliserer kræftceller ved at inducere mere apoptose og unrepaired DSBs. Den underliggende mekanisme af denne strålingssensibiliserende virkning er relateret til hæmning af DNA-PK involveret DNA DSBs reparation via blokering af PI3K-AKT pathway. Da nimotuzumab er et godkendt anti-EGFR mAb til terapeutisk brug i kræftbehandling, udforske de præcise anticancer mekanismer nimotuzumab vil bidrage til at øge effektiviteten af ​​dette middel i klinisk praksis.