PLoS ONE: Selektiv Beskyttelse af humant levervæv i TNF-Målretning af kræft i leveren ved Forbigående Udtømning af adenosin Triphosphate

Abstrakt

Baggrund

Tumor nekrose faktor alfa (TNF) er i stand til til at dræbe kræftceller via receptor-medieret celledød kræver adenosintriphosphat (ATP). Klinisk brug af TNF hidtil i høj grad begrænset af sin dybe hepatotoksicitet. For nylig blev det konstateret i det murine system, særlig beskyttelse af hepatocytter mod TNF s skadelige virkninger kan opnås ved fructose-medieret ATP depletion deri. Før ansætte dette ganske attraktive princip valg i en første kliniske forsøg, vi her omfattende undersøgt den indbyrdes afhængighed mellem ATP udtynding og TNF hepatotoksicitet i både

in vitro

ex vivo

eksperimenter baseret på brugen af ​​primær patient væv materialer.

Metoder

primære humane hepatocytter, og både ikke-tumorform og tumorform patient-afledte primære levervæv skiver blev brugt til at belyse fruktose-induceret ATP depletion og TNF-induceret cytotoksicitet.

Resultater

PHH samt vævssnit fremstillet ud fra ikke-maligne humane lever eksemplar gennemgår en fruktose-medieret ATP udtynding blev begge påvist at være beskyttet mod TNF-induceret celledød. I modsætning hertil på grund af tumor-specifikke overekspression af hexokinase II, som pålægger en dybtgående bypass på hepatocytic-specifikke fructose katabolisme, var dette ikke tilfældet for humane tumorform levervæv.

Konklusion

Normalt humane levervæv kan beskyttes transient mod TNF-induceret celledød ved systemisk forbehandling med fructose anvendes i ikke-giftige /fysiologiske koncentrationer. Selektiv TNF målretning af primære og sekundære tumorer i leveren ved forbigående og specifik udtømning af hepatocytic ATP åbner en ny klinisk avenue for TNF-baserede behandling af leverkræft

Henvisning:. Weiland T, Klein K, Zimmermann M, Speicher T, Venturelli S, Berger A, et al. (2012) Selektiv beskyttelse af humant levervæv i TNF-Målretning af cancere i lever ved forbigående Udtømning af adenosintriphosphat. PLoS ONE 7 (12): e52496. doi: 10,1371 /journal.pone.0052496

Redaktør: Johannes Haybaeck, Medical University Graz, Østrig

Modtaget: August 9, 2012; Accepteret: November 19, 2012; Udgivet: 18. december 2012 |

Copyright: © 2012 Weiland et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af ICEPHA tilskud 2009-09, Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB /TRR77), Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning (BMBF, # 0.315.755) og Robert Bosch Foundation, Stuttgart, Tyskland. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

systemisk brug af højpotente antineoplastisk cytokin tumornekrosefaktor (TNF) er stærkt begrænset

på grund af konstateringen af, at TNF er pleiotrope funktioner fremkalde alvorlige systemiske bivirkninger

, især høj kvalitet levertoksicitet [ ,,,0],1], [2]. Derfor blev systemisk administration af TNF erstattet i udvalgte tumor enheder med succes af regimener kun anvender lokale perfusioner af ekstremiteter med TNF [3], [4]. Men sådanne strategier forblev undvigende for isolerede hepatisk perfusion (IHP), der anvendes til behandling af maligne sygdomme i leveren [5] – [8].

For nylig, TNF-induceret hepatocytic apoptose blev anerkendt som en yderst ATP- afhængig proces i en murin model [9]. Desuden er der tegn på, at fruktose fører til ATP udtynding udelukkende i hepatocytter. Som en funktionel konsekvens, hepatocytter (i modsætning til deres ondartede modstykker) udviser beskyttelse i retning TNF-induceret apoptose [9], [10]. Denne biologiske forskel mellem hepatocytter og maligne celler blev tilskrevet en transformation-relateret overekspression af hexokinase II (HKII), der fører til en bypass af hepatocytic-specifikke fructose katabolisme [10]. I tilstedeværelse af fruktose, de kritiske lever-specifikke enzymer ketohexokinase (KHK) og aldolase B (AldoB) etablere en reversibel, hepatocytic-specifikke ATP fælde [11]. Overekspression af HKII omgår denne vask

så

fructose omdannes fortrinsvis til fructose-6-phosphat og metaboliseres via “muskel-type” glycolyse uden at påvirke cellulære ATP-niveauer (afbildet i detaljer i figur 1).

Forøget ekspression af hexokinase II (HKII) i tumorceller resulterer i en muskel-typen metabolisme af fructose (nedre del af billedet), der ikke omfatter nogen udtømning eller sætter sig fast ATP. Derimod hepatocytter (øverste del af billedet) udnytte enzymerne ketohexokinase (KHK) og aldolase B (aldoB) og derved en lever-typen metabolisme af fruktose. Som et resultat heraf er der en meget hurtig ATP-afhængige omdannelse af fruktose via KHK til fructose-1-phosphat virker som et phosphat sink dramatisk nedbringe cellulære niveauer af ATP.

På det molekylære niveau,

dette fruktose-medieret hepatocyt-specifikke beskyttende virkning mod TNF

er sandsynligvis opnås ved ADP nedbrydningsprodukter, der ophobes i form af adenosin. For nylig,

det blev vist, at adenosin provokerer en autokrin adenosin 3 ‘, 5’-cyklisk monophosphat respons

, negativt påvirker TNF-induceret aktivitet af c-Jun-N-terminal kinase (JNK) i et proteinkinase A -afhængig måde [12].

i vores undersøgelse, undersøgte vi muligheden for at overføre denne fremgangsmåde fra murine data til det menneskelige system med hensyn til fruktose-medieret forbigående ATP udtynding og dermed effektuere den selektive afvæbning af TNF destruktive hepatocytic egenskaber. Til dette formål har vi udnyttet (i) dyrkede primære humane hepatocytter (PHH) og (ii) præcisions-cut skiver af raske levervæv

versus

maligne humane lever væv afledt af patienternes lever resectates i en translationel e

x vivo

tilgang. Ud over tidligere gennemført murine eksperimenter, w

e var nu i stand til at oversætte fået kendskab til fruktose-medieret hepatisk beskyttelse i det menneskelige fysiologiske kontekst giver grundlag for fremtidig fase I /II kliniske studier

.

Materialer og metoder

Etisk erklæring

Kulturperler, primære humane hepatocytter (PHH) behandles fra frisk taget lever prøve opnået under leverkirurgi. Derfor behøver PHH ikke en cellelinje; PHH er primære celler. PHH fra forskellige donorer patienter blev leveret af T.S. Weiss med informeret patient samtykke med hensyn til at tage de prøver i henhold til retningslinjerne i og godkendt af velgørende statskontrollerede humant væv Cell Research Foundation, HTCR (for direkte information kan du gå til: https://www.htcr.de/english/supply.html)., Og ved A. Königsrainer og M. Schenk (Dpt for General, Visceral Transplant Surgery , Universitetshospital, Tuebingen, Tyskland) med informeret patient samtykke med hensyn til at tage prøverne, der er godkendt af den lokale etiske komité (Ethik-kommission an Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität und am Universitätsklinikum Tübingen /Etik provision af det medicinske fakultet den Eberhard-Karls-Universitet og University Clinic Hospital Tuebingen). Deltagerne gav deres skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse. Den Tübingen etiske komité godkendt denne godkendelsesproceduren og Tuebingen etiske komité havde ingen indvendinger mod denne undersøgelse. Human lever og lever tumor resectates blev opnået med informeret patient samtykke fra DPT. General, Visceral Transplant Surgery, University Hospital, Tübingen, Tyskland, i henhold til retningslinjerne i den lokale etiske komité. Deltagerne gav deres skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse (dvs. donation af kirurgiske eksemplar til Tübingen tumor og normalt væv bank). Denne proces blev dokumenteret ved at underskrive den respektive patientinformation. Den Tübingen etiske komité godkendt denne godkendelsesproceduren og Tuebingen etiske komité havde ingen indvendinger mod denne undersøgelse (Ethik-Kommission an Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität und am Universitätsklinikum Tübingen /Etik provision af det medicinske fakultet på Eberhard- Karls-Universitet og University Hospital Tuebingen). Ingen forskning blev udført uden for vores hjemland.

Cell kultur

Primære humane hepatocytter blev dyrket i DMEM suppleret med 100 U /ml penicillin /streptomycin (Serva, Heidelberg, Tyskland), 18,8 ug /ml hydrocortison (Merck, Darmstadt, Tyskland) og 1,68 mU /ml insulin (Novo Nordisk, Bagsværd, Danmark). Tumorcellelinier blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt kalveserum. Alle celler blev dyrket i en fugtig inkubator med 37 ° C og 5% CO

2. HepG2 blev opnået fra ATCC, Hep3B og PLC /PRF /5 blev opnået fra ECACC og HuH7 blev opnået fra Riken Gene Bank. Cell identiteter blev testet ved DNA-typebestemmelse (DSMZ, Braunschweig, Tyskland). Alle celler blev testet til at være negativ for forurening med mycoplasma.

Precision-cut væv udskæring

Slicing af vævsprøver startede inden for en time af resektion på en vibratome VT1200S (Leica, Wetzlar, Tyskland) i iskold oxygen-mættet Krebs-Henseleit puffer (KHB) indeholdende 25 mmol /l glucose (Merck, Darmstadt, Tyskland), 25 mmol /l NaHCO

3 og 10 mmol /l HEPES (Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland) efter opbevaring i Custodiol (Franz Köhler Chemie, Alsbach, Tyskland) [21]. Skiver blev inkuberet i iltet Williams E-medium indeholdende 25 mmol /l glucose og 50 ug /ml gentamycin (Lonza Bioscience, Verviers, Belgien) i en iltet atmosfære (80% ilt, 5% CO

2).

Stoffer

rekombinant human TNF alfa blev købt fra Innogenetics (Gent, Belgien). Fructose og ActinomycinD (ActD) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Tyskland).

Behandling af celler og humane vævssnit

Celler og skiver blev forbehandlet med 50 mM fructose i 30 minutter og med 1 ug /ml ActD 15 min inden administration af 100 ng /ml TNF. Caspase assays blev udført efter 8 timer, LDH frigivelse og cytokeratin 18-spaltningsprodukter assays blev udført 24 timer efter TNF-behandling.

Cytotoksicitetsassays

Procentdelen af ​​lactatdehydrogenase (LDH) frigivelse blev bestemt ved anvendelse af LDH Mono-P assay (Analyticon, Lichtenfels, Tyskland) beregnet som forholdet supernatant /(supernantant + lysat). I vævssnit, idet mængden af ​​LDH frigivet i supernatant blev bestemt og normaliseret til proteinindholdet i enkelte skiver. Caspase aktiviteter blev bestemt ved inkubation med 50 pM substrat

N

acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-aminomethylcoumarin (Ac-DEVD-AMC; Biomol, Hamburg, Tyskland) i assaybuffer (50 mM HEPES , pH 7,4, 1% saccharose, 0,1% CHAPS, 10 mM DTT). Substratet spaltning blev målt kinetisk ved spektrofluorimetri. Caspaseaktivitet bestemtes som hældningen af ​​de resulterende lineære regressioner og udtrykt i arbitrære fluorescensenheder minuttet. Cytokeratin 18-spaltning blev bestemt i supernatanten fra vævssnit ved brug af M30 CytoDEATH ELISA-kit (Peviva, Bromma, Sverige) ifølge producentens instruktioner.

ATP bestemmelse

ATP-indholdet blev målt under anvendelse af den CellTiter-Glo Luminescent Cell levedygtighed Assay (Promega, Mannheim, Tyskland).

Kvantitativ realtids-PCR

Højkvalitets total RNA (0,5 ug) blev revers transkriberet under anvendelse af Reverse Transcription Kit og tilfældig hexamerer (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. mRNA-ekspression blev målt ved anvendelse TaqMan 7500 eller 7900HT fra Applied Biosystems under anvendelse af specifikke predeveloped assays for aldolase B (Hs01554887_m1), hexokinase II (Hs00606086_m1) og ketohexokinase (Hs00240827_m1) versus standardkurver af pCMV6-XL vektorer indeholdende cDNA’er af de tilsvarende gener (indkøbt fra Origene, Rockville, USA). 18S RNA (4.308.329, Applied Biosystems) blev brugt til normalisering.

Statistik

Eksperimenter blev udført i henhold til tilgængeligheden af ​​prøver og gengivet mindst 5 gange. Alle data er afbildet som gange ændring til kontrol, som er sat til 1. Fejlsøjler indikerer gennemsnit ± SEM. Statistiske forskelle bestemtes ved en uparret t-test. Alle statistik blev beregnet ved anvendelse af programmet GraphPad Prism 4.01 (GraphPad Software Inc.) og ap værdi. 0,05 blev betragtet som værende signifikant

Resultater og Diskussion

Forbigående udtynding af cellulære ATP opnået i primære, humane hepatocytter ved hjælp af fysiologiske koncentrationer af fructose

Når sammenlignet med ubehandlede kontroller, ATP-koncentrationen af ​​PHH

viste sig at være nedsat i en koncentrationsafhængig måde

efter 30 minutters inkubation med fructose , udviser en gennemsnitlig reduktion på 30% af kontrol ved en koncentration på 50 mM (figur 2A, længst til højre datapunkt, udarbejdelse af seks humane donorer). Kinetisk blev ATP fundet at være udtømt inden for 5 min (figur 2B) til en gennemsnitlig mindst ~ 40% sammenlignet med ubehandlede kontroller. Denne ATP udtynding var spontant reversible som set af stigningen i ATP-indholdet til 120 min og derefter (figur 2B, udarbejdelse af otte menneskelige donorer). Således cellulære energilagre af hepatocytter undergik en konstant opsving i løbet af de næste par timer forlader et forbigående udtynding vindue. Vigtigere er det, i løbet af fruktose-medieret forbigående udtynding af cellulære ATP, vi fandt ikke nogen indflydelse på hepatocytic levedygtighed som indikeret ved fravær af nogen væsentlig stigning i LDH frigivelse før og efter påbegyndelse af fruktose behandling (figur 2C, indsamling af data fra fire humane donorer ). Notatet har enhver dyrkning af pHHS uden for vores observationstid på 1440 min (dvs. 24 timer) vist sig at resultere i en betydelig stigning i LDH frigivelse til cellekultursupernatanter (vores upublicerede resultater), som angiver en dyb procentdel af opløste pHHS ud 24 timer tærsklen. Derfor “langsigtede” resultater vedrørende PHH levedygtighed ud over 24 timer er ikke muligt i denne sammenhæng. Samtidig vores videre grundlæggende karakterisering af PHH kulturer også har vist, at ATP indholdet af disse primære celler falder langsomt allerede inden for de første 24 timers test. Derfor er det ikke muligt at bibeholde de samme ATP-niveauer (100%; målt på start /initiering af disse eksperimenter) i hele 24 timers PHH dyrkning. den dokumenterede genvinding af op til 60% af den oprindelige ATP niveau uden væsentlig frigivelse af LDH viser imidlertid, at virkningen af ​​fructose på ATP-niveauer er meget reversibel, og at hepatocytter er i stand til at klare denne forbigående fald i cellulær ATP inden for et begrænset række dyrkningstid (dvs. inden for 24 timers tidsinterval).

(a-C) PHH af humane donorer blev behandlet med stigende koncentrationer af fructose (a) eller behandlet med en fast koncentration på 50 mM fruktose (B); ATP-indholdet blev bestemt efter 30 minutter (A) eller ved varierende tidspunkter som angivet (B); blev bestemt LDH frigivelse af PHH efter inkubation med 50 mM fruktose efter angivne tidspunkter (C). Data er givet som middelværdi ± SEM.

Derfor indførelse hepatisk beskyttelse fremad til TNF i isoleret hepatisk perfusion (IHP) synes at være mulig fra et klinisk synspunkt. I en undersøgelse foretaget af Cortez-Pinto

et

al

., Raske frivillige samt patienter med ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH) var bolus-injektion med fruktose. Efterfølgende blev ATP depletion løbende overvåget ved NMR-spektroskopi i op til 60 min. Både raske frivillige såvel som NASH patienter blev fundet at udvise en hurtig (ved 12 min efter fructose injektion) og forbigående fald af cellulær ATP (restaurering af hepatiske ATP stores detekteres ved 60 minutter efter fructose injektion) [13]. Derfor dette arbejde ved Cortez-Pinto

et

al

. vil være medvirkende til at overvåge både tidsforløbet og omfanget af ATP udtynding i fremtiden fase I /II kliniske forsøg skal udføres på patienter, der udviser primære og sekundære kræft i leveren.

Også andre grupper observeret en sådan hurtig nedbrydende virkning på ATP inden for 30 min, når en dosis på op til 250 mg fructose /kg legemsvægt blev anvendt i raske frivillige. I overensstemmelse med vores eksperimentelle resultater, blev der ikke skadelige virkninger på leveren (f.eks, med hensyn til forhøjede transaminaser) beskrevet for sådanne fruktose-loading procedurer [13] – [17]

opregulering af hexokinase II og ophævelse af. hepatisk-typen fructose metabolisme i leveren tumorvæv

det blev for nylig vist i hepatiske tumorcellelinier, der under processen med malign transformation en dyb opregulering af hexokinase II (HKII) forekommer som kunne forklare

at den fysiologiske fænomenet hepatisk ATP fældefangst er omgået i tumor celler

[10]. For yderligere at undersøge denne mekanisme vi brugte frisk resektion eksemplarer af humane lever væv, dvs. celler, som ikke er omfattet af eventuelle artefakter forbundet med processen med immortalisering. Sammenligne de transkriptionelle niveauer af HKII, AldoB, og KHK, blev fundet gennemsnitshøjden af ​​HKII transkription øges 7,6 gange i humane levertumorer i sammenligning med ikke-tumor-primære humane levervæv bliver normaliseret til faktor 1 (tabel 1). I modsætning hertil blev der fundet AldoB og KHK reduceres i størstedelen af ​​de undersøgte tumorvæv og tumorcellelinjer (gennemsnitlig fold ændringer 1 i sammenligning med ikke-tumor-primære humane levervæv bliver normaliseret til faktor 1) (tabel 1). Ifølge Warburg hypotesen om erhvervede ændringer i stofskiftet under progression af maligniteter, også kræft i human lever kan rumme til et miljø præget af mangel på næringsstoffer og ilt via en ændret metabolisk udstyr, navnlig i deres ikke-oxidative, dvs. glykolytisk energi metabolisme [18]. Derfor kan overekspression af HKII og dermed ændret fruktose metabolisme i primære eller sekundære kræft i leveren fungere som et værktøj til oprettelse af selektiv hepatisk beskyttelse i TNF-baserede tumor terapi ved hjælp af en supplerende fruktose administration.

TNF-cytotoksicitet er deaktiveret som fruktose-medieret ATP udtynding i PHH

Dernæst følger af nedsat ATP udtynding blev vurderet på niveauet af cytotoksicitet og caspase aktivering i humane primære hepatocytter. Som surrogatmarkør for membranintegritet, mængderne af LDH-frigivelse ved udsættelse for 100 ng /ml TNF alene (100 ng /ml; afbildet som -fruc i figur 2A) eller til en kombineret fructose forbehandling (15 minutter; + fruc i figur 2A ) /TNF behandling (50 mM fructose; 100 ng /ml TNF) blev bestemt i humane donorafledte PhH prøver. Igennem disse eksperimenter blev sensibilisering til TNF-induceret celledød forøget ved tilsætning af RNA-syntese inhibitor actinomycin D (ActD; 1 pg /ml), som blokerer opreguleringen af ​​eventuelle beskyttende overlevelse gener [19]. Ved undersøgelse af PHH afledt af reseceret humane lever prøver (figur 3A), blev niveauer af gennemsnitlig TNF-induceret LDH-frigivelse sig alle at være dæmpet markant i løbet af fruktose-loading. I overensstemmelse med denne funktionelle konstatering, morfologiske ændringer, som typisk for TNF-induceret apoptotisk tilstand af celledød (fx arketypiske cellekernekondensation og membranblæredannelse) viste sig også at være i det væsentlige ophævet ved fructose forbehandling (figur 3B). Som eksemplificeret på PhH flere apoptotiske fænomener som (i) kondensation af kerner (figur 3B, øverste venstre panel; Hoechst-farvning) samt (ii) blæredannelse af tumor-cellemembraner (figur 3B, sænkes venstre panel; fasekontrastmikroskopi) var klart detekteret som respons på TNF-behandling alene; imidlertid forbehandling med fructose førte enstemmigt til en næsten fuldstændig ophævelse af disse TNF-inducerede fænomener (figur 3B, øvre og nedre højre paneler). I tidligere arbejde, der allerede er det blevet påvist, at TNF-medieret aktivering af NF-kappa B i hepatocytter er ophævet i løbet af vores ordning med samtidig ansættelse af ActD eller CPT, indførelse af en generel hæmning på hepatisk transskription [20]. Derved behøver hepatocytter undergår en kombinatorisk behandling med enten ActD /TNF eller CPT /TNF ikke har nogen mulighed for at udtrykke tilstrækkelige mængder af anti-apoptotiske proteiner såsom cFLIP eller XIAP hvis udtryk kunne være udløst af TNF-induceret NF-kappa B- medieret signalering. Følgelig hepatocytter undergår fructose-medieret nedbrydning af ATP i nærvær af enten ActD /TNF eller CPT /TNF er ikke i stand til at modvirke inhibering af TNF-medieret hepatocytic død via aktivering af pro-overlevelse effektor veje, såsom aktivering af NF-kappa B signalering [20].

Cultured PHH af seks forskellige donorer blev behandlet med 400 ng /ml ActD alene eller i kombination med 100 ng /ml TNF og 50 mM fruktose som angivet. Cytotoksicitet blev bestemt efter 24 timer ved LDH-frigivelse-assay afbildet som gennemsnitlig gange ændring til ubehandlet kontrol bliver sat til 1 (*: p 0,05, uparret t-test). (B) Billeder af PHH blev taget 12 timer efter behandling og illustrere TNF-induceret apoptotiske kondensering af kerner i afhængighed af fruktose-belastning (+/- fruc) (øverste panel: Hoechst farvning) og membranblæredannelse (nederste panel: fasekontrast mikroskopi ). Hvid bjælke angiver 10 uM.

Ophævelse af TNF-induceret celledød under ATP nedbrydende forhold i humane lever væv

For at nærme sig vores spørgsmål i en patient-individuel indstilling over isolerede , dyrkede celler og cellelinjer,

ex vivo

præcision-cut væv skive teknologi blev tilpasset til vores eksperimentelle situation, [21]. Humant levervæv skiver med en diameter på 0,8 cm og en tykkelse på 200-300 um bestående af 10-15 cellelag, der huser -10

6 leverceller i gennemsnit, blev fremstillet ud fra frisk reseceret levertumorer og tilsvarende ikke- malignt levervæv, inkuberet i 24-brønds plader (figur 4B). Prøver af ikke-tumor-humant levervæv og humane tumorvæv var af forskellig oprindelse (se tabelform i figur 4A), herunder hepatocellulær carcinom (HCC), colorektal carcinom (CRC), pancreatisk carcinom (PC), og cholangiocarcinom (CC). Som levedygtighed kontrol, præcision-cut skiver af humant levervæv (A; venstre kolonne) og human tumorvæv (A; højre spalte) blev inficeret som standard med en GFP markør gen, der koder adenoviral vektor (ADV-GFP, MOI 1) en time efter Vævsskæreindretning at bestemme vitaliteten af ​​vævssnit dyrket i plader med 24 brønde. Kun levedygtige celler, udviser store områder bliver positiv for GFP maker genekspression i både tumorform og ikke-tumorform primære humane lever væv giver mulighed for infektion og efterfølgende udtryk for virus-kodet markørgener (note: vævssnit repræsenterer flere cellelag stykker af kirurgisk resektion væv (på et valgt udsnit tykkelse på 200-300 um beregner vi omkring 10-15 cellelag), og derfor er det teknisk ikke muligt at bringe alle dele af de respektive skiver i fokus (figur 4B))

typer af vævsprøver anvendt til generering af data i figur 4: hepatocellulært carcinom (HCC), kolorektal carcinom (CRC), pancreas carcinoma (PC), og cholangiocarcinom (CC) (A). Som eksempler, præcision-cut skiver af humant levervæv (B; venstre kolonne) og den menneskelige tumorvæv (B; højre kolonne) smittet med en GFP markør gen, der koder adenoviral vektor (ADV-GFP, MOI 1) en time efter væv skæring at bestemme vitaliteten af ​​vævssnit dyrket i plader med 24 brønde. Billeder blev taget 24 timer efter infektion til bestemmelse viral GFP-ekspression, som kun kan opnås i vitale områder af vævsprøverne (2,5 x /488 nm filter, hvide søjler sidestille 1000 pm)

Som surrogat. markører for cellulær toksicitet, (i) mængden af ​​væv-frigivet LDH pr mg protein, (ii) en ELISA-baseret bestemmelse af cytokeratin 18-spaltning korrelerer med caspaseaktivitet og (iii) den caspase-inducerede DEVD spaltning aktivitet pr mg væv protein blev vurderet.

Resultater opnået fra vævssnit viste den selektive karakter af fruktose-medieret beskyttelse mod TNF også for patient-afledte primære lever og lever tumorvæv. I primære ikke-maligne humant levervæv skiver, virkningen af ​​TNF-induceret hepatotoksicitet på (i) LDH-frigivelse (figur 5A), (ii) cytokeratin 18-spaltning (figur 5B), og (iii) DEVD spaltning (figur 5C) henholdsvis blev markant mindre i nærvær af fructose i næsten alle prøver. I modsætning hertil i primære humane levertumor vævsskiver, upon en identisk procedure forbehandling med fructose, i de fleste patientprøver ingen beskyttelse mod TNF-cytotoksicitet blev set, hvis ikke engang en sensibilisering i retning TNF-induceret celledød som demonstreret ved niveauer af (i) LDH-frigivelse (fig 5D), (ii) cytokeratin 18-spaltning (fig 5E), og (iii) DEVD spaltning (fig 5F), hhv. Resultaterne stammer fra humant væv passer godt ind resultater opnået ved at udnytte isolerede primære murine hepatocytter

in vitro

og en muse model af TNF-induceret leverskade

in vivo

af Latta

et

al

. [9]. TNF udøver en dyb hepatisk apoptose og leverskader kvantificeret ved DEVD spaltning samt ved LDH og plasma ALT frigivelse hhv. Men akut TNF-induceret hepatotoksicitet og leverskade i primære isolerede murine hepatocytter og mus, henholdsvis blev helt hæmmet af ATP udtynding med 50 mM fruktose [9].

væv skiver afledt af humane lever (A- C) eller lever tumorvæv (D-F) henholdsvis blev behandlet med 1 ug /ml ActD i kombination med 100 ng /ml TNF og 50 mM fructose som angivet. Cytotoksicitet bestemtes ved LDH-frigivelse-assay (A /C) og cytokeratin 18-spaltning (B /D) efter 24 timer og ved DEVD spaltning efter otte timer (C /F). Data er afbildet som betyder fold ændringer ubehandlet kontrol, bliver sat til 1 (*: p 0,05, uparret t-test)

Derfor er vi her viser for første gang

ex. vivo

, udkasterladning cellekultur artefakter og gnaver epiphenomena, at tillægsbehandling administration af fruktose selektivt beskytter primære humane levervæv

ex vivo

. I modsætning hertil er primære humane tumorvæv afledt af levermetastaser stort set ikke beskyttet

ex vivo

. Men på individuelle niveauer i nogle tumor patient-afledte vævsprøver, fruktose-loading undladt at beskytte hepatocytter. Det skal erindres, at endogene patologiske tilstande og lidelser i leveren kan ændre fructose metabolisme og følsomhed over for TNF. Desuden vævsdonorer der har modtaget neo-adjuverende behandlinger kunne føre til ændringer i tumor respons før den formodede udbrud af TNF-baserede terapeutiske regime

Analogt, i et sæt af humane lever tumorceller -. HepG2 ; Hep3B; HuH7 og PCL /PRF /5- hverken en ATP nedbrydende virkning blev induceret ved forbehandling med fructose (figur 6A) eller nogen fructose-medieret beskyttelse, dybt TNF-induceret apoptose kunne opnås (figur 6B). Selvom følsomhed over for TNF bestemmes ved hjælp af LDH-frigivelse-assay var variabel blandt de udnyttede tumorcellelinier HepG2; HepB3; HuH7 og PLC /PRF 5, ingen begrænsning af LDH frigivelse i tilstedeværelse af 50 mM fruktose blev givet.

De hepatiske tumorcellelinier HepG2, Hep3B, HuH7 og PLC /PRF /5 blev behandlet med stigende koncentrationer af fruktose (EN). ATP-indholdet blev bestemt efter 30 minutter (A) eller ved varierende tidspunkter som angivet. Data er givet som gennemsnit ± SEM (n = 15). Leverens tumorcellelinjer blev behandlet med 1 ug /ml ActD i kombination med 100 ng /ml TNF og 50 mM fruktose som angivet. Cytotoksicitet bestemtes ved LDH-frigivelse-assay efter 24 timer (n = 15) (B). Data er afbildet som betyder fold ændringer ubehandlet kontrol bliver sat til 1.

Sammenligning af transkriptionelle niveauer af glycolytiske enzymer HKII, AldoB, og KHK, gennemsnitshøjden af ​​HKII transkription fandtes at øges i gennemsnit 34 gange i de humane lever tumorcellelinjer HepG2, Hep3B, HuH7 og PLC /PRF /5 i forhold til ikke-tumorform primære humane lever væv bliver normaliseret til faktor 1. derimod enzymer AldoB og KHK viste sig at være konstant eller faldt i de undersøgte tumorcellelinier (gennemsnitlig fold ændringer 1 i sammenligning med ikke-tumor-primære humane levervæv bliver normaliseret til faktor 1) som afbildet i tabel 1. den enzymatiske udstyr af tumorcellerne er yderst indikativ for HKII bypass omgå ATP synke aktiv i primære hepatocytter. Derfor findes der ingen ATP depletion var tydelig i nærvær af op til 50 mM fructose. Interessant fra et mekanistisk synspunkt i forudgående arbejde, det allerede er blevet påvist, at virkningerne af fruktose for ATP udtynding og TNF-induceret tumor celledød kan være “kunstigt” omvendt når primære murine hepatocytter, at være “naturligt” mangelfuld for HKII ligesom PHH blev gen suppleret med en vektor, der bærer det murine HKII genet [10]. I undersøgelsen af ​​Speicher

et

al

. blev det konstateret, at den fysiologiske fruktose /ATP fælde blev omgået (ligesom i lever tumorceller); som et resultat, beskyttelse stat “oprindelig” opnået i primære hepatocytter under fruktose lastning nu var tabt, gennemføre en groft forbedret følsomhed /toksicitet primære hepatocytter mod TNF-induceret apoptose [10].

Konklusioner

TNF udgør en meget potent antineoplastisk lægemiddel, som imidlertid hidtil ikke kan anvendes på patienter med primære og sekundære tumorer i leveren på grund af sin dybe hepatotoksicitet. For at overvinde denne hindring, det kombinatoriske anvendelse af fruktose

, som kan anvendes til at udnytte metaboliske forskelle udgør en selektiv beskyttelse af raske hepatocytter i retning TNF

synes at være en interessant terapeutisk mulighed. Baseret på vores resultater beskæftiger udelukkende humane primære hepatocytter og præcisions-cut skiver af raske levervæv

versus

maligne humane lever væv, synes det muligt, at fruktose-induceret udtømning af ATP udgør en generel måde at beskytte den menneskelige lever fra uønsket energi-afhængige celledød induceret af TNF i IHP-baserede lokale kræftbehandling hvorved følsomheden af ​​levertumorer i retning cytotoksiske behandlinger bevares.

Tak

forfatterne er taknemmelige for Christine Geisler, Igor Liebermann, Andrea Schenk og Irina Smirnow for fremragende teknisk bistand.