PLoS ONE: Sekventiel cisplatin Terapi og Vaccination med HPV16 E6E7L2 Fusion Protein i saponinadjuvans GPI-0100 til behandling af en model HPV16 + Cancer

Abstrakt

Kliniske undersøgelser tyder på, at reaktioner på HPV16 E6E7L2 fusionsprotein (TA-CIN) vaccination alene er beskedne, og GPI-0100 er en veltolereret, potent adjuvans. Her søgte vi at optimere både immunogenicitet TA-CIN via formulering med GPI-0100 og behandling af HPV16 + kræft ved vaccination efter cisplatin kemoterapi. HPV16 neutraliserende serum antistoftitere, CD4 + T-celle proliferative og E6 /E7-specifikke CD8 + T-celle responser blev signifikant forøget, når mus blev vaccineret subkutant (s.c.) eller intramuskulært (i.m.) med TA-CIN formuleret med GPI-0100. Vaccination blev testet for behandling af mus med syngene HPV16 E6 /E7 + tumorer (TC-1) enten i lungen eller subkutant. Mus behandlet med TA-CIN /GPI-0100 vaccination udviste robuste E7-specifikke CD8 + T-celle responser, der var forbundet med reduceret tumor byrde i lungerne, mens mus, der fik hver komponent alene svarede til kontroller. Da vaccination alene ikke var tilstrækkeligt for helbredelse, mus bærende subkutan TC-1 tumor blev først behandlet med to doser af cisplatin og derefter vaccineret. Vaccination med TA-CIN /GPI-0100 i.m. væsentlige forsinket vækst tumor og forlænget overlevelse efter cisplatin-behandling. Injektion af TA-CIN alene, men ikke GPI-0100, i tumoren (i.t.) var ligeledes virkningsfulde efter cisplatinbehandling, men musene til sidst bukkede under. Imidlertid blev tumorregression og forlænget remission observeret hos 80% af musene behandlet med cisplatin og derefter intratumoral TA-CIN /GPI-0100 vaccination. Disse mus udviste også robust E7-specifikke CD8 + T-celle og HPV16 neutraliserende antistofreaktioner. Således formulering af TA-CIN med GPI-0100 og intratumoral levering efter cisplatin behandling fremkalder potente terapeutiske respons i en musemodel af HPV 16 + kræft

Henvisning:. Peng S, Wang JW, Karanam B, Wang C, huh WK, Alvarez RD, et al. (2015) Sequential Cisplatin Terapi og Vaccination med HPV16 E6E7L2 Fusion Protein i saponinadjuvans GPI-0100 til behandling af en model HPV16 + Cancer. PLoS ONE 10 (1): e116389. doi: 10,1371 /journal.pone.0116389

Redaktør: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japan

Modtaget: August 15, 2014 Accepteret: 8. december 2014 Udgivet: 5 jan 2015

Copyright: © 2015 Peng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Undersøgelsen blev finansieret af tilskud fra V fundament (www.jimmyv.org) til SP og RBSR og Public Health Service (tilskud. nih.gov) giver P50 CA098252 til TCW, RO1 CA133749 til GHQ, og CA118790 at RBSR. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. RBSR er en opfinder af L2-relaterede patenter (US ansøgning 20090047301 Papillomavirus L2 N- Terminal Peptider til Induktion af Groft Cross-neutraliserende antistoffer og amerikanske ansøgning 20130177585 papillomavirus L2 N-terminale peptider til fremkaldelse af BREDT CROSS-neutraliserende antistoffer) licens til Shantha Biotechnics Ltd., GlaxoSmithKline, PaxVax, Inc. og Acambis, Inc. RBSR og TCW er grundlæggere af Papivax LLC og videnskabelige rådgivere for Papivax Biotech Inc. vilkårene i disse ordninger administreres af Johns Hopkins University i overensstemmelse med sin interessekonflikter politikker. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

“høj risiko” menneskelige papillomavirus (hrHPV) årsag 5,2% af alle kræfttilfælde på verdensplan [ ,,,0],1]. Mens vedvarende hrHPV infektion er en nødvendig årsag til kræft, er det store flertal af infektioner spontant ryddet af værten immunitet. Sekundær forebyggelse via cytologiske og HPV screening og interventionsprogrammer har reduceret byrden af ​​livmoderhalskræft med anslået 80% i de udviklede lande, og nu to forebyggende HPV-vacciner rettet mod de to mest udbredte af de 14 hrHPV typer, HPV 16 og HPV 18. HPV16 er genotypen stede i 50-60% af livmoderhalskræft, i 87% af HPV + svælg carcinomer [2], i 55% og 76% af HPV + invasive vaginal og vulva karcinomer [3], og i 73% af anal cancer [ ,,,0],4]. Den betydelige effekt og sikkerhed af licenserede HPV-vacciner til forebyggelse af nye HPV16 og HPV18 infektioner er veldokumenteret [5]. Men den beskyttelse, disse kommercielt tilgængelige vacciner er generelt med begrænsning [6], og vaccinationer desværre forblive lav i udviklingslandene. Vigtigere er, disse vacciner ikke har nogen terapeutisk aktivitet for de patienter med persisterende HPV-infektion og etablerede HPV associeret cervikal dysplasi [7], Terapeutisk HPV-vaccination har potentialet til at forøge effektiviteten af ​​konventionelle ikke-specifikke, kirurgiske og ablative behandlinger af høj kvalitet neoplasi, eller selv chemoradiation terapi af invasive HPV + cancere. Trods brugen af ​​cisplatin og /eller strålebehandling [8], de fem-års overlevelse af avancerede cervikal kræftpatienter forbliver 30%. Således målrettede behandlingsstrategier, såsom terapeutisk HPV-vaccination, der er nødvendige for at forbedre resultaterne i patienter med fremskreden livmoderhalskræft [9].

Den kandidat terapeutiske HPV-vaccinen TA-CIN er et rekombinant protein, der omfatter en fusion af HPV16 oncoproteiner E6, E7 og den mindre capsidprotein L2, der er oprenset fra

E. coli

[10]. E6 og E7 virale oncoproteiner er lovende mål for immunterapi, der udtrykkes i alle inficerede celler, der kræves for levedygtigheden af ​​HPV + cancerceller og fraværende fra normale værtsceller. Den mindre capsidprotein L2 er ikke detekterbart udtrykt i HPV + cancerceller, men det er en potentiel terapeutisk antigen til forstadielæsioner [11], [12], [13]. Endvidere indeholder L2 bevarede neutraliserende epitoper og har potentiale som en bredt profylaktisk HPV-antigen [14]. Tre månedlige immuniseringer af raske frivillige med TA-CIN uden adjuvans, fremkaldte et L2-specifikke neutraliserende serumantistoffer og T-celle-proliferative responser på en dosisafhængig måde [15]. E6 og E7-specifikke CD8 T-celle immunitet blev opdaget af IFNy ELISPOT i 8 ud af 11 evaluerbare fag på den højeste dosis, selvom E6 var den dominerende antigen. Men den samlede respons var beskeden, hvilket antyder behovet for en adjuvans [16], [17] eller heterolog boosting med en rekombinant viral vektor [18], [19], [20].

Protein-baserede vaccination uden en adjuvans inducerer typisk svage immunresponser. GPI-0100 er en kraftigt virkende adjuvans afledt ved modifikation udvalgte naturlige saponiner [21] for at fjerne relativt toksiske og ustabile acylgrupper, og indføre en lipofil del [22], [23]. Doser på 100 mg til 5000 ug af GPI-0100 er blevet testet med flere antigener i begyndelsen fase kliniske forsøg og var veltolereret [21], [24]. Vaccination af makakaber med TA-CIN i kombination med adjuvansen GPI-0100 (TA-CIN /GPI-0100) blev også veltolereret og fremkaldte robuste neutraliserende antistoftitere mod HPV16, med mindre responser mod andre HPV-typer testede og T-cellereaktioner til HPV16 E6 og E7 [16]. Formulering af TA-CIN med GPI-0100 dybt forbedret den neutraliserende antistof-respons og beskyttet mus fra eksperimentel hud udfordring med HPV16 pseudovirioner, der leverer en luciferase reporter. Inklusion af GPI-0100 forstærkede også E7-specifikke CD8 T-celle-respons på TA-CIN vaccination og beskyttede mus mod udfordring med TC-1-cellelinien, en HPV16 E6 /E7 + murine tumormodel [16]. Imidlertid blev den terapeutiske aktivitet mod etablerede tumor ikke testet.

Nylige undersøgelser tyder på, at lokal immunisering er vigtigt at fremkalde et cellulært immunrespons, at boliger tilbage til det pågældende sted, og at kemoterapi kan øge immunresponset delvist af skrumpende sygdomsbyrde, frigiver tumorantigener og forbigående modificere immun mikromiljø inden tumoren [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31]. Behandling med cisplatin og /eller lavdosisstråling kan forbedre styrken af ​​terapeutiske HPV-vacciner i musemodeller [32], [33], [34]. Samtidig behandling med cisplatin og intratumoral injektion (det) af E7-peptid i C57BL /6-mus med E6 /E7-udtrykkende TC-1 tumorer genererede væsentligt mere E7-specifik IFN-γ-udskillende CD8

+ T-celler og kunne helbrede mange mus, hvorimod de behandlet med enten behandling alene ikke generere lignende kontrol tumorvækst. Vigtigere, subkutan indgivelse af E7-peptid kontrolleret tumorvækst mindre effektivt end intratumoral administration, hvilket indikerer, at levering af antigen i tumoren mikromiljø forbedrer priming af et tumorantigen-specifik CD8 + T-celle-immunreaktion efter kemoterapi [34]. Cisplatinbehandling også transient inducerede en signifikant akkumulering af dendritiske celler (DC’er) i tumormikromiljøet. Endvidere intratumoral injektion af antigene peptid førte til optagelsen af ​​E7-peptidet af CD11c + DC’er og migration af E7 peptidbelastede DC’er til de drænende lymfeknuder [34]. E7 peptidbelastede DC’er i drænende lymfeknude kunne aktivere E7-specifikke CD8 + T-celler. Vigtigt er det, dette markerede forbedring af E7-specifikke CD8 + T-celler i omløb og antitumorvirkninger blev også observeret, når TC-1 tumor-bærende mus blev behandlet med cisplatin og intratumoral TA-CIN vaccination [35].

Vores tidligere studier i mus og makakaber understøtte sikkerheden og styrken af ​​GPI-0100 som en adjuvans for TA-CIN, men undersøgte ikke dens indvirkning på terapeutiske aktivitet [16]. Her sammenlignet vi vaccination alene og cisplatin efterfulgt af intratumoral eller intramuskulær vaccination TA-CIN formuleret med GPI-0100 adjuvans til behandling af etablerede TC-1 tumorer.

Materialer og metoder

Etik Statement

Den humane cellelinie 293TT anvendes i denne undersøgelse. Denne cellelinie er tidligere blevet beskrevet [37], [38]. Dyreforsøg blev gennemført i overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health og med forudgående godkendelse af Animal Care og brug Udvalg Johns Hopkins University (MO14M43). Mus blev overvåget mindst tre gange om ugen, og humane endepunkter blev anvendt i overlevelse undersøgelser; mus blev aflivet på overskydende tumor byrde (≥2 cm diameter eller ulceration), eller første tegn på nød, såsom vægttab (≥10%), sløvhed, dårlig pelskvalitet, lysfølsomhed, nesting eller ridser. Mus blev bedøvet med isofluran inhalering, aflivet ved carbondioxid-kvælning og død sikres ved cervikal dislokation.

Mus

5~8 uger gamle C57BL /6 eller BALB /c-mus blev indkøbt fra national Cancer Institute (Frederick, MD) og huset i mindst en uge før studere. Alle mus blev fastholdt på Johns Hopkins University School of Medicine (Baltimore, MD) kræft center dyr facilitet under specifik-patogenfrie betingelser. Musene blev opretholdt 5 pr microisolator bur med sterilt foder og strøelse, skiftes ugentligt, og randomiseret ved buret.

peptider, antistoffer og reagenser

H-2K

b-begrænset HPV 16 E6aa50-57 peptid, YDFAFRDL, og H-2D

b-begrænset HPV16 E7aa49-57 peptid RAHYNIVTF blev syntetiseret ved Makromolekylær Resources (Denver, CO) ved en renhed på ≥80%. FITC eller PE-konjugeret anti-muse CD4 (klon RM4-5) og CD8a (klon 53.6.7), og FITC-konjugeret anti-muse IFN-γ (klon XMG1.2) antistoffer blev indkøbt fra BD Pharmingen (San Diego, CA). PE-konjugeret, HPV 16 E7aa49-57 peptid indlæst H2-D

b tetramerer blev opnået fra National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme Tetramer Facility. Medroxyprogesteronacetat blev indkøbt fra Greenstone LLC (Peapack, NJ), og 4% nonoxynol-9 (N-9) blev købt fra Revive personlige produkter selskab (Madison, NJ). Cisplatin, Tween-40 og mannitol blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO).

Cells

HPV-16 E6 og E7-udtrykkende TC-1-celler blev dannet som beskrevet tidligere [ ,,,0],36]. CT26 coloncarcinomceller blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Cellerne blev holdt i RPMI-medium suppleret med 2 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 IU /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS). 293TT celler blev dyrket i DMEM-medium indeholdende 2 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 IU /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 10% FBS [37].

Vaccine og formulering

TA-CIN er blevet beskrevet tidligere og blev venligst stillet til rådighed af Cancer Research Technology, UK [15]. GPI-0100 var generøst tilvejebragt af Hawaii Biotech Inc. (Aiea, HI). Til undersøgelser vaccination, TA-CIN (31,25 ug /ml) blev formuleret med GPI-0100 (250 ug /ml), alene eller med enten Tween-40 (4 mg /ml), eller mannitol (50,7 mg /ml) i 0,025 M natriumphosphatpuffer (pH 7,2). Til fremstilling vaccine til intratumoral injektion, TA-CIN (312,5 ug /ml) blev formuleret med GPI-0100 (2500 ug /ml) sammen med mannitol (50,7 mg /ml) i 0,025 M natriumphosphatpuffer (pH 7,2). Den formulerede vaccine blev inkuberet natten over på en blid rysteapparat ved 4 ° C før brug. Det frosne formulering af TA-CIN /GPI-0100 omfattede mannitol, og efter inkubation natten over, blev det delt i portioner og fryses ved hjælp tøris /isopropanol. De prøver blev derefter opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse.

Produktion af HPV16 og HPV58 pseudovirus og neutraliseringsanalyse

Pseudoviruses (PSV) blev fremstillet ved co-transfektion af 293TT celler [37] , [38] med plasmider kodende HPV L1 og L2 og reporter plasmid, der udtrykker enten secerneret alkalisk phosphatase (SEAP) eller ildflueluciferase [39], [40]. SEAP-baserede pseudovirus neutraliseringsassays blev udført som tidligere [38] beskrevne. Kort fortalt blev HPV16 SEAP PSVS inkuberet med titreret musesera (startende fortynding 1:50) eller 4 pi positiv kontrol monoklonalt antistof RG-1 (1,1 mg /ml) i 2 timer ved 37 ° C før tilsætning til 293TT celler. Cellerne blev derefter inkuberet i 72 timer, og supernatanterne blev opsamlet. SEAP-aktivitet blev målt ved hjælp af kolorimetrisk assay-metoden. Serum neutralisationstitere blev defineret som den højeste fortynding, der resulterede i mindst 50% reduktion af SEAP aktivitet sammenlignet med virus kun infektion kontrol.

Intracellulær cytokin farvning og flowcytometri analyse

For at detektere HPV16 E6 eller E7-specifik CD8

+ T-celle-responser efter IFN-γ intracellulær farvning blev splenocytter stimuleret med enten HPV16 E6aa50-57 eller E7aa49-57 peptid (1 pg /ml) ved tilstedeværelse af GolgiPlug (BD Pharmingen, San Diego , CA) ved 37 ° C natten over. For at detektere TA-CIN-specifikke CD4

+ og CD8

+ T celle responser blev splenocytter stimuleret med 10 ug /ml TA-CIN-protein i 24 timer ved 37 ° C. GolgiPlug blev derefter tilsat til cellerne og inkuberet yderligere natten over ved 37 ° C. Når CT26-celler transficeret med HPV16 L2 blev anvendt, blev CT26-celler først transficeres med plasmid kodende codon-optimeret HPV16 L2 [41] under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Splenocytter blev derefter co-dyrket med HPV16 L2 transficerede CT26-celler med E:T forholdet 10:01 ved tilstedeværelsen af ​​GolgiPlug ved 37 ° C natten over. De stimulerede splenocytter blev derefter vasket en gang med PBS indeholdende 0,5% BSA og farvet med enten PE-konjugeret anti-muse CD4 eller CD8-antistof. Celler blev permeabiliseret og fikseret med Cytofix /Cytoperm Kit ifølge producentens anvisninger (BD Pharmingen, San Diego, CA). Intracellulær IFN-γ blev farvet med FITC-konjugeret rotte-antimuse-IFN-γ. Flowcytometri analyse blev udført ved hjælp af FACSCalibur flowcytometer med CellQuest software (BD Biosciences, Mountain View, CA).

Tetramerfarvning

For tetramerfarvning, PBMC’er fra musene blev farvet med renset anti- muse CD16 /32 (Fc-blok, BD Pharmingen, San Diego, CA) først, og derefter farvet med anti-muse CD8-FITC, PE-konjugeret, HPV16 E7aa49-57 peptid, RAHYNIVTF indlæst H2-D

b tetramer på 4 ° C. Efter vask blev cellerne farvet med 7-AAD før flowcytometrianalyse at udelukke døde celler. Cellerne blev erhvervet med FACSCalibur flowcytometer og analyseret med CellQuest software.

Passiv overførsel af mus eller macacque sera og vaginal HPV PSV udfordring

For passive transfer studier, grupper af BALB /c mus (n = 5) blev injiceret med 3 mg medroxyprogesteron subkutant fire dage før vaginal PSV udfordring. En dag før vaginal udfordring, 90 pi sera fra hver kontrol eller TA-CIN vaccineret BALB /c-mus blev samlet i deres respektive grupper med yderligere 150 pi PBS (samlet volumen 600 pi). Som en positiv kontrol blev musen monoklonale antistof RG-1 anvendes i tre separate doses- Høj (50 ug /mus), Medium (25 ug /mus) og Lav (12,5 ug /mus). Efterfølgende blev 100 pi af den respektive samlede sera eller RG-1 doser derefter injiceret i.p. i hver mus af den respektive gruppe. 24 timer efter passiv overførsel, blev vaginal udfordring med HPV PSV udført som tidligere beskrevet [42] under anvendelse af ~ 10

8 viral genomisk ækvivalent (VGE) enheder /mus. Tre dage efter HPV PSV udfordring blev ekspressionen af ​​luciferase i vaginal hvælving erhvervet med Xenogen IVIS 100 (Caliper Life Science, Hopkinton MA) imager og analyseret med Living Billede 2.5 software. blev udført de samme trin for passive overførsel forsøg med sera fra 3 makakaber (i.d 746, 811 eller 831) enten præ- eller post tredje vaccination med TA-CIN + GPI-0100 genereret i en forudgående undersøgelse [16]. 100 pi præ-immune sera (fortynding = 1:200, baseret på muse estimat af 2 ml blodvolumen) eller vaccineret sera blev titreret med flere fortyndinger af 1:200-1:2000 blev passivt overført i.p. i grupper af naive mus (n = 5). Den følgende dag blev musene inficeret intravaginalt med HPV58 PSV og afbildes 72 timer derefter at vurdere infektivitet.

Behandling studier af hematogeneosuly spread TC-1 tumorceller

C57BL /6-mus blev injiceret med 5 × 10

4 af TC-1 celler intravenøst. For at teste antitumorvirkning induceret af vaccination, 3 dage senere blev musene vaccineret tre gange med den angivne regimen. Når de ubehandlede mus viste tegn på sygdom (se etik statement) blev alle mus aflivet, og splenocytter blev forberedt til at detektere HPV 16 E6 eller E7 eller TA-CIN-specifikke CD4

+ og CD8

+ T-celle responser. Lunger blev høstet for at kontrollere tumorvækst. Alternativt blev PBMC’er og sera opsamlet fra musene for analysen af ​​HPV16 E7-specifikke CD8

+ T-celle-responser med tetramerfarvning eller HPV16-specifikt neutraliserende antistoftiter med HPV16-SEAP PSV henholdsvis.

Behandling studier af subkutan TC-1 tumor

1 × 10

5 af TC-1 tumorceller blev injiceret subkutant i C57BL /6-mus. På dag 5 og 12 efter tumorcelle udfordring blev mus injiceret med 5 mg /kg cisplatin eller saltvand intraperitonealt. En dag efter cisplatin eller saltvand injektion blev mus venstre enten ubehandlet eller vaccineret med kun GPI-0100, eller TA-CIN kun, eller TA-CIN plus GPI-0100 intratumoralt. En gruppe af cisplatin behandlede mus blev vaccineret med TA-CIN plus GPI-0100 intramuskulært. Et volumen på 200 pi blev anvendt til alle undersøgelser vaccination undtagen 20 pi til intratumor vaccination. Musene blev boostet to gange med den samme regimen. Tumorvækst blev overvåget ved visuel inspektion og måling af tumordiameteren med passere to gange om ugen. Tumor volumen blev beregnet ved hjælp af formlen [største diameter × (vinkelret diameter)

2] × π /6. Tumor overlevelse blev registreret som enten naturlig død eller en tumor diameter større end 2 cm.

Statistisk analyse

cellemedieret immunitet data blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). Sammenligninger mellem grupper udnyttet Students

t

test. Overlevelse fordelingerne for mus i forskellige grupper blev estimeret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og sammenlignes med log-rank test. For passive transfer forsøg blev data udtrykt som gennemsnitlige procentvise infektion ± standardafvigelse (SE). En p-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Mangfoldighed justering blev ikke anset på grund af den sonderende karakter af dataanalyse.

Resultater

GPI-0100 væsentligt forbedrer HPV16 E7-specifikke CD8 + T-celle responser og tumor terapi induceret af TA-CIN

Vi har tidligere påvist, at formuleringen af ​​TA-CIN med GPI-0100 forøger i høj grad både HPV16-specifikke neutraliserende serum antistoftitere og E7-specifikke CD8 + T celle responser til subkutan vaccination af naive mus [16]. For at teste, om forskellige batches af GPI-0100 og TA-CIN kan generere lignende data, vi vaccineret naive C57BL /6 mus med to forskellige cGMP batches af TA-CIN (0847FP og 0861FP) formuleret med tre forskellige cGMP batches af GPI-0100 ( 0400806, 0400306R og 0400106R) subkutant. Ingen signifikant forskel blev observeret for både HPV16-specifikt neutraliserende antistoftiter og E6 /E7-specifikke CD8 + T-cellereaktioner (data ikke vist). Da rute vaccination potentielt kan påvirke immunresponset sammenlignede vi også immunogeniciteten af ​​TA-CIN formuleret med GPI-0100, der blev givet ved enten subkutan (s.c.) eller intramuskulær injektion (i.m.). Ingen signifikant forskel blev observeret for enten HPV16-specifikt neutraliserende serum antistoftiter eller E6 /E7-specifikke CD8 + T-cellereaktioner (S1 Fig.).

I vores tidligere undersøgelse, vaccination med TA-CIN formuleret med GPI- 0100 helt beskyttede mus fra en efterfølgende subkutan udfordring med HPV16 E6 /E7-udtrykkende TC-1 tumor model [16], men behandling af allerede eksisterende og metastatisk TC-1 tumor blev ikke testet. Injektion af TC-1 celler i halevenen (i.v.) fører til deres etablering i lungerne, hvilket giver en model af pulmonal metastatisk HPV 16 + kræft [43]. Derfor testede vi, om formulering af TA-CIN med GPI-0100 påvirker terapeutisk virkning mod TC-1 tumor implantater i lungerne. De TC-1 tumorceller blev injiceret i halevenen på C57BL6-mus og 3 dage senere blev de tumorbærende mus vaccineret subkutant med enten en lav dosis (6,25 ug /mus) i TA-CIN alene eller formuleret med 50 ug GPI -0100, efterfulgt af to boostere på én uges intervaller. Lunger blev høstet ti dage senere at evaluere tumorvækst (fig. 1A). Hverken vaccination med TA-CIN alene eller GPI-0100 alene inhiberede TC-1 tumorvækst i lungerne. I modsætning hertil mus vaccineret med TA-CIN formuleret med GPI-0100 havde signifikant færre pulmonal tumorknuder og derfor en lavere lunge vægt sammenlignet med uvaccinerede mus (fig. 1B og C og S2A Fig.). Imidlertid blev tumorbelastning kun reduceret, ikke helt elimineret. Når HPV16 E6 /E7-specifikke CD8 + T-cellereaktioner blev analyseret, fandt vi, at TC-1 tumor-bærende mus vaccineret med TA-CIN formuleret med GPI-0100 induceret dramatisk højere E7-specifikke CD8 + T-celle-responser end enten TA-CIN eller GPI-0100 (fig. 1D og S2B fig.). Selvom TA-CIN også indeholder en E6 CD8 + T-celle-epitop, blev kun svage E6-specifikke CD8 + T-celle-responser observeret som E7 er den dominerende antigen i C57BL /6-mus (fig. 1D og S2B Fig.). Formulering med Tween-40 er blevet foreslået at øge hjælpende virkning GPI-0100 [44]. Men i overensstemmelse med vores tidligere resultater i naive mus [16], inddragelse af Tween-40 i TA-CIN /GPI-0100 formulering ikke signifikant indflydelse på anti-tumor effekt eller E6 /E7-specifikke CD8 + T-celle responser (fig. 1D og S2B fig.). Tilsammen disse data udvide vores tidligere fund, at GPI-0100 er i stand til markant at øge immunogenicitet TA-CIN herunder en E7-specifikke CD8 + T-celle respons og her viser sit potentiale til terapeutisk aktivitet mod HPV16-transformerede tumor i C57BL6 mus.

A. Skematisk illustration af eksperimentet design. Kort fortalt blev 5~8 uger gamle C57BL /6-mus (10 mus /gruppe) injiceret med 5 x 10

4 TC-1-celler intravenøst ​​på dag 0. På dag 3 blev musene vaccineret med enten 6,25 ug /mus TA-CIN, eller formuleret med 50 ug GPI-0100, eller formuleret med 50 ug GPI-0100 i 800 ug Tween-40 via subkutan injektion. Musene blev boostet to gange med den samme regimen. På dag 27 blev musene aflivet til høst lunger og milte. B. Sammendrag af antallet af TC-1 metastase knuder i lungerne hos hver mus (og fotografier af lungerne er vist i S2A Fig.). C. Resumé af vægten af ​​lungerne. D. Resumé af flowcytometrianalyse af HPV16 E6 og E7-specifikke CD8

+ T-cellereaktioner analyseret af IFN-γ intracellulær farvning. Dataene blev erhvervet med FACSCalibur, analyseret med CellQuest og repræsentative data er vist i S2B Fig.

immunogenicitet TA-CIN formuleret med GPI-0100 i mannitol og frosne

For nemheds skyld og forbedret stabilitet, er det potentielt gavnligt at formulere et stort parti af TA-CIN /GPI-0100 vaccine og prøve det i engangsprodukter doser, kan fryses til langtidsopbevaring. På grund af sin dodecylgruppe, GPI-0100 er mere hydrofob end dens

Quillaja

saponin precursor og undgåelse af puffere med høj ionstyrke og formulering i 5% (isotonisk) mannitol er fordelagtig. Derfor har vi formuleret TA-CIN med GPI-0100 ved at blande det natten over i 5% mannitol løsning. Doser blev frosset og opbevaret ved -80 ° C indtil brug til indgivelse. For at teste, om en enkelt fryse /tø cyklus virkninger immunresponset, vi vaccineret naive BALB /c mus med enten frisk formuleret TA-CIN /GPI-0100, eller TA-CIN formuleret med GPI-0100 i 5% mannitol og nedfrosset til – 80 ° C til opbevaring indtil anvendelse. Musene blev boostet to gange som angivet i fig. 2A. To uger efter den sidste vaccination blev splenocyter og sera høstet til påvisning HPV16-specifikke T-celler (FIG. 2B-D, S3A og C Fig.) Og neutraliserende antistof (fig. 2E) hhv. Vaccination med TA-CIN /GPI-0100 inducerede en neutraliserende antistofrespons mod HPV 16, mens TA-CIN alene eller GPI-0100 ikke udløse en påviselig (titer ≥50) neutraliserende antistofrespons mod HPV 16 (fig. 2E). Med hensyn til cellulær immunitet, vaccination med TA-CIN alene var i stand til at generere både TA-CIN-specifikke CD4

+ og CD8

+ T celle responser (fig. 2B-D, S3A og C Fig.). Men formulere TA-CIN med GPI-0100 stærkt forbedret begge disse T-celle responser, især TA-CIN-specifikke CD4

+ T-celle responser ved 7-fold (Fig. 2B, S3A og C Fig.). Denne CD4

+ T-celle respons er i det mindste delvis L2-specifik, da HPV16 L2, men ikke mock-transficerede, CT26-celler var i stand til at aktivere CD4

+ T-celler fra vaccinerede mus til at producere IFN-γ (fig. 2C, S3B fig.). Vi testede også, om der er CD4 + T-celle respons mod HPV16 E7 ved anvendelse af et peptid, som indeholder et tidligere rapporteret CD4 T-celleepitop [45] og fandt intet påviseligt respons (S4 Fig.). Vigtigere, mus vaccineret med TA-CIN formuleret med GPI-0100 i mannitol-opløsning og opbevaret ved -80 ° C genereret lignende TA-CIN-specifikke CD4

+, CD8

+ T-celle og HPV16-specifikke neutraliserende antistofreaktioner til frisk formuleret TA-CIN med GPI-0100 (fig. 2). Disse data antyder, at TA-CIN formuleret med GPI-0100 i mannitol opløsning kan fryses og opbevares ved -80 ° C i en længere periode (styrke blev bibeholdt efter 11 måneders opbevaring, den længste testet til dato tid), uden at dens immunogenicitet .

A. Skematisk illustration af forsøgsprotokollen. Kort beskrevet 5~8 uger gamle BALB /c-mus (5 mus /gruppe) vaccineret subkutant med enten 6,25 ug /mus af TA-CIN, eller formuleret med 50 ug GPI-0100, eller formuleret med 50 ug GPI-0100 i 50,7 mg /ml mannitol og underkastes en enkelt fryse /tø-cyklus. Musene blev boostet to gange med den samme regimen med 2 ugers mellemrum. To uger efter den sidste vaccination blev sera og splenocytter høstet. B. Sammendrag af flowcytometrisk analyse af TA-CIN-specifikke CD4

+ T-cellereaktioner analyseret af IFN-γ intracellulær farvning (og repræsentative data er vist i S3A Fig.). C. Sammendrag af flowcytometrianalyse undersøge HPV16-specifikke CD4

+ T celle responser induceret af TA-CIN formuleret med GPI-0100 i mannitol og frosset /tøet en gang. Splenocytter blev høstet efter vaccination og stimuleret med enten TA-CIN eller HPV 16 L2 transficerede CT26-celler (og repræsentative data er vist i S3B Fig.). D. Resumé af flowcytometrianalyse af TA-CIN-specifikke CD8

+ T-cellereaktioner analyseret af IFN-γ intracellulær farvning. Dataene blev erhvervet med FACSCalibur og analyseret med CellQuest (og repræsentative data er vist i S3C Fig.). E. Resumé af HPV 16 L2-specifikke neutraliserende antistoftiter analyseret med HPV16-SEAP pseudovirus baseret neutraliseringsanalyse.

For yderligere at teste, om den frosne formulering bibeholder immunogenicitet efter en enkelt fryse /tø cyklus C57BL /6 mus med TC-1 tumor i lungerne blev administreret enten TA-CIN frisk formuleret med GPI-0100, eller TA-CIN formuleret med GPI-0100 i mannitol opløsning, opbevaret ved -80 ° C og optøet umiddelbart før anvendelse. Musene blev boostet to gange som angivet i fig. 3A, og 4 dage efter sidste vaccination, lunger og splenocytter blev høstet til påvisning af tumorvækst og T-celle responser. Som vist i fig. 3B, C og S5A Fig.), Mus behandlet med GPI-0100 alene inhiberede ikke TC-1 tumorvækst og mus vaccineret med TA-CIN alene viste en svag antitumorvirkning sammenlignet med ubehandlede mus. I modsætning hertil mus vaccineret med TA-CIN /GPI-0100 stærkt hæmmet tumorvækst i forhold til TA-CIN eller GPI-0100 alene behandlede mus, og svaret var ens i de ferske og frosne /optøede formuleringer. Næste vi analyserede CD8

+ T-cellereaktioner mod HPV16 E6 /E7 fremkaldt af vaccination (fig. 4A og S5B Fig.). Ingen af ​​grupperne udviste signifikante E6-specifikke CD8

+ T-cellereaktioner. TA-CIN vaccinerede mus genererede svage E7-specifikke CD8

+ T-cellereaktioner (0,074 ± 0,065% i forhold til 0,013 ± 0,008% i ubehandlede og 0,027 ± 0,024% af GPI-0100 behandlet). I modsætning hertil mus vaccineret med frisk formuleret TA-CIN /GPI-0100 genererede 25 gange mere (1,888 ± 1,679%, p = 0,003) og frosne formulering genereret 27 gange mere (2.049 ± 2.078%, p = 0,008) E7- specifikke CD8

+ T-celler. E7-specifikke CD8

+ T-celler genereret af friske eller frosne formulering af TA-CIN /GPI-0100 var sammenlignelige (p = 0,851).

A. Skematisk illustration af forsøgsprotokollen. Kort fortalt blev 5~8 uger gamle C57BL /6-mus (10 mus /gruppe) injiceret med 5 x 10

4 TC-1-celler intravenøst ​​på dag 0. På dag 3 blev musene vaccineret s.c. med enten 6,25 ug /mus af TA-CIN, eller formuleret med 50 ug GPI-0100, eller formuleret med 50 ug GPI-0100 i 50,7 mg /ml mannitol og frosset /tøet en gang. Musene blev boostet to gange med den samme regimen med 1-ugers interval. Som vist i fig. Som vist i fig. 2A.